PbCYP86A1/B1調(diào)控梨果皮褐色形成的機制研究

中圖分類號 S661.2 文獻標(biāo)識碼A

文章編號 0517-6611（2025）11-0079-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.11.018

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on theMechanism of PbCYP86A1/B1 Regulating the Formation of PearPeel Brown Color

LIFei，JIANGPing，HNGWei（1.ChzhouAgriculturalandRuralTechnologyCnter，Chuzhou，Anui2390O;2.AnuiAgiculural

University，Hefei，Anhui ） AbstractObjetie]ThereltioshipbetweenPCYP86A1，PCY86B1genesandpearplbrowntraitswasexplored.MethodThePbCYP86A1/B1genewasclonedfromthepelof“Dangshansu”pearand“Dangshanjinsu”pearbyreverse ranscriptionpolymerasechainreaction（RT-PCR）.Thevirus-inducedgenesilencing（VIGS）methodwasusedtosilencethetargetgeneusingthetobacocrispycrackvirus （TRV）vector.Byanalyzing thecontrol group（TRV2-TRV1）andthe experimental group（TRV-PbCYP86A1，TRV-PbCYP86B1）pearpericarppheotyptomaticatiolatiexpressonoftgenedangsinompositioftesberin.Resultsuls showedthatafterTRV-PbCYP86AlandTV-PbCYP86Blwereinjectedintothepearepidemis，suberinintheinjectionpartscouldnotbe accumulatedwittfrutdvelopntadidihelowgreetcoldierebeweeneijeonsitendesurronger icarpwassignificantlygreatertantatoftecontrloup.-PCRidcatedthatthxpressosofYP86A1andPCYP86Bgeesre ducedsignfcantlywithsignifcantdierenceintheexocarof‘Xiusu’pearwithVIGScomparedihontrol.Conlusion]eresultsofsuberincontentanalysisshowdthatbothPCP86AlandPCYP86BgensilencingcouldsignificantlyihibithsynthesisofC6doy fatty acids and -diacid in pear pericarp，which will reduce the total amount of suberin.

Key WordsPear; PbCYP86A1 gene; PbCYP86B1 gene;Suberin; Virus induced gene silencing

“碭山酥梨”（Pyrusbretschneidericv.‘Dangshansuli’），屬于薔薇科白梨系統(tǒng)，黃綠色表皮，但其芽變品系“碭山金酥”呈褐色，通過分子標(biāo)記確定為遺傳性變異[1]。研究表明，梨果皮褐色的形成關(guān)鍵在于木栓層，梨果皮變褐色是由于表皮和角質(zhì)層細胞破損后木栓質(zhì)從果皮木栓層開始累積，非色素的變化所致，且是由果點擴增到整個果面[2-3]。果實發(fā)育到一定階段后，果實表面與果皮的氣孔（果點）周圍木栓層的聚集及聚集的多少決定著果實色澤是褐色、綠色或是中間色。因此，梨果皮表面木栓層的研究才是揭示褐皮梨形成原因的關(guān)鍵[4]。木栓質(zhì)是一種脂質(zhì)材料，存在于植物內(nèi)皮層凱氏帶和大多數(shù)植物的細胞壁中。木栓質(zhì)是一種以長鏈脂肪酸和芳香族化合物組成的多聚物，包括與細胞壁相關(guān)的脂肪類物質(zhì)、多芳香類和部分蠟質(zhì)。木栓質(zhì)合成的初始物是短鏈脂肪酸和酚類物質(zhì)[5-6]。一段時間后，長鏈脂肪酸的含量持續(xù)增加。在木栓質(zhì)的合成過程中，脂肪酸首先經(jīng)過 ω- 氧化途徑形成 ω -羥基酸和a，ω-二酸[6-7]。脂肪酸的羥基化通常由NADPH依賴性細胞色素單加氧酶P450催化，尤其是CYP86家族的 ΔP₄₅₀ 酶可以催化脂肪酸的 ω- 位羥基化[8-9]。研究表明，復(fù)合體CYP86A1是植物中發(fā)現(xiàn)的第一個催化C16和C18脂肪酸的 ω -羥基化反應(yīng)的酶，相應(yīng)的horst突變體研究揭示了CYP86A1中涉及的生化過程[10-1]。CYP86B1基因在擬南芥突變體合成木栓質(zhì)單體的過程中起關(guān)鍵作用[12]，CYP86B1表達的局部降低會導(dǎo)致特定長鏈羧酸含量的降低[13]。這些研究結(jié)果表明，CYP86B1編碼超長鏈脂肪酸 ω -羥基的形成是催化這一過程的關(guān)鍵酶[12-14]。

