跨膜蛋白166在肝臟脂質(zhì)代謝中的作用及其機制

[摘要］目的探究跨膜蛋白166（TMEM166）在肝臟脂質(zhì)代謝中的作用及其具體的分子機制。方法將Tmeml66flox/flox小鼠與Alb-Cre小鼠雜交，得到的子代 Tmem166^+′+ 小鼠分為A組， Tmeml66^-′- 小鼠分為B組，每組各8只，飼養(yǎng)至24周齡時取血標(biāo)本并分離肝臟組織；HepG2細胞分為 C～H 組，C組轉(zhuǎn)染sh-vector，D組轉(zhuǎn)染sh-TMEM166，E組轉(zhuǎn)染sh-vector + 油酸（OA）處理，F(xiàn)組轉(zhuǎn)染 sh-TMEM166+OA 處理，G組轉(zhuǎn)染 sh-TMEM166+ siNC + OA處理，H組轉(zhuǎn)染 sh-TMEM166+siCD36+OA 處理。通過蛋白免疫印跡實驗檢測A、B組小鼠肝臟組織和 c～F 組細胞中TMEM166蛋白表達水平;通過實時熒光定量PCR實驗和蛋白免疫印跡實驗檢測各組細胞和小鼠肝臟組織中CD36、FATPs等脂肪酸攝取相關(guān)因子表達水平;通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察A、B組小鼠肝臟組織病理變化；通過油紅O染色觀察A、B組小鼠肝臟組織及 E～H 組細胞內(nèi)脂滴積累情況；通過相應(yīng)試劑盒檢測A、B組小鼠血清中三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及非酯化脂肪酸（NE-FA）的含量，并檢測A、B組小鼠肝臟組織以及 C～H 組細胞中TG和NEFA的含量。結(jié)果動物實驗結(jié)果顯示，與A組相比，B組小鼠肝臟組織中TMEM166蛋白相對表達水平顯著下降 （t=6.55，Plt;0.01） ，肝臟空泡化和脂滴明顯增多，血清TG、ALT、AST及肝臟組織TG、NEFA水平顯著升高 （t=3.10～28.53，Plt;0.05） ，肝臟組織CD36和 FATPs mRNA和蛋白表達水平顯著升高 （t=4.48～52.27，Plt;0.05） 。細胞實驗結(jié)果顯示，敲降TMEM166、OA處理對各組細胞TG、NEFA水平和TMEM166蛋白表達水平、 CD36 和 FATPs mRNA及蛋白表達水平均有明顯影響（F敲降TMEM166= ，且對 TG水平和過氧化物酶體增殖物激活受體 γ2（PPARγ2）mRNA 的表達水平均存在交互作用 $（ F _ { ☉ ＼tt A } = 9 . 0 1 ， 1 5 . 5 0 ， P lt; 0 . 0 5 ）$ ；單獨效應(yīng)分析顯示，敲降TMEM166、OA處理均可單獨引起以上所有指標(biāo)顯著升高 （F=21.89～393.90，Plt;0.05） ；油紅O染色結(jié)果顯示，F(xiàn)組較E組脂滴積累明顯增多;與G組相比較，H組細胞中CD36蛋白表達水平、TG以及NEFA水平均顯著降低（ Ψ_t= 7.03～12.07，Plt;0.01） ，脂滴積累顯著減少。結(jié)論TMEM166表達下調(diào)可上調(diào)CD36表達，促進肝臟細胞脂肪酸攝取和脂滴積累，從而影響肝臟中脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)；TMEM166對CD36的調(diào)控機制可能與PPARγ2的激活有關(guān)。

