不同金桔果皮提取物對斑馬魚幼魚的急性毒性分析

摘要：【目的】金桔（Fortunella crassifolia Swingle）是全果食用型柑橘，營養(yǎng)豐富，且具有藥用價值。廣西是中國最大的金桔產(chǎn)區(qū)，但主栽品種滑皮金桔、脆蜜金桔、油桔的果皮高值化利用率不高。本研究擬通過開展金桔成熟果實果皮提取物對不同發(fā)育時段斑馬魚幼魚的特異性安全評價，為金桔果皮功能性食品開發(fā)和副產(chǎn)物高值化利用提供技術支撐。【方法】以滑皮金桔（HP）、脆蜜金桔（CM）、油桔（YJ）的成熟果實為研究材料，采用微波提取法獲得其果皮乙醇提取物。利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型[ T_g （fabpla：dsRed；ela3l：GFP）]建立動態(tài)發(fā)育毒性評價體系，將受精后 48h 、 ^72h 、 96h 、 120h 的斑馬魚幼魚分別在不同金桔果皮提取物溶液中處理 48h ，然后通過計算斑馬魚幼魚的死亡率評估3種提取物對斑馬魚幼魚的安全濃度（ 0.1LC₅₀ ）與亞致死濃度（ 0.5LC₅₀ ）。最后整合斑馬魚體長、肝臟熒光定量（面積/強度）等多參數(shù)聚類分析評估3種提取物對斑馬魚的毒性效應?！窘Y(jié)果】1）3種金桔果皮提取物對不同發(fā)育時段斑馬魚幼魚的半致死濃度值（ LC₅₀ ）順序分別為：對于受精后 48h 的幼魚，以滑皮金桔果皮提取物（ 374μg/mL ） lt; 油桔果皮提取物（ 595μg/mL ）lt;脆蜜金桔果皮提取物中 699μg/mL ）；對于受精后72h的幼魚，以滑皮金桔果皮提取物（ 312μg/mL ）lt;油桔果皮提取物 643μg/mL ）lt;脆蜜金桔果皮提取物（ 652μg/mL ）；對于受精后 96h 的幼魚，以滑皮金桔果皮提取物（ 340μg/mL ） lt; 油桔果皮提取物（ 755μg/mL ） lt; 脆蜜金桔果皮提取物（ 795μg/ mL）；對于受精后 120h 的幼魚，以滑皮金桔果皮提取物（ 597μg/mL ）lt;油桔果皮提取物（787μg/mL ） ∠ 脆蜜金桔果皮提取物（ 926μg/mL ）?？梢姡嗝劢鸾酃ぬ崛∥锞C合安全性最高。2）與對照相比，3種金桔果皮提取物在安全濃度（ 0.1LC₅₀ ）下對斑馬魚幼魚無發(fā)育毒性，體長無顯著差異（ Pgt;0.05） ）、肝臟結(jié)構正常且無畸形。3）油桔果皮提取物在亞致死濃度（0.5LC₅₀ ）時可對受精后 72h 的斑馬魚誘發(fā)可逆性肝細胞水腫，但未見病理損傷?！窘Y(jié)論】廣西金桔果皮在安全濃度（ [0.1LC₅₀ ）下對脊椎動物發(fā)育無不良影響，推薦高安全品種脆蜜金桔用于嬰幼兒食品等高敏感產(chǎn)品的開發(fā)。

中圖分類號：S666.1 文獻標志碼：A

Analysis of Acute Toxicity of Different Kumquat Peel Extracts on Zebrafish Larvae

DENG XiaoHong，TAN XiaoHui，LONG LingYun，MAO LiYan， HUANG QiuLan，HUANG QiuWei* （Guangxi Subtropical Crops Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Quality and Safety Control for Subtropical Fruits，Nanning，Guangxi 53ooo1，China）