病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是近年來廣泛用于植物基因功能研究的技術(shù)[15]。這是一個轉(zhuǎn)錄后基因沉默，將植物內(nèi)源基因片段插人攜帶植物功能基因DNA片段的植物病毒載體中[16]。該片段的重組病毒載體通過轉(zhuǎn)入宿主植物，引起植物內(nèi)源基因沉默并出現(xiàn)表型變化，從而導(dǎo)致靶基因功能的喪失。通過分析植物表型和其他生理生化指標(biāo)和分子水平指標(biāo)，可揭示該基因的功能[17]VIGS技術(shù)是一種用于植物基因功能鑒定的反向遺傳學(xué)新技術(shù)，已被用于鑒定植物的各種基因[15]。與其他基因功能研究方法（如基因敲除、反義抑制和轉(zhuǎn)基因）相比，VIGS技術(shù)不需要遺傳轉(zhuǎn)化，操作簡單，成本低，表型快速[18-19]。同時，VIGS具有通量高的優(yōu)點，可應(yīng)用于細胞的基本功能或早期發(fā)育相關(guān)基因的功能鑒定[20]。因此，VIGS技術(shù)自誕生以來已被廣泛使用。筆者通過對“碭山酥梨”及其褐皮芽變“碭山金酥”果皮色澤形成關(guān)鍵期的果皮轉(zhuǎn)錄組進行分析，篩選出與木栓質(zhì)形成相關(guān)的差異表達基因PbCYP86A1和PbC-YP86B1。采用TRV介導(dǎo)的VIGS技術(shù)，在梨果實中建立的病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)，實現(xiàn)對上述基因進行快速的功能鑒定，通過對基因沉默后果皮的基因表達量分析、色差分析及木栓質(zhì)組分差異分析，探討碭山酥梨果皮褐變的可能原因，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。

1材料與方法

1.1試驗材料與試劑試驗樣品采摘于中國安徽梨種植基地，分別取盛花后25、50、75、100、125、150和 175d 不同時期的“碭山酥梨”和“碭山金酥”果實，削取厚度約 1mm 梨皮，迅速用液氮進行處理，置于 -80°C 冰箱中進行保存。大腸桿菌菌株購自北京全式金生物技術(shù)有限公司農(nóng)桿菌菌株GV3101購自上海唯地生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒TRV1-TRV2載體購自北京信諾金達生物技術(shù)有限公司。

該試驗用到的膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購自生工生物工程股份有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4連接酶及限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；RNA多糖多酚提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；平端克隆試劑盒（pEASY-BluntSimplekit）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；高保真酶購自東洋紡生物科技有限公司；測序和引物合成由上海華大科技有限公司完成;正三十烷、纖維素酶、N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）、果膠酶、含 14% BF3的甲醇溶液均采購于Sigma-Aldrich公司，MES、丙酮、醋酸鈉、 MgCl 乙酸、AS氯仿、甲醇采購于上海生物有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1“碭山酥梨”和“碭山金酥\"梨果皮總RNA的提取與PbCYP86A1、PbCYP86B1基因的PCR擴增。使用TIANGEN的RNAPRepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒分別提取“碭山酥梨”和“碭山金酥”梨果皮的總RNA，檢測RNA的濃度與完整性?？俁NA反轉(zhuǎn)錄步驟參照TaKaRa公司的TransScript First-strand cDNA synthesis Supermix 試劑盒說明書。以反轉(zhuǎn)錄的“碭山酥梨”和“碭山金酥”梨果皮cDNA作模板，用PbCYP86A1-F（GCTGGTTCTTCCACCTTGTCA）和PbCYP86A1-R（AAACCAGCCTATCCGCCTC），PbCYP86B1-F（TGCTCCTCCTCTGCTACCAATAA）和PbCYP86B1-R（ATC-CCTCAGGAACTTGTCCG）作為引物進行PCR擴增，擴增體系如下： 94⁹⁴⁹⁴ 預(yù)變性 4min;94^°C 變性 30s ， 55^°C 退火2min，72% 延伸 45s ，循環(huán)35次； 72^°C 徹底延伸 10min 。通過電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物并回收。

1.2.2PbCYP86A1、PbCYP86B1基因的生物性學(xué)分析。利用NCBI數(shù)據(jù)庫相關(guān)軟件進行基因的同源序列、開放閱讀框以及氨基酸序列查找；運用BioEdit軟件對蛋白質(zhì)進行理化分析及結(jié)構(gòu)域分析；利用DNAMAN軟件對基因進行堿基序列和氨基酸序列的比對。用Primer5.064軟件進行引物設(shè)計。利用MEGA軟件對基因在同源性物種間進行系統(tǒng)進化樹分析。