[中圖分類號] Q547;R575.5 [文獻標(biāo)志碼] A

The role and mechanism of action of endoplasmic reticulum transmembrane protein 166 in liver lipid metabolismLI Lianhui，YANG Di， ZANG Kailai，SUN Yani，DUQiyuan，LI Ning（Scholof Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266071，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the role and specific molecular mechanism of actionof endoplasmic reticulum transmembrane protein166（TMEM166）inliverlipid metabolism.MethodsTmem166flo/flox mice werecrossedwithAlb-Cremice， and the offspring Tmem166^+/+ mice were selected as group A，while the Tmeml 66^-/- mice were selected as group B， with 8 mice ineachgroup.The mice werefedtill24 weeksofage，andserumandlivertissuesamples wereisolatedHepG2cellsweredivided into groupC（transfected with sh-vector），group D（transfected with sh-TMEM166），group E（transfected with sh-vectorand treated witholeicacidOA]），groupF（transfected withsh-TMEM166andtreated withOA），groupG（co-transfected with shTMEM166 and siNCand treated with OA），and group H（co-transfected with sh-TMEM166 and siCD36 and treated with OA）. Western bloting wasused tomeasure theprotein expressionlevelof TMEM166 inlivertissueofthe miceingroupsAandBand in cells in groups C-F ； quantitative real-time PCR and Western bloting were used to measure the expression levels of CD36， FATPs，andotherfatyaciduptake-relatedfactors incellsandlivertissue；HEstaining wasused toobservethepathologicalchangesof livertissueingroups AandB，andoilredOstaining was usedtoobservetheaccumulationoflipiddropletsinlivertissueof groups A and B and in cells of groups E-H ; corresponding kits were used to measure the serum levels of triglyceride（TG），total cholesterol（TC），alanineaminotransferase（ALT），aspartateaminotransferase（AST），andnon-esterifiedfatyacids（NEFA）in the micein groups AandB，as wellas thecontentsof TGand NEFA in the mice in groupsAand Band in thecellsin groups C-H. Results Animal experiments showed that compared with groupA，group B had a significant reduction in the relative protein expressionlevel of TMEMl66 inlivertissue t=6.55，Plt;0.01 ）， significantincreases inlivervacuolizationandlipiddroplets，andsignificantincreases intheserumlevelsofTG，ALT，andAST and thelevels of TG and NEFA in liver tissue （t=3.10-28.53，Plt;0.05） ，as well as significant increases in the mRNA and protein expression levels of CD36 and FATPs in liver tissue （t=4.48-52.27，Plt;0.05） . Cell experiments showed that TMEM166 knockdownandOA treatment had significant influenceon thelevelsofTGand NEFA，the protein expresion levelof TMEM166，and the mRNA and protein expression levels of CD36，F(xiàn)ATPs in each group of cells 26.99-991.80，Plt;0.01） ，with an interaction between TMEM166 knockdown and OA treatment on the level of TG and the mRNA expression level of PPARγ2 in cells （ ?F_interaction=9.01，15.50，Plt;0.05） ，and the individual effect analysis showed that TMEM166 knockdown or OA treatment alone could cause the significant increases in allthe above indicators ?F=21.89-393.90 ， Plt;0.05） .Oil red O staining showed that group F had a significant increase in the accumulation of lipid droplets than group E，and compared with groupG，group Hhad significantreductionsintheprotein expresionlevelofCD36and thelevelsofTGandNEFA （t=7.03-12.07，Plt;0.01） ， as well as a significant reduction in the accumulation of lipid droplets.ConclusionDownregulation of TMEM166 canincreasetheexpresionofCD6andpromotefattyaciduptakeandlipiddroletaccumulationinlivercelsthere byaffecting thelipidhomeostasisintheliver，nd theregulatorymechanismofTMEM166onCD36maybeassociated withtheactivation of PPARγ2.

[KEY WORDs]Liver; Fatt liver; Fatty acids;Lipid droplets； CD36 antigens;Transmembrane protein 166

代謝功能障礙相關(guān)的脂肪性肝?。╩etabolicdysfunction-associated fatty liverdisease，MAFLD）是由代謝異常所致的肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積的慢性進展性疾病，與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病等代謝疾病密切相關(guān)。全世界范圍內(nèi)，MAFLD的發(fā)病率逐年上升[]，因此迫切需要深入探討肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機制，為肝臟脂肪病變的深度解析以及有效干預(yù)提供全新的思路。脂肪酸攝取功能紊亂是引起MAFLD的重要因素。脂肪酸轉(zhuǎn)運酶（CD36）是一種B類清道夫受體，作為細胞膜上的脂質(zhì)傳感器，控制著脂肪酸的攝入流量[2-3]。既往研究表明，MAFLD小鼠和患者肝臟中CD36的表達上調(diào)，導(dǎo)致脂肪酸的攝取增加，促進了MAFLD的發(fā)展[4-5]。然而CD36介導(dǎo)肝臟細胞脂肪酸攝取的具體調(diào)控機制尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白166（TMEM166）在高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD模型小鼠肝臟中表達下調(diào)，肝臟細胞特異性敲除Tmem166可導(dǎo)致小鼠脂肪肝，提示TMEM166可能參與了肝臟的脂質(zhì)代謝。因此，本研究擬探討TMEM166在肝臟脂肪酸代謝中的調(diào)控作用及其具體機制，旨在為MAFLD發(fā)病機制的解析和治療策略的選擇提供新的理論支持和潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