Abstract： 【Objective】Fortunella crassifolia Swingle （kumquat） is a citrus fruit that could be eaten wholly，with rich nutrients and medicinal value. Guangxi is the largest kumquat production area in China，but the high-value utilization rate are low for the main kumquat cultivars，Huapi kumquat， Cuimi kumquat and Youju kumquat. This study aimed to evaluate the specific safety of kumquat fruit peel extracts on zebrafish larvae at different developmental stages，so as to provide technical support for the development of functional food and high value utilization of by-products. 【Method】Mature fruits of Huapi kumquat （HP），， Cuimi kumquat （CM），and Youju kumquat （YJ） were used as materials to obtain ethanol extracts from their lyophilized peels using microwave extraction. A developmental toxicity assessment system was established using transgenic zebrafish model [Tg（fabpIa：dsRed;ela3l：GFP）] .Theembryosat48，72，96，and 120h post fertilization （hpf） were exposed to kumquat peel extracts for 48h .The safe concentration （0.1LC₅₀ ）and sublethal concentration（ 0.5LC₅₀ ）ofeach extractweredeterminedbasedon zebrafish fryfatality.The toxicity effects of the three extracts on zebrafish were evaluated by cluster analysis based on multivariate indicators including zebrafish body length and liver fluorescence quantification （area/ intensity）.【Result】1）The orders of median lethal concentrations（ LC₅₀ ）of the 3 kumquat peel extracts on zebrafish larvae at 48h post exposure treatment were as follows： Huapi kumquat peel extract （374μg/mL ） lt; Youju kumquat peel extract （ 595μg/mL ） lt; Cuimi kumquat peel extract （ 699μg/mL ） at48hpf;Huapi kumquat peel extract （ 312μg/mL ） lt; Youju kumquat peel extract （ 643μg/mL）lt; Cuimi kumquat peel extract （ 652μg/mL ）at 72 hpf；Huapi kumquat peel extract （ 340μg/mL）lt; Youju kumquat peel extract （755μg/mL ） ? Cuimi kumquat peel extract 795μg/mL ）at96hpf; Huapi kumquat peel extract （ 597μg/mL ） lt; Youju kumquat peel extract （ 787μg/mL ） lt; Cuimi kumquat peel extract （ 795μg/mL ） at120 hpf. Obviously，the Cuimi kumquat peel extract showed the highest safety.2）Compared with control（CK），at safe concentrations （0.1LC₅₀ ），all the3extracts showed no developmental toxicity，evidenced by unchanged body length （ Pgt;0.05 ）and normal hepatic morphology without deformity.3）The treatment at 0.5LC₅₀ to Youju kumquat peel extract induced reversible hepatocyte edema in the larvae of 72hpf ，but no pathological damage was found.【Conclusion】 Peel of kumquats cultivated in Guangxi has no adverse effects on vertebrate development at scientifically defined safe thresholds （0.1LC₅₀） ），and the highly safe cultivar， Cuimi kumquat，is recommended to be used for developing infant food and other highly sensitive products.

Keywords： Kumquat； peel safety； dependency at developmental stages； zebrafish toxicityassessment；cultivar variation；value-added utilization