1. 2.3 “碭山金酥”梨PbCYP86A1、PbCYP86B1基因沉默載體的構(gòu)建。將回收的PCR產(chǎn)物（克隆片段）和TRV2空載體分別用BamHI和EcoRI進行雙酶切后進行連接，得到重組載體pTRV2-PbCYP86A1和pTRV2-PbCYP86B1，將重組載體轉(zhuǎn)入制作好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞。通過菌液PCR鑒定出陽性轉(zhuǎn)化子，并將其送至上海生物工程有限公司進行測序。

1.2.4侵染液的配制。將鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為農(nóng)桿菌GV3101，制備侵染液。感染緩沖液由 10mmol/L 氯化鎂、10mmol/L MES緩沖液和 20mmol/L 乙酰丁香酮組成。在4^°C 下以 8000r/min 離心 10min ，棄去上清液，將細菌重新懸浮于緩沖液中，將 0D₆₀₀ 調(diào)節(jié)至約3.0，并等體積混勻TRV1空載體和TRV2空載體（對照），TRV1空載體和pTRV2-PbCYP86A1重組載體，TRV1空載體和pTRV2-PbCYP86B1重組載體，在室溫下或在 28^°C 搖床上 100r/min 培養(yǎng) ^3h 。

1.2.5梨基因沉默果皮色差和質(zhì)地的測定。使用色差儀（NH310）測定基因沉默梨果實與對照組果實的色差；每個果隨機均勻選取3處測量，選取10個果實。

1.2.6梨基因沉默果皮木栓質(zhì)提取及組分測定。分別取TRV1-TRV2-PbCYP86A1、TRV1-TRV2-PbCYP86B1、空載（TRVI-TRV2）注射部位梨果皮各 _2g ，用纖維素酶和果膠酶酶解，有機溶劑除去可溶性脂類后用含 14% BF3甲醇溶液進行解聚后得到最終的脂類成分，用正三十烷（triacontane）作內(nèi)參，衍生化后用氯仿溶解后進行GC-MS，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件為Agilent7890AGC/5975CMS。色譜柱為30m×0.25mm×0.25μm ，色譜條件為 30m×0. 25mm× 0.25μm ，升溫程序為始溫 70% ，恒溫 2min ，以 4^c/min 程序升溫至 200^°C ，恒溫 2.00min ，以 程序升溫至300‰ ，恒溫 9.42min 。進樣口溫度 250^°C ，載氣為氮氣，氮氣流量 1mL/min ，線速度為 40cm/s 。質(zhì)譜條件為：電子轟擊源，電離方式為EI源，電離能量 70eV 。GC/MS接口溫度為 310^qC ，離子源溫度 230^qC ，四級桿溫度 150^°C 。

1.2.7基因沉默后梨PbCYP86A1和PbCYP86B1基因差異性表達。以梨Actin為內(nèi)參，分析梨PbCYP86A1和PbC-YP86B1基因沉默后的差異性表達，依據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計要求，使用premier5.0設(shè)計實時熒光定量PCR特異引物（表1），不同處理的cDNA模板量的校準用梨ACTIN基因為內(nèi)標(biāo)。使用ABISTEPONE熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1梨PbCYP86A1、PbCYP86B1基因克隆及生物學(xué)分析如圖1所示，瓊脂糖擴增出 1600bp 大小的片段。經(jīng)序列分析獲得1條長度為 1575bp 的核苷酸序列，Blast結(jié)果分析確定該序列為梨PbCYP86A1基因（登錄號為XM009375994）。通過NCBI的ORFFinder分析，PbCYP86A1基因的cDNA全長為 1575bp ，編碼525個氨基酸，以ATG為起始密碼子，以TAG為終止密碼子。PbCYP86A1蛋白質(zhì)分子量為 59.33kD 等電點9.28（圖1a）。

為瓊脂糖擴增出約 1 800bp 大小的片段。經(jīng)序列分析獲得1條長度為 1854bp 的核苷酸序列，Blast結(jié)果分析確定該序列為梨PbCYP86B1基因（登錄號為XM009356145）。通過NCBI的ORFFinder分析，PbCYP86B1基因的cDNA全長為 1854bp ，編碼544個氨基酸，以ATG為起始密碼子，以TAG為終止密碼子。PbCYP86B1蛋白質(zhì)分子量為62.50kD ，等電點8.17（圖1b）。