本研究所用人肝癌細胞系HepG2由青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室提供。Tmem166flox/floxC57BL/6小鼠由北京大學(xué)人類疾病基因研究中心惠贈，Alb-CreC57BL/6小鼠購買于上海南方模式生物有限公司。sh-vector（空載體）和sh-TMEM166質(zhì)粒均由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞器實驗室提供。油酸（OA）、總RNA提取試劑Trizol購買于生工生物工程（上海）股份有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購買于上海源培生物科技股份有限公司，胎牛血清購自蘇州依科賽生物科技股份有限公司，油紅O染色液、蘇木精-伊紅（HE）染色液和青-鏈霉素混合液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，胰酶、BCA蛋白定量試劑盒和RIPA蛋白裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒以及RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購買于美國賽默飛世爾科技公司，三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、非酯化脂肪酸（NEFA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）以及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所，TMEM166抗體購自英國Abcam公司，CD36抗體購自美國NovusBiologicals公司，F(xiàn)ATP5、FATP4和 β -actin抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 動物分組及處理

將Tmem166 flox/flox C57BL/6 小鼠以及 Alb-CreC57BL/6小鼠置于青島大學(xué)生物醫(yī)學(xué)中心SPF級動物房飼養(yǎng)。將 Tmem166^flox/flox 小鼠和 Alb-Cre 小鼠雜交2代，經(jīng)鼠尾基因型鑒定，將 Tmeml66^+/+ 小鼠分為A組， Tmem166^-′- 小鼠分為B組，每組各8只小鼠，飼養(yǎng)至24周齡，麻醉以后眼眶取血，全血3 500r/min 離心 10min 得到血清；取血后斷頸處死小鼠，分離肝臟用于后續(xù)實驗。

1.3 細胞分組及處理

HepG2細胞加入含 10% 胎牛血清以及 5% 青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱（ 37^°C 、含體積分數(shù) 0.05CO₂ ）中培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至融合度約 60% 時，將細胞分為 c～H 組，每組設(shè)3個復(fù)孔。其中，C組細胞（對照）和D組細胞（敲降TMEM166）使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染sh-vector和sh-TMEMl66質(zhì)粒，置于培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng) 48h;E 組細胞（對照 +OA） 以及F組細胞（敲降 TMEM166+OA） 分別在C組和D組處理的基礎(chǔ)上加入 400nmol/L OA處理 ⁶h （在轉(zhuǎn)染^42h 時加入）；G組細胞（TMEM166單敲降）以及H組細胞 （TMEM166/CD36 雙敲降）在均轉(zhuǎn)染了sh-TMEM16624h 以后，分別轉(zhuǎn)染siNC和siCD36^48h ，并加入 400nmol/L OA處理 6h （在轉(zhuǎn)染 66h 時加入）?；蚋蓴_片段序列見表1。

1.4各組細胞、肝臟組織和血清中脂質(zhì)水平和轉(zhuǎn)氨酶水平檢測

取各組細胞和小鼠肝臟組織，按肝臟組織或細胞質(zhì)量（g）：體積 （mL）=1：g 的比例加入生理鹽水進行機械勻槳，以 2500r/min 離心 10min 后，取上清液進行NEFA檢測。按照NEFA試劑盒說明書進行操作，使用酶標(biāo)儀檢測 546nm 波長下各孔吸光度值；同時取等量肝臟組織或細胞，以RIPA裂解液裂解后提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，以此計算各樣本中NEFA水平。按Folch法提取肝臟組織和細胞中脂質(zhì)，按照TG試劑盒說明書進行操作并計算各樣本中的TG水平。取各組小鼠血清，按照相應(yīng)試劑盒說明書分別檢測其中TG、TC、ALT和AST水平。