0 引言

【研究意義】金桔（FortunellacrassifoliaSwing-le），又名金柑，是蕓香科柑橘屬植物，作為全果食用型柑橘，其果皮富含黃酮類、維生素C等生物活性物質(zhì)（WANGetal.，2008；王治元等，2010；王秀蓉等，2014；李麗等，2015），具有顯著的食藥用價值。廣西作為全國最大的金桔產(chǎn)區(qū)（莫星煜等，2021；林益群，2024），隨著滑皮金桔、脆蜜金桔等新品種推廣種植，金桔產(chǎn)量激增，但因缺乏針對不同栽培品種的系統(tǒng)毒理學評價，導致金桔高值化利用率不高，嚴重制約了高附加值金桔產(chǎn)品如嬰幼兒食品開發(fā)。研究不同金桔品種果皮提取物的毒性可為金桔栽培品種篩選和副產(chǎn)物加工利用開發(fā)提供毒理學理論支撐?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，金桔果皮提取物具有顯著的抗氧化活性，能有效清除2，2-聯(lián)苯基-1-苦基腫基（DPPH）自由基；對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出抑制效果（AL-SAMANetal.，2019）。此外，金桔乙醇提取物通過過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）通路顯著改善高脂膳食誘導的小鼠代謝綜合征，降低血清總膽固醇和肝臟甘油三酯水平（譚颶，2016）。盡管金桔的生物活性研究已經(jīng)較為深入，但其品種間毒理學差異仍不明晰。在毒理評價模型方面，斑馬魚（Daniorerio）因其胚胎透明、器官發(fā)育保守性與哺乳動物高度相似，已成為化合物毒性測試的重要模式動物（ALURUetal.，2013；BAILEYetal.，2013;LIet al.，2020a； TANG et al.，2022；LI et al.，2023a）。其肝臟在功能與結(jié)構上具有哺乳動物同源性，通過轉(zhuǎn)基因品系可實時監(jiān)測肝臟發(fā)育動態(tài)（OBERetal.，2006；WANGetal.，2017）。研究證實該模型在解析外源物質(zhì)肝毒性機制方面具有獨特優(yōu)勢（COLLARDetal.，2018；LIetal.，2023b）。【本研究切入點】目前，金桔提取物安全性研究基礎較為薄弱，特別是對哺乳動物的毒性研究較少?！緮M解決的關鍵問題】本研究以斑馬魚肝臟熒光標記轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚為模式動物，探究不同金桔品種果皮提取物安全濃度和亞致死濃度下對斑馬魚幼魚早期肝臟發(fā)育的影響，為金桔果皮功能性食品開發(fā)和副產(chǎn)物高值化利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：供試金桔品種為廣西柳州市融安縣主栽的滑皮金桔（F.crassifolia SwingleHuapi）、脆蜜金桔（F.crassifoliaSwingleCuimi）和油桔（F.crassifoliaSwingleYouju）。實驗動物采用國家斑馬魚資源中心（ChinaZebrafishResourceCenter，CZRC）的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系 Tg （fabpla：dsRed;ela3l：GFP），其肝臟組織特異性表達紅色熒光蛋白（DsRed），胰腺組織表達綠色熒光蛋白（GFP）。斑馬魚培養(yǎng)條件：室溫（ 26±0.5 ） °C ，水溫（ 28±0.5 ） °C ， pH7.5 ，電導率 500μS/cm ，光周期 14L ： 10D （光照強度 800lx） ，每天9：00與15：00定量投喂豐年蝦（Artemiasalina）。實驗試劑：無水乙醇（AR， ?99.7% 、氯化鈣（ CaCl₂ ，AR）、氯化鈉（NaCl，AR）、氯化鉀（KCI，AR）、硫酸鎂（ MgSO₄ ，AR）、三卡因（tricainemethanesulfonate）及甲基纖維素（metho-celA4M），均購自南寧市因信科技產(chǎn)品經(jīng)營部；斑馬魚胚胎培養(yǎng)液（內(nèi)含0.4mmol/L CaCl₂ 、5mmol/LNaCl、0.17mmol/LKCl、 0.16mmol/L MgSO₄ ，用純水配制）。

1.2 主要儀器

MCR-3S常壓微波反應萃取儀（鄭州市亞榮儀器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣生物實驗設備有限公司）；SZ680體視顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）；MF31-M熒光生物顯微鏡（廣州明美光電技術有限公司）；LRH-250-S恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學儀器股份有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 金桔材料預處理

成熟金桔果實經(jīng)自來水清洗干凈后，將金桔果實沿赤道面橫切為兩半，使用無菌解剖匙沿切面的皮肉交界處旋轉(zhuǎn)一圈將果皮和果肉分離。所得果皮組織經(jīng)自來水清洗去除表面雜質(zhì)，按料液比1：6（g：mL）的比例加入（ 70±2 ） ^°C 超純水，并置于滅菌鍋中進行蒸氣熱處理（ 70^°C ， ^1h ，常壓），之后將果皮撈出置于自來水中搓洗去除殘余果肉，果皮清洗后置于（ 60±1 ） ^°C 烘箱中干燥 8h 經(jīng)粉碎機粉碎后過20目篩?；そ鸾郏℉P）、脆蜜金桔（CM）果皮粉末按1：2（ g：mL 、油桔（YJ）果皮粉末按1：6（ g：mL ）加入石油醚，室溫靜置提取 24h 以脫去大部分脂肪，抽濾后將濾渣進行二次干燥（ 60^°C ， ^4h ，常壓），獲得脫脂果皮粉末。

1.3.2 不同金桔果皮提取物提取與提取液配制

稱取 45.0g 脫脂果皮粉末，按照1：20（ g：mL ）的料液比加入 50% （v/v）乙醇溶液，于微波反應儀中進行動態(tài)回流工（ 80±1 ） °C ， 30min. 后趁熱抽濾，濾液靜置冷卻析出果膠雜質(zhì)，將液體于 10000r/min 轉(zhuǎn)速下常溫離心 10min ，收集上清液進行抽濾，獲得粗提取液。提取液經(jīng)真空濃縮至可溶性固形物含量為 10% 左右，最后將濃縮液冷凍干燥研磨后獲得果皮提取物凍干粉。分別準確稱取HP果皮提取物凍干粉末（ 2.20g? 、CM果皮提取物凍干粉末（ 5.04g） 、YJ果皮提取物凍干粉末 （4.12g） ，置于 100mL 燒杯中，每種提取物粉末均加入 20mL 純水超聲溶解，記錄不同金桔品種果皮提取物溶液的初始濃度（HP： 110mg/mL ; CM：252mg/mL ；YJ： 206mg/mL） 。吸取一定體積的提取物配制成工作母液（ 10mg/mL ）， 4^°C 備用。