注：M.DL2000a.PbCYP86A1，1＼～3.“碭山酥梨\"中PbCYP86A1擴增片段，4＼～6.“碭山金酥”中PbCYP86A1擴增片段;b.PbCYP86B1，1＼～4.“碭山酥梨”中 PbCYP86B1擴增片段，5＼～8.“碭山金酥\"中 PbCYP86B1擴增片段。

Note：M.DL2O.6A-386plffgetinDgssuear4-686ApfdfragntiD pear.b.PbCYP86B1，-4.PCYP86B1ampifedfragmentinDangshansu”par，5-8.PCP86Bamplifedfragmentin\"Dangshaju”pear.

γ.1PCR amplification of PbCYP86A1（a）and PbCYP86B1（b）gene in“Dangshansu”pear and“Dangshanjinsu”pea

從圖2可見，PbCYP86A1氨基酸序列與多種植物氨基酸序列具有很高的同源性。梨PbCYP86A1蛋白與蘋果MdCYP86A1蛋白同源性最高，相似性達 100% ，與桑樹、核桃的親緣關(guān)系相對較遠。PbCYP86B1與多種植物的氨基酸序列具有很高的同源性，梨PbCYP86B1蛋白與蘋果MdC-YP86B1蛋白同源性最高，相似性達 100% ，與油棕的親緣關(guān)系相對較遠。從圖2可以看出，CYP86A1和CYP86B1家族分別聚類，說明2個家族存在差異，因此其功能也可能存在差異。

2.2梨TRV-PbCYP86A1、TRV-PbCYP86B1載體的構(gòu)

建如圖3所示，用已經(jīng)得到的PbCYP86A1、PbCYP86B1全長基因的質(zhì)粒產(chǎn)物，通過PCR反應(yīng)，擴增得到目的基因片段，均為 500bp 左右，符合引物設(shè)計的擴增長度。目的基因片段經(jīng)試劑盒回收純化后待用?；厥誔CR產(chǎn)物，連接到pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在氨芐青霉素條件下通過藍白斑篩選轉(zhuǎn)化子，用LB培養(yǎng)基搖菌后，經(jīng)過菌液PCR檢測后送至深圳華大有限公司測序驗證。

2.3梨TRV-PbCYP86A1、TRV-PbCYP86B1重組載體的鑒定

2.3.1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及驗證。圖4為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后菌落PCR的結(jié)果。從圖4可以看出，出現(xiàn)的條帶數(shù)符合引物的擴增大小，菌落PCR所用引物為通用引物，根據(jù)pTRV2載體設(shè)計，擴增出的片段大小略大于圖4中6＼～11（用目的基因片段引物檢測）目的基因片段大小，這一步可以判斷pTRV2載體是否含有目的基因片段。

從圖5可以看出，1＼～6泳道在 500～750bp 有預(yù)期的條帶出現(xiàn)。菌落PCR所用引物為通用引物，根據(jù)pTRV2載體設(shè)計，擴增出的片段大小略大于圖5中7＼～12（用目的基因片段引物檢測）的目的基因片段大小，這一步可以判斷pTRV2載體是否含有目的基因片段。

2.3.2重組質(zhì)粒測序分析。經(jīng)過菌落PCR的判斷后，為確認pTRV載體是否真正連接上目的基因片段，筆者對重組質(zhì)粒進行了基因測序分析。測序引物使用pTRV載體的通用引物。測序結(jié)果表明，TRV2載體上插入片段序列與梨中目的基因PbCYP86A1、PbCYP86B1序列的同源性為 99% ＼～100% ，說明TRV2-PbCYP86A1、TRV2-PbCYP86B1沉默載體構(gòu)建成功。

2.4PbCYP86A1、PbCYP86B1基因沉默后基因表達量分

析與注射空載的果皮部分相比，VIGS沉默果皮中PbC-YP86A1和PbCYP86B1基因表達量均有明顯下調(diào)，與對照形成顯著差異。由此可知，TRV-PbCYP86A1誘導(dǎo)了PbC-YP86A1基因的下調(diào)，TRV-PbCYP86B1誘導(dǎo)了PbCYP86B1基因的下調(diào)，可以認為沉默組部位梨果皮不能變褐與PbC-YP86A1和PbCYP86B1基因沉默有著直接關(guān)系（圖6）。

注：0.1為步長值;Pm.Prunusmume;Pa.Prunusavium;Pp.Prunus persica;Pb.Pyrusx bretschneideri;Md.Malusx domestica;Gr.Gossypiumraimondii;Oe. Olea europaea;Pd.Phoenix dactylifera;Eg. Elaeis guineensis;Fv.Fragaria vesca;Mn. Morus notabilis;Jr. Juglans regia.