1.5各組細胞和肝臟組織油紅O染色及HE染色

油紅O染色：取各組小鼠肝臟組織，制成厚度為 8μm 的冰凍切片。用PBS配制 60% 的油紅O染色液和 60% 的異丙醇溶液，將各組小鼠肝臟冰凍切片或 4% 多聚甲醛固定后的各組細胞用PBS清洗3次后，使用 60% 的異丙醇溶液孵育 5s ，然后使用60% 的油紅O染色液孵育 30min 。HE染色：將各組小鼠肝臟組織放入 4% 多聚甲醛中固定 24h ，經(jīng)梯度乙醇脫水后，用二甲苯透明處理，制成厚度為4μm 的石蠟切片，置于 50°C 烘箱中烤片 10minPBS清洗3次，放入二甲苯I、二甲苯Ⅱ中分別脫蠟15min ，放入無水乙醇、體積分數(shù)0.95乙醇、體積分數(shù)0.85乙醇和體積分數(shù)0.75乙醇分別水化 5min 而后使用HE染色液孵育 30min 。上述切片均置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6RT-qPCR實驗檢測各組細胞或肝臟組織中脂肪酸攝入相關(guān)基因表達水平

使用Trizol試劑提取各組細胞和小鼠肝臟組織中總RNA，使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA作為模板，使用RT-qPCR試劑盒檢測各目的基因的mRNA水平，引物序列見表2。以 β -actin作為內(nèi)參基因，采用 2^-ΔΔCT 的方法計算目的基因的相對表達水平。

1.7蛋白免疫印跡實驗檢測各組細胞或肝臟組織中TMEM166、CD36、FATP5和FATP4的蛋白表達水平

使用RIPA裂解液提取各組細胞和小鼠肝臟組織中的總蛋白，加入 5× 上樣緩沖液后煮沸 5min 加人聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，而后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用 5% 脫脂奶粉封閉 ^2h ，分別加入CD36（1：1000） 、FATP5（1：2000）、FATP4（1：1000） β-actin（1：5 000） 和 TMEM166（1：1000） 一抗于 4^°C 下孵育過夜，TBST洗膜3次，然后加入HRP標(biāo)記的二抗 （1：5000） 孵育 ，TBST洗膜3次，使用ECL發(fā)光液顯影，用ImageJ軟件分析各蛋白條帶灰度值，以 β -actin為內(nèi)參計算各目的蛋白相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphpadPrism1O.1.2統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以 x±s 表示，方差齊性時組間兩兩比較采用獨立樣本 Ψ_tΨ_Ψ 檢驗，敲降TMEM166（是、否）和OA處理 （0nmol/L 、400nmol/L）及兩因素之間的交互作用采用析因設(shè)計的方差分析。所有實驗均重復(fù)3次。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠肝臟組織中TMEM166蛋白表達水平和脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)水平比較

蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示，A、B組小鼠肝臟組織中TMEM166蛋白相對表達水平分別為 1.03± 0.16，0.20±0.14 ，與A組相比，B組小鼠肝臟組織中TMEM166蛋白相對表達水平顯著降低（t=6.55，Plt;0.01 ），見圖1。HE和油紅O染色結(jié)果顯示，與A組相比，B組小鼠肝臟組織空泡化和脂滴顯著增多（圖2）。與A組相比，B組小鼠肝臟組織中TG及NEFA水平顯著升高 （t=13.72，3.10，Plt;0.05） .血清中TG、ALT及AST水平顯著升高（ 28.53，Plt;0.01? ，見表3。

2.2各組細胞中TMEM166蛋白表達水平和脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)水平比較