1.3.3 實驗設計

用定時交配法獲取斑馬魚同步化胚胎，于實驗前一日16：00將性成熟斑馬魚按雌雄比1：1分置于配種缸（配種隔離板分隔），次日9：00移除隔離板誘導產(chǎn)卵。受精卵于16：00收集后，經(jīng)體視顯微鏡篩選正常發(fā)育胚胎，置于含胚胎培養(yǎng)液（配方見1.1）的玻璃培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)箱[（ 28±0.5） 0 °C ，光周期 14L ：10D］內(nèi)孵化至目標發(fā)育時段?；陬A實驗結(jié)果，設立以下處理組：（1）空白對照組（CK）：胚胎培養(yǎng)液 （0μg/mL） （2）HP果皮提取物處理組：50、100、150、250、350、600、800、 1000μg/mL 梯度濃度；（3）CM果皮提取物處理組：100、200、300、400、600、800、 1000μg/mL 梯度濃度；（4）YJ果皮提取物處理組：100、200、300、400、600、800、 1000μg/ mL梯度濃度。各濃度組溶液采用胚胎培養(yǎng)液梯度稀釋提取物溶液（HP果皮提取物 110mg/mL 、CM果皮提取物 252mg/mL 、YJ果皮提取物 206mg/ mL）制備。取48、72、96、120hpf（受精后小時數(shù)hourspost fertilization，hpf）健康幼魚，隨機分配至24孔板（10尾/孔），每處理組設3個生物學重復。金桔果皮提取物體積2mL/孔，于 28^°C 恒溫培養(yǎng)箱處理 48h 。

1.3.4不同金桔果皮提取物處理對斑馬魚急性毒性效應評估

取胚胎發(fā)育48、72、96、120hpf這4個時段的幼魚按照1.3.3的方法處理48h后，分別統(tǒng)計各處理組幼魚的死亡率（死亡判定標準：體色變白、心搏停止且觸碰無逃避反應），并通過處理濃度梯度和相對應死亡率進行非線性曲線擬合求出果皮提取物處理48h致半數(shù)斑馬魚死亡的濃度值（ LC₅₀ ）（冉凱凱等，2022）。

1.3.5不同金桔果皮提取物處理對斑馬魚體長發(fā)育評估

基于處理48h半致死濃度（ LC₅₀ ）測定結(jié)果，設置空白對照組（CK，胚胎培養(yǎng)液）及2個濃度處理組（安全濃度組： 0.1LC₅₀ ；亞致死濃度組：0.5LC₅₀ ）。按照1.3.3的方法，對48、72、96、120hpf4個發(fā)育時段的幼魚分別進行48h連續(xù)處理后，每組隨機選取10尾健康幼魚進行形態(tài)學分析。樣本處理流程如下：將經(jīng)過提取物溶液處理的幼魚浸入 0.1% 的三卡因溶液麻醉30s后迅速轉(zhuǎn)移至載玻片上，用濾紙吸干魚周圍多余液體，馬上滴 0.5mL 2.5% 甲基纖維素溶液形成透明凝膠層固定魚體，將載玻片置于體視顯微鏡載物臺上，調(diào)整顯微鏡焦距和魚體位置至可以觀察到清晰且完整的魚體側(cè)位并拍照。測量處理48h的幼魚體長（從吻端沿魚體背中線至尾鰭末端的長度）。

1.3.6 不同金桔果皮提取物處理的斑馬魚肝臟觀察

實驗濃度設置與體長發(fā)育評估體系一致，每組隨機選取10尾幼魚進行肝臟原位熒光檢測。用0.1% 的三卡因溶液輕微麻醉幼魚，再用 0.5mL 2.5% 甲基纖維素溶液將斑馬魚固定于載玻片上，然后將載玻片置于熒光生物顯微鏡載物臺上，調(diào)整顯微鏡焦距、熒光光源和魚體位置至可以觀察到清晰肝臟熒光（DsRed通道，Ex/Em： 558/583nm ）的魚體側(cè)位并拍照。使用ImageJ閾值分析模塊分割肝臟熒光區(qū)域，計算單位面積熒光強度及熒光投影面積，評估不同金桔果皮提取物對斑馬魚肝臟發(fā)育的影響。