Note：Footstep is O.1；Pm. Prunusmume；Pa. Prunusavium； Pp.Prunuspersica;Pb.Pyrusxbretschneideri;Md.Malusxdomestica;Gr.Gossypiumraimondii;Oe. Olea europaea;Pd.Phoenix dactylifera;Eg. Elaeis guineensis; Fv. Fragaria vesca;Mn. Morus notabilis;Jr. Juglansregia.

圖2梨PbCYP86A1、PbCYP86B1氨基酸與其他物種序列的系統(tǒng)進化分析

2.5梨PbCYP86A1、PbCYP86B1基因沉默后表型分析通過觀察發(fā)現(xiàn)，TRV-PbCYP86A1（圖7）和TRV-PbCYP86B1（圖8）注射部位的梨表皮不能正常變成褐色，沉默部位仍保持黃綠色，表皮光滑；與周圍未沉默部位對比明顯，整個果實表現(xiàn)為斑駁的半褐半綠；而空白組注射部位正常變褐，與周圍果皮無異，表皮均勻覆蓋上了一層木栓質(zhì)。結(jié)果表明，病毒經(jīng)由梨表皮層侵染入果實，可在植物體內(nèi)存活、復(fù)制并感染，最終導(dǎo)致果實出現(xiàn)沉默現(xiàn)象。在“碭山金酥”轉(zhuǎn)色期前進行侵染，得到的沉默植株沉默效率較高，整個梨果實上基因沉默面積很大。PbCYP86A1和PbCYP86B1基因沉默使注射部位難以正常形成木栓質(zhì)，說明二者可能與“碭山金酥\"果皮褐變相關(guān)。

2.6梨PbCYP86A1、PbCYP86B1基因沉默后果皮色差分析測量注射部位與周圍果皮的色差值，陰性對照組為注射TRV2-TRV1的空載注射銹酥梨，陽性對照組為野生型（WT）。從圖9可以看出， PbCYP86A1、PbCYP86B1 基因注射部位與周邊果皮色差值顯著大于對照組果皮色差值，PbC-YP86A1基因沉默果皮色差值約是對照組的4.0倍，PbC-YP86B1基因沉默果皮色差值是對照組的3.5倍。

注：M.DL2000；1＼～2.“碭山酥梨”中PbCYP86A1擴增片段;3＼～4.“碭山金酥”中PbCYP86A1擴增片段;5.“碭山酥梨”中PbC-YP86B1擴增片段；6.“碭山金酥”中PbCYP86B1擴增片段。

Note：DL20OO;1-2.AmplificationofafragmentofPbCYP86A1gene in“Dangshansuli”;3-4.Amplification ofa fragment ofPbCYP86A1 gene in\"Dangshanjinsu”;5.Amplification of a fragment of PbCYP86Blgene in“Dangshansuli”;6.Amplification ofa fragment of PbCYP86B1 genein\"Dangshanjinsu”.

圖3“碭山酥梨”和\"碭山金酥”中PbCYP86A1、PbCYP86B1基 因片段PCR擴增結(jié)果

注：M.DL2000；1＼～5.載體引物檢測片段;6＼～11.基因引物檢測片段。

Note：M.DL2OO0;1-5.DetectioofCRsgmentwithV2viusvectorprier;6-11.etectioofPCRsegmenhPCP86Agee.

注：M.DL2000；1＼～6.載體引物檢測片段;7＼～12.基因引物檢測片段。

te：DL20;1-6.DetectionofPCRsegmentwithTRV2virusvectorprimer;7-12.DetectioofPCRsegmentwithPbCYP86Blgenepri

圖5病毒載體TRV-PbCYP86B1的農(nóng)桿菌菌落PCR驗證電泳結(jié)果

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著（ Plt;0.05） 。

ote：Differentlowercase lettersindicate significant differencebetween treatments（ Plt;0.05，

注：A、B.PbCYP86A1基因沉默“碭山金酥”;C.“碭山金酥\"對照組。

Note：A，B.PbCYP86A1 geneis silenced in“Dangshanjinsu”pear;C.Injectionof“Dangshanjinsu”pear with emptyvector.