各組數(shù)據(jù)經(jīng)析因設(shè)計的方差分析后，結(jié)果顯示，敲降TMEM166和OA處理對 c～F 組細胞中TMEM166蛋白、TG和NEFA水平均有明顯影響（20 ， F_OA;glfg=36.92～ 303.10，Plt;0.01） ，兩者對各組細胞內(nèi)TG水平的影響存在交互作用 （F_☉?H=9.01，Plt;0.05） 。單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示， C～F 組上述指標(biāo)均具有顯著差異0 ?F=50.70～127.50，Plt;0.01） ，其中，與E組相比，F(xiàn)組細胞中TMEM166蛋白相對表達水平顯著降低，而TG和NEFA水平顯著升高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（ （Plt;0.01） ；與C組相比，D組細胞中TMEM166蛋白相對表達水平顯著降低，而TG水平和NEFA水平顯著升高（ Plt;0.01 ；與D組相比，F(xiàn)組細胞上述3個指標(biāo)均顯著升高 （Plt;0.01） ：與C組相比，E組細胞上述3個指標(biāo)均顯著升高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（ Plt;0.01） 。見圖3、表4。油紅O染色結(jié)果顯示，與E組相比，F(xiàn)組細胞內(nèi)脂滴數(shù)量顯著增多。見圖4。

2.3各組小鼠肝臟組織中脂肪酸攝取相關(guān)因子表達水平比較

RT-qPCR技術(shù)實驗結(jié)果顯示，與A組相比，B組小鼠肝臟組織中Cd36、Fatp5、Fatp4、Fabp1以及過氧化物酶體增殖物激活受體 的mRNA相對表達水平顯著升高 （t=18.97～52.27 Plt;0.01? ，見表5。蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示，A組小鼠肝臟組織中CD36、FATP5、FATP4蛋白相對表達水平分別為 1.03±0.05，0.99±0.15，0.95± 0.58，B組中上述三種蛋白的相對表達水平分別為1.88±0.32，1.74±0.13，3.73±0.80，B 組的上述指標(biāo)與A組比較顯著升高 （t=4.48～6.53，Plt;0.05） ，見圖5。

2.4各組細胞脂肪酸攝取相關(guān)因子表達水平比較

各組數(shù)據(jù)經(jīng)析因設(shè)計的方差分析后結(jié)果顯示，敲降TMEM166或者OA處理對于細胞中CD36、FATP5、FATP4、FABP1以及 PPARγ2 mRNA的相對表達量和細胞中的CD36、FATP5、FATP4蛋白的相對水平均具有顯著性影響 （ F敲降TMEM1"6 6 ）"="23.95～ 185.00，F(xiàn)_OAUE=26.99～991.80，Plt;0.01） ，其中兩者對細胞中 的相對表達量存在交互作用 。單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示， C～F 組上述指標(biāo)有顯著差異（ ??F= 21.89～393.90 Plt;0.01? ，其中，與E組相比，F(xiàn)組細胞的上述指標(biāo)均顯著性升高 （Plt;0.01） ;與C組相比，D組細胞上述指標(biāo)均顯著升高 （Plt;0.05） ；與D組相比，F(xiàn)組細胞的上述指標(biāo)均顯著升高（ Plt; 0.01）；與C組相比，E組細胞上述指標(biāo)均顯著升高（ ?Plt;0.01） 。見圖6、表6。

2.5G組和H組細胞中CD36蛋白表達水平和脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)水平比較

G、H組細胞中CD36蛋白的相對表達水平分別為 1.02±0.07，0.46±0.10 （圖7），TG水平分別為（48.17±4.61） 、 （17.53±5.98）mg/g ，NEFA水平分別為 （0.50±0.05） 、 （0.16±0.02）μmol/g，H 組上述指標(biāo)的水平均較G組顯著下降 （t=7.03～12.07 Plt;0.01） 。油紅O染色結(jié)果顯示，H組細胞中脂滴數(shù)量較G組明顯減少。見圖8。

3討論

隨著人們生活方式的改變和肥胖率的上升，MAFLD發(fā)病率持續(xù)攀升，在亞洲成年人群中患病率高達 29.63% ，已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)[。MAFLD不僅與肝臟脂肪異常堆積相關(guān)，還與代謝綜合征、2型糖尿病、肥胖等代謝紊亂密切相關(guān)，顯著增加患者進展至肝硬化和肝細胞癌的風(fēng)險[7]。因此，肝臟脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和肝臟脂肪變性的分子病理機制亟待深入探討，以推動MAFLD新型代謝評估標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及精準(zhǔn)靶向治療策略的開發(fā)。

