沙棘Dof基因家族的全基因組鑒定及表達分析

中圖分類號：S718.46 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2025）03-0039-12

DOI：10.12403/j.1001-1498.20240327

沙棘（HippophaeL.）為胡頹子科沙棘屬的多年生灌木或小喬木，具有抗旱、耐鹽堿等特性，是重要的生態(tài)治理先鋒樹種和木本油料作物。沙棘油主要從果肉或種子中提取，其含有多種對人體有益的生物活性成分，尤其，沙棘果油的棕櫚油酸含量高達 43% ，它在防治心腦血管疾病、改善皮膚狀況等方面具有明顯作用[1。大多數(shù)植物油以三酰甘油（triacylglycerol，TAG）的形式存在，其生物合成主要包括在質(zhì)體內(nèi)的脂肪酸從頭合成和2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的TAG組裝，整個過程涉及多個亞細胞器（質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）和酶促反應2。Yang等發(fā)現(xiàn)植物發(fā)育信號通過影響LAFL網(wǎng)絡（包括LEC1、LEC2、ABSCISICACIDINSENSITIVE3（ABI3）和FUSCA3（FUS3））、WRI1與互作因子，以及其他轉(zhuǎn)錄因子，進而調(diào)控植物油脂生物合成途徑[3]。轉(zhuǎn)化大豆（GlycinemaxL.）GmDof11基因，可使萊茵衣藻菌株（Chlamydomonasreinhardtii）在無硫和無氮培養(yǎng)基中的總脂肪酸含量分別增加到2.6倍（ 15.58% ）和2.7倍（ 17.02% ）[4]。大豆Leafy Cotyledon2（LEC2）

和牡丹Wrinkled1（WRI1）靶向乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoAcarboxylase，ACC）基因調(diào)控油脂和脂肪酸合成積累功能[5-，盡管已有以上研究等說明轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控部分植物的油脂合成，但有關(guān)沙棘果肉油脂合成的轉(zhuǎn)錄因子研究相對較少。

Dof是具有高度保守的鋅指基序的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物代謝調(diào)節(jié)、生長發(fā)育[]、逆境響應[9]、光響應和種子萌發(fā)[10]等。在擬南芥（ArabidopsisthalianaL.）中過表達水稻（OryzasativaL.）的OsDof25基因可改變其碳氮代謝，進而導致氨基酸濃度升高[111；修飾水稻OsDof23啟動子區(qū)域的染色質(zhì)的拓撲結(jié)構(gòu)域，可參與調(diào)控水稻苗期和開花期的代謝活動[12]；另外，Dof轉(zhuǎn)錄因子在植物油脂合成積累過程中也具有重要作用，如大豆GmDof4和GmDof11可分別激活乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoAcarboxylase，ACCase）和長鏈脂酰輔酶A合成酶（long-chainacyl-CoAsynthetase，LACS）基因表達，從而提高轉(zhuǎn)化擬南芥種子脂肪酸和油脂含量[13]。轉(zhuǎn)化GmDof4基因的橢圓小球藻（ChlorellaellipsoideaL.）油脂含量提高 46.4%～52.9%^14] ?？梢姡珼of轉(zhuǎn)錄因子對植物油脂合成和生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。但是，關(guān)于Dof轉(zhuǎn)錄因子對沙棘果肉（非種子組織）油脂合成積累的調(diào)控機制研究卻未見報道。本研究旨在分析沙棘Dof家族成員蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、順式作用元件、系統(tǒng)發(fā)育樹及果肉發(fā)育期間Dof基因表達與含油率的關(guān)系，以期為深人解析沙棘Dof基因調(diào)控油脂合成積累機理提供科學依據(jù)。

材料與方法

1.1 試驗材料

選用遼寧朝陽（CY1、CY2、CY3、CY4、CY5、CY6、CY7、CY8、CY9、CY10、CY11、CY12）的沙棘種質(zhì)：蒙古沙棘亞種（Hippophaerhamnoidessubsp.mongolica）為植物材料，分別于2022年6月（綠色果實，G）和7月（橙色果實，O）收集2個發(fā)育時期的果實（無病蟲害或機械損傷），采摘后立即液氮保存?zhèn)溆?，將去除種子的果肉用于絕對定量轉(zhuǎn)錄組測序和含油率測定。

1.2 方法

1.2.1 沙棘Dof基因家族成員獲取與鑒定依據(jù)實驗室自測所得蒙古沙棘亞種全基因組數(shù)據(jù)，獲取Dof基因家族氨基酸序列。利用Dockerdesktop軟件下載基因家族分析鏡像和擬南芥基因組信息，建立物種特異HMM模型[15]。篩選提取HMM結(jié)果文件并進行重新篩選，提取結(jié)構(gòu)域序列、蛋白全長、CDS全長，用于后續(xù)分析[16]