Fig.7Difference of the fruit between gene silence with control plant of “Dangshanjinsu” pear

2.7梨PbCYP86A1、PbCYP86B1基因沉默對木栓質(zhì)含量的影響分析對照組（空載注射）與 PbCYP86A1、PbCYP86B1 基因沉默梨果皮中木栓質(zhì)的組分含量發(fā)現(xiàn)，梨果皮的木栓質(zhì)主要由脂肪酸、@-羥基脂肪酸、 ∝ ，@-二酸等組成。PbC-YP86A1、PbCYP86B1基因沉默梨果皮中的木栓質(zhì)總量分別達到 273.20.267.75μg/mg ，均顯著低于對照組（木栓質(zhì)總量為343.26μg/mg，

PbCYP86A1基因沉默和對照組梨果皮的木栓質(zhì)組分以脂肪酸（油酸、二十二烷酸、二十烷酸、亞油酸、十八烷酸、十六烷酸） C16α，ω- 二酸和 Cl6ωω- 羥基脂肪酸為主，從表2注：A、B.PbCYP86B1基因沉默“碭山金酥”;C.“碭山金酥\"對照組。

Note：A，B.PbCYP86Blgene issilenced in“Dangshanjinsu”pear;C.Injectionof““Dangshanjinsu”pear withemptyvector.

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著（ Plt;0.05. ）

Note：Different lowercase letters indicate significant difference between treatments（ Plt;0.05 ）.

可以看出，對照組脂肪酸含量為 143.88μg/mg ，PbCYP86A1基因沉默后的脂肪酸含量為 128.26μg/mg ，略低于對照組脂肪酸含量。對照組的C16ω-羥基脂肪酸含量為78.11μg/mg，PbCYP86A1 基因沉默后的 Cl6ω- 羥基脂肪酸含量為 40.29μg/mg ，二者間差異顯著。PbCYP86A1基因沉默后的 二酸含量為 79.34μg/mg ，顯著低于對照組0 96.59μg/mg） 。結(jié)果表明， PbCYP86A1 基因的沉默，使梨果皮中 Cl6ω? -羥基脂肪酸含量顯著降低， 二酸含量有所減少。

PbCYP86B1基因沉默和對照組梨果皮的木栓質(zhì)組分，以脂肪酸、 ，ω-二酸和 Cl6ωω- 羥基脂肪酸為主。由表2可知，PbCYP86B1基因沉默后的脂肪酸含量為134.80μg/mg ，略低于對照組脂肪酸含量。對照組的 Cl6ω- 羥基脂肪酸含量為 78.11μg/mg，PbCYP86B1 基因沉默后的Cl6ωω- 羥基脂肪酸含量為 55.12μg/mg ，二者間差異顯著。PbCYP86B1基因沉默后的C16 ∝ ，ω-二酸含量為52.38μg/mg ，顯著低于對照組（ 96.59μg/mg ）。結(jié)果表明，PbCYP86B1基因的沉默使梨果皮中 Cl6ωω- 羥基脂肪酸和C16α，ω-二酸含量顯著降低。

3結(jié)果與討論

3.1討論VIGS技術(shù)是一種用于植物基因功能鑒定的反向遺傳學(xué)新技術(shù)，已被用于鑒定植物中的各種基因[15]。大多數(shù)病毒不能感染植物生長位點，限制病毒載體在植物中的使用，但是TRV可以有效感染植物組織生長位點[21]。建立高效穩(wěn)定的VIGS系統(tǒng)是未來研究的方向之一，尤其是對于果樹等園藝作物而言，這種作物具有很長童年時期，難以進行遺傳轉(zhuǎn)化，并且難以用傳統(tǒng)方法進行遺傳功能研究，因此建立穩(wěn)定高效的VIGS體系將是未來研究的方向之一。該研究采用TRV介導(dǎo)的VIGS技術(shù)，在梨果實中建立的病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)，實現(xiàn)了對上述基因進行快速的功能鑒定。獲得PbCYP86A1、PbCYP86B1基因的CDS后，根據(jù)TRV載體的要求構(gòu)建得到了pTRV-PbCYP86A1、pTRV-PbCYP86B1載體，將載體注射在梨果實的表皮部位，以含有pTRV1和pTRV2空載體的農(nóng)桿菌侵染液為空白組。待 20d “碭山金酥\"進人轉(zhuǎn)色后，通過觀察發(fā)現(xiàn)TRV-PbCYP86A1、TRV-PbC-YP86B1注射部位的梨表皮不能正常變褐，沉默部位仍保持黃綠色，表皮光滑，基本無果銹分布，與周圍未沉默部位對比明顯，整個果實表現(xiàn)為斑駁的半褐半綠，而空白組注射部位正常變褐，與周圍果皮無異，表皮均勻覆蓋上了一層果銹。這說明病毒經(jīng)由梨表皮層侵染人果實，最終導(dǎo)致出現(xiàn)沉默現(xiàn)象。PbCYP86A1、PbCYP86B1基因的沉默使注射部位未能正常形成果銹，說明PbCYP86A1PbCYP86B1基因可能與果皮褐變有關(guān)。