目前研究普遍認為，引起MAFLD患者肝臟細胞脂肪蓄積的途徑包括脂肪酸攝取增加、脂肪酸從頭合成增加、脂肪的分泌減少和脂肪酸的氧化障礙等?？梢姡舅岽x紊亂是MAFLD的重要誘發(fā)因素[8]，其中脂肪酸攝取功能的異?；罨侵舅岽x紊亂的重要特征之一。本研究通過特異性敲除小鼠肝臟中的Tmem166，研究TMEM166在肝臟脂質(zhì)代謝中的作用及機制。結(jié)果顯示，與A組相比，肝臟特異性敲除Tmem166后，B組小鼠肝臟組織中NEFA和TG水平顯著升高，脂滴數(shù)量明顯增加，血脂水平和轉(zhuǎn)氨酶水平也異常升高，提示出現(xiàn)MAFLD的典型癥狀。進一步在HepG2細胞中敲降TMEM166，結(jié)果顯示，與C組相比，D組細胞內(nèi)的NEFA和TG水平顯著升高；同時用OA誘導(dǎo)高脂模型時，與E組相比，F(xiàn)組細胞內(nèi)的NEFA和TG水平顯著升高，脂滴數(shù)量明顯增加。這些結(jié)果提示，TMEM166缺失可促進肝臟細胞脂肪酸的攝取。

脂肪酸的攝入由CD36、脂肪酸結(jié)合蛋白（FAB-Ps）和脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（FATPs）協(xié)同完成。在肝細胞內(nèi)，長鏈脂肪酸（LCFA）首先被位于細胞膜上的CD36攜帶進入細胞中，再由FABPs結(jié)合和FATPs轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體，進行脂質(zhì)的合成或 β 氧化。其中，肝型脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP1）的表達水平與肝臟脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[9]，F(xiàn)ATP4和FATP5在肝臟中負責(zé)轉(zhuǎn)運 LCFA^[10] 。脂肪酸從血液中攝取到肝細胞主要取決于血液中脂肪酸的濃度和肝細胞的攝取能力兩個方面，而肝細胞攝取能力和轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)量呈正相關(guān)[11]。有研究表明，MAFLD患者肝臟中FATPs水平比正常人高 65%～85%^[12] 。脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白組織分布差異很大，F(xiàn)ATP2在肝臟和腎臟中高表達，而FATP5主要在肝臟中高表達，是肝臟特異性脂肪酸攝取的關(guān)鍵調(diào)控因子；肝臟特異敲除Fatp2基因能夠顯著降低小鼠肝細胞的脂肪酸攝取能力和肝臟內(nèi)的TG水平[13] Fatp5^-/- 小鼠肝細胞對LCFA攝取能力下降 45%～50%^[14]

此外，CD36作為脂肪酸攝取過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，與MAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，MAFLD患者和高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD模型小鼠肝臟中CD36水平均顯著上調(diào)[4-5]，而肝細胞特異性敲除Cd36的小鼠表現(xiàn)為肝臟脂肪酸攝取減少和肝脂肪變性癥狀緩解[15]。本研究的結(jié)果顯示，與A組小鼠相比，肝臟敲除Tmem166后，B組小鼠肝臟中CD36、FABP1、FATP5和FATP4的表達顯著上調(diào)。與C組相比，敲降TMEM166后，D組細胞中CD36、FABP1、FATP5和FATP4的表達顯著上調(diào)；在OA刺激下，與E組相比，敲降TMEM166后，F(xiàn)組細胞中上述指標(biāo)水平均顯著上調(diào)。而敲降CD36后，與G組相比，H組細胞中NEFA和TG水平顯著降低，脂滴數(shù)量顯著減少。這些結(jié)果表明，TMEM166對肝細胞在生理狀態(tài)下以及高脂肪酸負荷條件下的脂肪酸攝取功能均具有負調(diào)控作用，TMEM166的缺失促進了脂肪酸轉(zhuǎn)運相關(guān)因子的表達，敲降CD36可逆轉(zhuǎn)由TMEM166缺失所引起的脂肪酸攝取增強和脂滴積累，提示TMEM166通過調(diào)控CD36的表達調(diào)節(jié)肝臟細胞對脂肪酸的攝取，從而參與肝臟脂肪代謝穩(wěn)態(tài)的維持。