基于沙棘基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，參照Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）中的沙棘Dof基因，在HMMER程序中初步確定疑似Dof結(jié)構(gòu)域的蛋白序列[17]。利用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）和SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）確定含有Dof結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。使用Expasy（https：//www.expasy.org/resources/protparam）和WoLFPSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）獲取Dof基因家族的基本特征[18]

1.2.2沙棘Dof基因家族系統(tǒng)發(fā)育及保守基序分析利用MEGA軟件通過鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用1000次重復的自舉法對構(gòu)建進化樹的可靠性進行測試，使用iTOL在線軟件（iTOL：InteractiveTreeOfLife（embl.de））對系統(tǒng)發(fā)育樹進行修改[19]

通過 MEME（http：//meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi）在線軟件對HrDof的保守基序進行分析，設(shè)置Motif最大檢索數(shù)量為11，其余參數(shù)為默認。然后使用Tbtools（http：//www.tbtools.com/）軟件進行繪圖[20]

1.2.3沙棘Dof基因家族的結(jié)構(gòu)及啟動子序列分析利用GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）在線軟件對HrDof基因家族的內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)進行了預測并進行可視化[21]。選取沙棘HrDof基因起始密碼子上游2000bp序列作為啟動子區(qū)域，將序列提交到PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.gent.e/eboolslantcare/html）在線軟件，分析HrDof基因家族啟動子區(qū)順式作用元件[22]

1.2.4沙棘果肉HrDof基因表達量分析將沙棘樣品進行絕對定量轉(zhuǎn)錄組測序（UMIRNA-seq），即在文庫擴增前將每條cDNA整合唯一身份標簽（UniqueIdentifier，UID）。通過這種方法可以在數(shù)據(jù)質(zhì)控后，使用Seqhealth公司kcUID軟件對同UID下相似reads合并，達到糾錯和去除重復目的，進而獲得準確的分子序列和表達量。具體kcUID處理數(shù)據(jù)方法如下：根據(jù)UID文庫建庫方法，識別并提取reads中的UID序列；把相同UID序列的reads作為1個聚類，在每個聚類中，計算reads序列差異，并將相似reads（差異閾值為5nt）再次聚類后，得到亞聚類，并再次進行reads序列比對；將重復reads歸為1條一致性序列；如在PCR或測序過程中也進行相同一致性UID序列比對，將差異低于閾值1nt的UID合并，達到糾錯UID的目的，從而獲得準確數(shù)據(jù)，絕對定量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)與qRT-PCR驗證的相關(guān)性在 80% 以上[23]。基于測序數(shù)據(jù)，使用Bowtie2將每個樣本的Reads與組裝好的參考轉(zhuǎn)錄組進行比[24]，鑒定不同表達水平的基因，并使用如下算法對其進行優(yōu)化：以每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)（Reads perKilobase perMillionReads，RPKM）作為基因表達量的衡量指標[25]。利用Tbtools（http：//www.tbtools.com/）軟件繪制熱圖。

1.2.5沙棘果肉含油率測定利用前期優(yōu)化的含油率測定方法[26]，將約 200mg 沙棘果肉干燥粉末加入到 10mL 有蓋離心管中，加入 1mL 甲醇漩渦混勻 1min ，后加入 2mL 氯仿漩渦混勻 2min ，超聲波處理 30min 后離心。取上清液到新的 10mL 離心管中，向殘渣中再加入 2mL 氯仿甲醇溶液（ 2：1 ，VV），再次混勻2min，離心后取上清液到上述 10mL 離心管。向合并的上清液中加入1/4體積的 0.88% （WV）KCI溶液（約 1.2mL ），充分混勻，靜置 30min ，離心加速分層。收集下層液到已知質(zhì)量的玻璃樣品瓶中，放在通風櫥中，揮發(fā)至質(zhì)量恒定，設(shè)3次重復。使用SPSS軟件，將篩選所得HrDof1.2基因表達量與含油率（ ^∣R∣ 進行皮爾遜相關(guān)性分析及獨立性 t 檢驗。

R=（m₁-m₂）/m₀×100%

式中： R 為含油率； m₁ 為油脂和玻璃樣品瓶的質(zhì)量； m₂ 為玻璃樣品瓶的質(zhì)量； m₀ 為干燥樣品粉末的確切質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘Dof基因家族成員鑒定與系統(tǒng)進化分析

將擬南芥Dof基因家族成員和實驗室自測獲得的沙棘基因組數(shù)據(jù)進行比對，從測序結(jié)果中篩選出47個Dof基因家族成員（表1）。為進一步探索沙棘Dof基因家族成員與其他物種參與調(diào)控植物油脂合成的相關(guān)Dof之間的進化關(guān)系，將沙棘的47個Dof家族成員和油料作物大豆的Dof蛋白進行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