1.4 統(tǒng)計分析

毒理參數(shù)計算：采用OriginPro2024b軟件進行非線性曲線擬合，計算各發(fā)育時段LC ₅₀ 值。生物指標統(tǒng)計：應用SPSS19.0進行單因素方差分析（One-wayANOVA），組間差異采用Tukey'sHSD檢驗，數(shù)據(jù)以均值 ± 標準誤表示。圖像處理：體長指標和熒光指標的測量通過ImageJ軟件來計算；其余作圖通過OriginPro2024來繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1不同金桔果皮提取物對斑馬魚幼魚的毒性效應

如圖1所示，斑馬魚幼魚在不同發(fā)育時段對金桔果皮提取物的毒性響應差異顯著。當處理濃度?250μg/mL HP果皮提取物、 ?600μg/mL CM果皮提取物和 ?400upmug/mL YJ果皮提取物時，48、96、120hpf幼魚均未觀測到致死效應，其濃度一死亡率效應曲線在此閾值前完全重合（ R²=0.999 。超過臨界濃度后，各發(fā)育時段效應曲線出現(xiàn)顯著分離（圖1）。值得注意的是，72hpf幼魚對金桔果皮提取物表現(xiàn)出更高的敏感性，HP果皮提取物濃度?150μg/mL 、CM果皮提取物與YJ果皮提取物濃度?300μg/mL 時即表現(xiàn)出致死效應。該時段的濃度一死亡率效應曲線擬合度相對降低，部分數(shù)據(jù)點偏離理論曲線（HP果皮提取物 R²=0.998 ，CM果皮提取物 R²=0.998 ，YJ果皮提取物 R²=0.999 ），提示此發(fā)育時段可能存在非線性毒性動力學特征。通過擬合曲線求出3個金桔品種果皮提取物對4個發(fā)育時段的處理48h的半致死濃度（ LC₅₀ ）（見表1）順序分別為：對于48hpf的幼魚，以HP果皮提取物（204 （374μg/mL ） Φ

2.2不同金桔果皮提取物對斑馬魚形態(tài)發(fā)育的影響

基于處理48h的半致死濃度（ LC₅₀ ）的濃度一死亡率效應關系，本研究設定 0.1LC₅₀ （安全濃度）和 0.5LC₅₀ （亞致死濃度）2個處理劑量（表1）進行形態(tài)學評價。

形態(tài)學觀察顯示（圖2），在 0.1LC₅₀ 和 0.5LC₅₀ 濃度下，3個品種金桔果皮提取物處理48h均未引起48～120hpf斑馬魚幼魚顯著畸形表型。所有處理組幼魚均保持完整的腦室結(jié)構、正常心包形態(tài)（未見心包水腫）、線性脊柱發(fā)育及功能性魚，表明在本實驗濃度范圍內(nèi)果皮提取物未造成器官發(fā)育毒性。體長測量數(shù)據(jù)（圖3）進一步揭示劑量依賴性效應：（1）安全濃度組（ ?0.1LC₅₀? ，各發(fā)育時段（48、72、96、 120hpf） 斑馬魚體長與對照組（CK）無統(tǒng)計學差異（ （Pgt;0.05） ，提示該濃度

下果皮提取物對幼魚生長速率無顯著抑制。（2）亞致死濃度組（ 0.5LC₅₀"）中，HP果皮提取物處理在所有發(fā)育時段的體長與CK組相比均未達到顯著差異（ （Pgt;0.05） ；CM果皮提取物處理時， 48hpf 與72hpf幼魚體長顯著低于CK組（ ?Plt;0.05） ，而96、120hpf階段未檢測到生長抑制；YJ果皮提取物處理時，48hpf幼魚體長較CK組降低（ ?Plt; 0.05），而120hpf階段出現(xiàn)反常增長，72、96hpf階段無顯著變化。上述結(jié)果表明，HP果皮提取物在0.5LC₅₀"劑量下未表現(xiàn)發(fā)育毒性，而CM果皮提取物和YJ果皮提取物則分別對早期（48、72hpf）和特定發(fā)育節(jié)點（48、120hpf）的斑馬魚體長產(chǎn)生顯著影響，提示品種特異性毒性效應可能與發(fā)育時段敏感性相關。