PPARγ是核激素受體超家族的成員之一，包括γ1、γ2、γ3和γ4四種亞型。在OA誘導(dǎo)的肝細胞或高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD模型小鼠肝臟中，PPARγ表達上調(diào)[16]，可以通過調(diào)節(jié)脂肪酸攝取相關(guān)因子（CD36和FATP家族）以及脂肪酸合成相關(guān)因子（SREBP1和SCD1）的表達調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[17]。近期有研究表明，PPARγ拮抗劑GW9662可以通過抑制PPARγ-CD36通路以減輕肝脂肪變性，從而緩解MAFLD的進展[18]。此外，mTORC1-PPARγ2信號通路可能介導(dǎo)了TMEM166對CD36的調(diào)控和肝細胞脂肪酸攝取的功能，并且已經(jīng)有前期研究證實了TMEM166 能夠負向調(diào)控mTORC1的活性[19]；mTOR-PPARγ信號通路參與胃饑俄素對小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)控，抑制mTOR-PPARγ信號通路的活化可減輕小鼠的高脂血癥和肝脂肪變性[20]。研究表明，肥胖患者脂肪組織中PPARγ2的表達顯著上調(diào)，且與胰島素抵抗密切相關(guān)[21]。在高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD模型小鼠肝臟中，PPARγ2表達特異性上調(diào)，而PPARγ1表達保持不變[22]。本研究中實驗結(jié)果顯示，在小鼠肝臟組織以及HepG2細胞中，TMEM166的缺失均促進了PPARγ2mRNA表達水平的上調(diào)，提示PPARγ2可能介導(dǎo)TMEM166對CD36和FATPs的調(diào)控，繼而引發(fā)肝臟細胞脂質(zhì)攝取代謝紊亂。

CD36的棕櫚酰化對于細胞的脂質(zhì)攝取至關(guān)重要[23]。在巨噬細胞中，氧化高密度脂蛋白可通過CD36的棕櫚?；{(diào)節(jié)脂質(zhì)攝取。在肝細胞中，硒蛋白K促進CD36的棕櫚?；瘜⑵湔系紺OPI囊泡中，從而將CD36從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)礁郀柣w，在高爾基體被棕櫚?；窪HHC4修飾加工后再運到細胞膜，發(fā)揮脂肪酸轉(zhuǎn)運酶的功能。抑制棕櫚?；蓽p少CD36與COPⅡ的共定位，改善肝脂肪變性[24]。TMEM166是否調(diào)控CD36的棕櫚?；?，進而調(diào)控脂肪酸攝取，有待后續(xù)進一步研究。

綜上所述，TMEM166表達下調(diào)可上調(diào)CD36表達，進而促進肝臟細胞脂肪酸攝取和脂滴積累，從而影響肝臟中脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)；TMEM166對CD36的調(diào)控機制可能與PPARγ2的激活有關(guān)。本研究有望為MAFLD發(fā)病機制的解析提供新的理論依據(jù)。

倫理批準(zhǔn)和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學(xué)青島醫(yī)學(xué)院倫理委員會的審核批準(zhǔn)（文件號QDU-AEC-2024786）。所有實驗過程均遵照科技部《實驗動物管理條例》進行。作者聲明：李連輝、李寧、臧開來參與了研究設(shè)計；李連輝、李寧、楊迪、孫亞妮和杜啟源參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

［參考文獻]

[1] GOFTONC，UPENDRANY，ZHENGMH，etal.MAFLD： How is it different from NAFLD？ [J]. Clin Mol Hepatol， 2023，29（Suppl）：S17-S31.

[2] MARTINC，CHEVROT M，POIRIER H，et al. CD36 as a lipid sensor[J].Physiol Behav，2011，105（1） ：36-42.

[3] YANG YX，LIUXK，YANGD，et al. Interplay of CD36， autophagy，and lipid metabolism： Insights into cancer progression[J].Metabolism，2024，155：155905.

[4]ZENG H，QIN H，LIAO M，et al. CD36 promotes de novo lipogenesis in hepatocytes through INSIG2-dependent SREBP1 processing[J]. Mol Metab，2022，57：101428.

[5]ZHENG EZ，CHENQ Q，XIAO A H，et al. Systemic loss of CD36 aggravates NAFLD-related HCC through MEK1/2- ERK1/2 signaling pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun，2024，707：149781.