圖1進化樹結(jié)果顯示，分成3個亞家族，沙棘Dof家族物種內(nèi)親緣關(guān)系有一定距離，其中沙棘Hic_asm_14.1213與大豆NP001236530.2（Dof4）屬同支且同一亞家族，具有較近的親緣關(guān)系；Hic_asm_12.3128（HrDof1.2）與大豆NP001236626.1（Dof11）同屬一亞家族分支。大豆Dof4、Dof11能夠參與調(diào)控種子油脂合成過程，促進種子脂肪酸合成，提高種子油含量[13.27]，同一分支的基因在功能上具有同源性和相似性，可預測本系統(tǒng)發(fā)育樹中的同支基因也參與油脂合成。

2.2 沙棘Dof基因家族結(jié)構(gòu)域分析

通過在線網(wǎng)站GSDS分析發(fā)現(xiàn)18個Hic_asm_基因沒有內(nèi)含子，25個基因有1個內(nèi)含子，3個基因有2個內(nèi)含子，只有Hic_asm_3.7300有3個內(nèi)含子。Hic_asm_18.1490、Hic_asm_22.7150、Hic_asm_3.7300、Hic_asm_6.1614沒有非翻譯區(qū)，而其他群組大多在CDS序列的前端和末端都含有非翻譯區(qū)（圖2）；Hic_asm_10.1839、Hic_asm_16.672、Hic_asm_3.7300、Hic_asm_6.1614序列在分析時發(fā)現(xiàn)含有較長的未知序列，這可能由于基因組組裝注釋時將部分其他基因的序列注釋到這一基因上。分析沙棘基因家族所有成員的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)Dof家族幾乎所有成員都含有Motif1另外多數(shù)成員也包含Motif5、Motif8、Motif10（圖3、表2）。

2.3 沙棘Dof基因順式作用元件預測

利用PlantCARE在線分析軟件在沙棘Dof基因前2000bp中發(fā)現(xiàn)多種順式作用元件，包括脫落酸響應元件、茉莉酸甲酯作用元件、光響應元件、茉莉酸響應元件、機械傷害反應元件、胚乳發(fā)育元件（圖4），其中包括機械傷害反應元件WUN-motif；激素調(diào)節(jié)元件ABRE；水楊酸反應元件CGTCA-MOTIF[28]；光響應元件，如BOX4、G-BOX、GT1-MOTIF、GATA-MOTIF、I-boX等；強效響應元件，如干旱強效響應元件MBS、低溫強效響應元件LTR、厭氧強效相關(guān)元件ARE；以及O2-SITE、CAT-BOX等生理響應元件。

2.4 沙棘Dof家族基因染色體定位分析

根據(jù)染色體定位分析，沙棘12條染色體中分布了47個HrDof基因，第5、6條染色體上分別只有1個HrDof基因的分布，其他染色體上的基因數(shù)量各不相同，其中第7號染色體含基因數(shù)量最多，為7個。部分染色體的末端呈簇狀分布，分布較為密集（圖5）。

2.5 沙棘Dof基因家族的表達量分析

基于沙棘全基因組數(shù)據(jù)和12個不同沙棘種質(zhì)果肉發(fā)育期間的絕對定量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到在果肉兩個時期中保持特異高表達的HrDof1.2（Hic_asm_12.3128）基因（圖6A、B），通過比較分析HrDof1.2基因表達量，發(fā)現(xiàn)其在橙色（O）果實時期的表達量高于綠色（G）果實時期（圖7A），與此同時，O時期果肉含油率也明顯高于G時期（圖7B）。HrDof1.2在12個沙棘種質(zhì)中的基因表達量和果肉含油率的皮爾遜相關(guān)系數(shù)表明，二者極顯著相關(guān)（ Plt;0.01 ）（表3）。

3 討論

Dof類轉(zhuǎn)錄因子是植物發(fā)育過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。本研究發(fā)現(xiàn)沙棘47個HrDof的親緣關(guān)系有一定距離，Hic_asm_12.3128（HrDof1.2）與大豆Dof11、Hic_asm_14.1213與大豆Dof4有較近親緣關(guān)系。順式作用元件分析預測Dof有多種順式作用元件，如脫落酸響應元件、茉莉酸甲酯作用元件、光響應元件、茉莉酸響應元件、機械傷害反應元件、胚乳發(fā)育元件等，與趙秋竹等[29]對Dof研究一致，Dof在沙棘油脂合成、強迫反應、激素調(diào)節(jié)和光周期調(diào)控等方面扮演著重要的角色。