木栓質(zhì)是一種以長鏈脂肪酸和芳香族化合物組成的多聚物，主要由脂肪酸、 ρ_ω -羥基脂肪酸 ?_?αα，αω- 二酸、芳香族化合物、脂肪醇等組成[22]。在木栓質(zhì)的合成過程中，脂肪酸的羥基化是指在木栓質(zhì)的合成過程中脂肪酸經(jīng)過 ω- 氧化途徑形成 ω_ωω_ωω_ω -羥基酸和 α，ω- 二酸的過程[23]。在這個過程中起催化作用的酶是以CYP86和CYP94家族的 ω（o?ω） -位羥基化為主的NADPH依賴性細胞色素單加氧酶 P450^[23-24] 。細胞色素P450是一種末端加氧酶，從 ΔNAD（P）H 獲得電子后，催化單加氧反應(yīng)。復(fù)合體 PbCYP86A1 是植物中首次發(fā)現(xiàn)的C16和C18脂肪酸的 ω- 羥化作用[10-I]。該研究通過對基因沉默后色差分析發(fā)現(xiàn)， PbCYP86A1、PbCYP86B1 基因注射部位與周邊果皮色差值顯著大于對照組果皮色差值，說明PbC-YP86A1、PbCYP86B1基因沉默會引起表皮顏色的改變。

復(fù)合體CYP86A1是植物中首次發(fā)現(xiàn)的催化C16和C18脂肪酸的 ω -羥化作用的酶[10-11]。CYP86A1為木栓質(zhì)合成途徑中催化形成脂肪酸羥基化的關(guān)鍵酶。擬南芥突變體的根表現(xiàn)為脂肪族高度減少。CYP86A1/horst突變體中除醇外的所有化合物類木栓質(zhì)脂肪族特定單體的量顯著減少，減少最明顯 Cl6ω? -羥基脂肪酸和 Cl6α ω -二酸的含量，導(dǎo)致木栓質(zhì)含量與野生型相比減少 60% 左右[25]。PbCYP86A1的缺失對木栓質(zhì)物質(zhì)組成具有顯著影響。該研究中 PbCYP86A1 基因沉默和對照組梨果皮的木栓質(zhì)組分對比分析表明， PbC. YP86A1基因沉默，使梨果皮中 Cl6ωω- 羥基脂肪酸和 Cl6α ，ω -二酸含量顯著降低。對照組的 Cl6ω? -羥基脂肪酸含量為78.11μg/mg，PbCYP86A1 基因沉默后的 ω- 羥基脂肪酸含量為 40.29μg/mg ，二者間差異顯著。PbCYP86A1基因沉默后的 Cl6α ω- 二酸含量為 79.34μg/mg ，顯著低于對照組0 96.59μg/mg） 。結(jié)果表明，PbCYP86A1基因的沉默，使梨果皮中 Cl6ω- 羥基脂肪酸和 二酸含量顯著降低。CYP86B1 基因在擬南芥突變體合成木栓質(zhì)單體的過程中起關(guān)鍵作用[12]。CYP86B1表達的局部降低會導(dǎo)致特定長鏈羧酸含量的降低[13]。該研究通過對比分析 PbCYP86B1 基因沉默和對照組梨果皮的木栓質(zhì)組分可知，其以脂肪酸、 C16‰ ω- 二酸和 Cl6ωω- 羥基脂肪酸為主，對照組脂肪酸含量為（204 143.88μg/mg ，PbCYP86B1基因沉默后梨果皮中脂肪酸含量為 134.80μg/mg ，略低于對照組脂肪酸含量。對照組的C16ω- 羥基脂肪酸含量為 78.11μg/mg ，PbCYP86B1基因沉默后的 ω -羥基脂肪酸含量為55 .12μg/mg ，二者間差異顯著。PbC-YP86B1基因沉默后的C16 ∝ ，ω-二酸含量為 52.38μg/mg ，顯著低于對照組（ 96.59μg/mg ）。結(jié)果表明，PbCYP86B1基因的沉默，使梨果皮中 Cl6ω -羥基脂肪酸和C16 ∝ ，ω-二酸含量顯著降低。由此得出， PbCYP86A1、PbCYP86B1 參與木栓質(zhì)的合成，而梨果皮表面木栓層的研究是揭示褐皮梨形成原因的關(guān)鍵[26]，因此可推斷 PbCYP86A1、PbCYP86B1 通過影響木栓質(zhì)的合成導(dǎo)致果皮發(fā)生褐變。