[6]LI J，ZOUB Y，YEO Y H，et al.Prevalence，incidence，and outcome of non-alcoholic fatty liver disease in Asia，1999- 2019：A systematic review and meta-analysis[J].Lancet Gastroenterol Hepatol，2019，4（5）：389-398.

[7] PIPITONE R M，CICCIOLI C，INFANTINO G，et al. MAFLD：A multisystem disease[J]. Ther Adv Endocrinol Metab，2023，14：20420188221145549.

[8] VANDENBERGEH，F(xiàn)LORES-GUERREROJL，GRUPPEN EG，et al.Non-alcoholic fatty liver disease and risk of incident type 2 diabetes：Role of circulating branched-chain amino acids[J].Nutrients，2019，11（3）：705.

[9]WANG G Q，BONKOVSKY H L，DE LEMOS A，et al. Recent insights into the biological functions of liver fatty acid binding protein 1[J].JLipid Res，2015，56（12）：2238-2247.

[10]LIN M H，KHNYKIN D. Fatty acid transporters in skin development，function and disease[J].Biochim Biophys Acta， 2014，1841（3）：362-368.

[11]KAWANO Y，COHEN D E. Mechanisms of hepatic triglyce ride accumulation in non-alcoholic fatty liver disease[J]. JGastroenterol，2013，48（4） ：434-441.

[12] POHL J，RING A，HERMANN T，et al. Role of FATP in parenchymal cell fatty acid uptake[J]. Biochim Biophys Acta， 2004，1686（1-2） ：1-6.

[13] FALCON A，DOEGE H，F(xiàn)LUITT A，et al. FATP2 is a hepatic fatty acid transporter and peroxisomal very long-chain acy-l-CoA synthetase[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2010，299（3） ：E384-E393.

[14]DOEGE H，BAILLIE R A，ORTEGON A M，et al. Targeted deletion of FATP5 reveals multiple functions in liver metabolism：Alterations in hepatic lipid homeostasis[J]. Gastroenterology，2006，130（4）：1245-1258.

[15]CLUGSTON R D，YUENJJ，HU Y Y，et al. CD36-deficient mice are resistant to alcohol- and high-carbohydrate-induced hepatic steatosis[J].J Lipid Res，2014，55（2）：239-246.

[16] MAGLIANO D C， BARGUT T C L，DE CARVALHO S N， etal.Peroxisome proliferator-activated receptors-alpha and gamma are targets to treat offspring from maternal diet-induced obesity in mice[J]. PLoS One，2013，8（5）：e64258.

[17]YU H Y，YANG F， ZHONG W T， et al. Secretory Galectin-3 promotes hepatic steatosis via regulation of the PPARγ/CD36 signaling pathway[J]. Cell Signal， 2021，84：110043.

[18] XIAO J， XIANG H Y， XIANG H Y， et al. GW9662 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis by inhibiting the PPARY/ CD36 pathway and altering the gut microbiota[J]. Eur J Pharmacol，2023，960：176113.

[19] LIU X K， GAO X， YANG Y L， et al. EVA1A reverses lenvatinib resistance in hepatocellular carcinoma through regulating PI3K/AKT/p53 signaling axis[J]. Apoptosis， 2024，29（7-8）： 1161-1184.

[20] LI Z R，XU G Y，QIN Y，et al. Ghrelin promotes hepatic lipogenesis by activation of mTOR-PPARy signaling pathway [J].Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（36）：13163-13168.

[21] HE W M. PPARγ2 polymorphism and human health[J]. PPAR Res，2009，2009：849538.

[22] MEDINA-GOMEZ G，GRAY S L，YETUKURI L，et al. PPAR gamma 2 prevents lipotoxicity by controlling adipose tissue expandability and peripheral lipid metabolism[J]. PLoS Genet，2007，3（4） ：e64.

[23]HAO JW，WANG J，GUO HL，et al. CD36 facilitates fatty acid uptake by dynamic palmitoylation-regulated endocytosis [J]. Nat Commun，2020，11（1） ：4765.

[24]YOU MY，WU F，GAO ML，et al. Selenoprotein K contributes to CD36 subcellular trafficking in hepatocytes by accelerating nascent COP I vesicle formation and aggravates hepatic steatosis[J]. Redox Biol，2022，57：102500.

（本文編輯李京蔓厲建強）