研究發(fā)現(xiàn)，Dof在大豆、油菜等植物油脂合成過程中也具有重要調(diào)控作用，但其在沙棘生長發(fā)育和油脂合成過程中的作用卻未見報道。例如，大豆GmDof4和GmDof11可靶向結(jié)合ACC和ACS基因啟動子區(qū)域的AAAG基序上，異源表達大豆GmDof4與GmDof11基因的擬南芥種子含油率提高了 4.7%～9.1% ，脂肪酸含量和種子千粒質(zhì)量也分別提高了 11%～24% 和 15.8%～27.3% ，均顯著高于野生型[30]；此外，大豆GmDof4和GmDof11還可分別靶向激活FAB2和抑制FAD2基因表達，使轉(zhuǎn)化油菜種子油酸含量從 62.8% 上升至67.11%～71.32%^[31] 。過表達萊茵衣藻CrDof基因可激活ACC、FATA、MGD1、DGD1和PGP1基因表達，且抑制ACS和CIS表達，進而使其油脂含量增加了 82.77μg?mg^-1 （ 69.89% ，脂肪酸含量增加了 83.09μg?mg^-1 （ 70.24% ）[32]。本研究對12個沙棘種質(zhì)的果肉進行絕對定量轉(zhuǎn)錄組測序和含油率分析，挖掘到1個在果肉發(fā)育期間特異高表達的HrDof1.2基因（圖6），它不僅與大豆

Dof11基因在進化樹中同一亞家族同支，在O時期的表達量和含油率也明顯高于G時期（圖7），皮爾遜相關(guān)系數(shù)顯示沙棘果肉的HrDof1.2基因表達量與含油率顯著相關(guān)（表3）。可見，HrDof1.2基因表達與沙棘果肉含油率密切相關(guān)，對深入研究HrDof1.2基因?qū)馕錾臣庥椭铣煞e累機制具有重要意義。

4結(jié)論

本研究在沙棘基因組中鑒定到47個Dof家族成員，分為3個亞家族。沙棘HrDof1.2基因與大豆Dof11基因同屬一進化樹分支，親緣關(guān)系近，且與沙棘果肉含油率密切相關(guān)。研究結(jié)果有助于未來深入解析沙棘Dof基因調(diào)控油脂合成積累機理

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ldentification and Expression Analysis of the Sea Buckthorn Dof Gene Family in the Whole Genome

LUMei，DINGJian1，LUOHong-mei2，HAILu2，ZHANGBin？

（1.InstituteofPlntResources，DalanMinzuUniversityDalian166o，Liaoning，China;2.ExperimentalCenterofsert Forestry，CAF Dengkou，Bayannur O15200，Inner Mongolia，China;3.International Seabuckthorn Association，Beijing 100038，China）

Abstract：[Objective]To ldentify Dof （DNA binding withone finger） gene familymembers in Mongolian SeaBuckthorn （Hippophae rhamnoidessubsp.mongolica）and Explore Key Dof Genes regulating oil synthesisandaccumulationin fruitflesh[Methods]Bioinformaticsapproacheswereused to identifytheDof gene family members in the sea buckthorn genome，follwed bya systematic analysis of their protein domains，conserved motifs，cis-regulatoryelements，and phylogenetic relationships.Absolute quantification transcriptome sequencing （Unique Molecular Identifier RNA-seq， UMI RNA-seq） was performed on the fruit fleshof 12sea buckthorn germplasm lines.Keycandidate Dof genes were identified based on the expression levelsof Doffamilymembersand theoil contentinthe fruit flesh.[Results]Atotal of47 Dof members were identified in the sea buckthorn genome，unevenly distributed across 12 chromosomes.Ten motifs were identified，withcis-regulatoryelementsrelated toplantoil synthesisanddevelopment.TheDof gene family was clasified into three subfamilies，and phylogeneticanalysis revealed that somesea buckthorn Dofs were closely related to the Dofs regulating oil synthesis in soybean （NP001236530.2， NP001315363.1）. UMl RNA-seq analysis of the fruit flesh during different developmental stages of the sea buckthorn germplasmsshowed that the expressionof HrDof1.2（Hic_asm_12.3128） gene during the orange fruit stagewas significantly higher than in the green fruit stage，and wasclosely correlated with the variation inoil content in the coresponding germplasms.[Conclusion] Membersof the sea buckthorn Dof gene familyare involved inoil synthesisanddevelopment.Theexpression of the HrDof1.2 gene is closely relatedtotheoilcontent inthefruitflesh，providing ascientificbasis forfurtherelucidationof theregulatorymechanism of oil synthesis and accumulation by Dof genes in sea buckthorn.

Keywords：sea buckthorn;dof; gene family; oil synthesis; expressionanalysis

（責任編輯：張研）