3.2結(jié)論該研究利用VIGS技術(shù)沉默PbCYP86A1、PbC-YP86B1，注射部位梨果皮中PbCYP86A1PbCYP86B1的表達量顯著低于對照組。PbCYP86A1、PbCYP86B1基因沉默后，注射部位的梨表皮褐色形成受到抑制，表現(xiàn)為黃綠色，表皮光滑；未沉默部位表現(xiàn)為褐色；空白組注射部位表現(xiàn)為褐色；注射部位與周圍梨果皮色差存在顯著差異。分析對照組（空載注射）與PbCYP86A1、PbCYP86B1基因沉默梨果皮中木栓質(zhì)的組分含量發(fā)現(xiàn)，注射部分梨果皮木栓質(zhì)組分中 Cl6ω- 羥基脂肪酸和C16Ω∝ ，@-二酸含量顯著降低，從而使木栓質(zhì)的總量減少。綜上所述，沉默 PbCYP86A1、PbCYP86B1 能夠影響梨果皮木栓質(zhì)組分含量，使梨表皮褐色形成受到抑制，推測PbCYP86A1、PbC-YP86B1可以在一定程度上抑制木栓質(zhì)的合成。

參考文獻

[1]賈兵，葉振風(fēng)，劉普，等.梨新品種‘碭山金酥’[J].園藝學(xué)報，2021，48 （8） ：1635-1636.

[2]HENG W，WANG Z T，JIANG XH，et al. The role of polyamines during exocarp formation in a russet mutant of‘Dangshansuli’pear （Pyrus bretschneideri Rehd.）[J].Plant cell reports，2016，35（9） ：1841-1852.

[3]施露，高慶超，李亞輝，等.梨果實品質(zhì)的研究進展與潛在技術(shù)應(yīng)用展 望[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2022，38（2）：567-576.

[4]杜昱彤，曲柏宏，李潤文.我國紅皮梨資源及果實著色機制研究進展 [J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2021，43（4）：98-107.

[5]苗永美，高亞杰，顧東悅，等.光質(zhì)對細葉石仙桃組培苗生長、生理和次 生代謝的影響及轉(zhuǎn)錄組分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報，2025，34（1）： 21-32.

[6]WANGQ，YAO D Z，WU XY，et al.The application of fatty acid synthesis inhibitorsregulates the suberin biosynthesis in the exocarp oftherusset mutant of‘Dangshansuli’（Pyrus bretschneideriRehd.）[J].Actaphysiologiaeplantarum，2022，45（2） ：1-13.

[7]ZHANG J，ZHANG C，LI X，et al. Comprehensive analysis of KCS gene familyin pear reveals the involvement of PbrKCSsin cuticular wax and suberin synthesis and pear fruit skin formation[J].Plant molecular biology， 2023，112（6） ：341-356.

[8]RASTOGI S，SATAPATHY S，SHAH S，et al. In silico identification of cytochromeP45Osinvolved in Ocimumtenuiflorumsubjectedto fourabiotic stresses[J]. Gene reports，2020，20：1-11.

[9]WEI XP，LIULY，JINXY，et al.Exogenousmethyl jasmonate promotes wound healing of Chinese yam tubers（Dioscorea opposita） through the deposition of suberin polyaliphatics at the wound sites[J].Postharvest biologyand technology，2024，207：1-10.

[10]WEI XP，MAO L C，LU WJ，et al. Three transcription activators of ABA signaling positively regulate suberin monomer synthesis by activating cytochromeP45O CYP86A1in kiwifruit[J].Frontiers inplant science，2019， 10：1-15.

[11]HANXY，LUWJ，WEIXP，etal.Proteomicsanalysistounderstand the ABAstimulation of wound suberization in kiwifruit[J].Journal of proteomics，2018，173：42-51.

[12]LIU XJ，JIANG D，WANG Y，et al.Expression and sequence analysis of CYP86B1 in blackberry（Rubus spp.）[C]//Wuhan Zhicheng Times Cultural Development Co.，Ltd.Proceedings of 2O18 international workshop on bioinformatics，biochemistry，biomedical sciences（BBBS 2018）. Paris：AtlantisPress，2018：122-126.