2.3不同金桔果皮提取物對斑馬魚肝臟發(fā)育的影響

2.3.1 肝臟形態(tài)學定量分析

為了探究不同金桔果皮提取物對斑馬魚肝臟發(fā)育的影響，利用 Tg （fabpla：dsRed;ela3l：GFP）魚系開展了3種金桔果皮提取物對斑馬魚肝臟發(fā)育毒性的研究。通過肝臟形態(tài)學觀察（圖4）與熒光面積對比（圖5）發(fā)現(xiàn)，HP與CM果皮提取物在 0.1～0.5LC₅₀ 濃度內(nèi)，對48～120hpf幼魚肝臟面積無顯著影響（ Pgt;0.05） 。YJ果皮提取物用于處理72hpf幼魚時， 0.1LC₅₀ 與 0.5LC₅₀ 濃度使肝臟面積增加。所有處理組幼魚肝臟均保持正常解剖結(jié)構，未出現(xiàn)形態(tài)畸變或異位增生（圖4）。胰腺綠色熒光空間分布與對照組一致，表明提取物處理未引發(fā)肝臟一胰腺的發(fā)育紊亂。值得注意的是，YJ果皮提取物 0.5LC₅₀ 處理72hpf幼魚時，肝臟體積增大伴隨肝實質(zhì)細胞排列疏松，提示可能存在可逆性肝細胞水腫。

2.3.2不同金桔果皮提取物對斑馬魚肝臟熒光強度的影響

基于熒光強度密度分析（熒光總強度/熒光面積），不同品種金桔果皮提取物對斑馬魚幼魚肝細胞分布密度呈現(xiàn)發(fā)育時段特異性影響（圖6）。在72～120hpf發(fā)育時段，CM與YJ的果皮提取物處理組（ 0.1LC₅₀ ， 0.5LC₅₀ ）幼魚的肝臟熒光強度與對照組（CK）無統(tǒng)計學差異 （Pgt;0.05） 。值得注意的是，HP果皮提取物處理72hpf幼魚時，熒光強度較CK組顯著升高（ ?Plt;0.05） ，但在后續(xù)發(fā)育時段（204號 （96～120hpf） 未觀察到顯著改變。對48hpf早期幼魚的檢測發(fā)現(xiàn)，HP與YJ的果皮提取物處理組呈現(xiàn)劑量依賴性雙相效應： 0.1LC₅₀ 濃度下熒光強度較CK組分別升高 23.5% 和 17.2% （ Plt;0.05） ，而0.5LC₅₀ 濃度時回落至基線水平（ Pgt;0.05） 。CM果皮提取物則顯示濃度正相關效應， 0.5LC₅₀ 處理組熒光強度較CK組顯著增加（ Plt;0.05， 。此現(xiàn)象提示金桔提取物可能影響早期發(fā)育時段肝的細胞增殖。

2.4多參數(shù)聚類分析

基于安全濃度（ 0.1LC₅₀ ）處理48h后，對4個發(fā)育時段（ 48～120hpf） 斑馬魚幼魚的體長及肝臟熒光參數(shù)（強度與面積）進行標準化處理，以對照組（CK）數(shù)據(jù)為基準（設定相對值 _?=1.000 ，采用歐氏距離（euclideandistance）構建層次聚類熱圖（圖7）。如圖7所示，可將4個發(fā)育時段斑馬魚按3種果皮提取物處理48h的安全濃度和CK分成4類，其中CK組幼魚和3種果皮提取物處理 120hpf 幼魚歸為一類；CM果皮提取物處理48hpf幼魚和HP果皮提取物處理72hpf幼魚歸為一類；CM和YJ的果皮提取物處理72hpf幼魚和3種金桔果皮提取物處理96hpf幼魚歸為一類；HP和YJ的果皮提取物處理48hpf幼魚歸為一類。由分類結(jié)果來看，在3種金桔果皮提取物安全濃度48h處理下，96hpf和120hpf幼魚同一個發(fā)育期的魚都能聚在同一類，且處理后 120hp f幼魚與CK組幼魚能聚為一類，表明安全濃度下金桔果皮提取物48h處理對120hpf幼魚影響最??；而48hpf和72hpf這些發(fā)育前期的幼魚會因果皮提取物不同而分散，同一發(fā)育時段的魚不能聚在同一類。從與CK組聚類距離來判別，3種金桔果皮提取物48h的 0.1LC₅₀ 處理對同一發(fā)育時段幼魚體長和肝臟發(fā)育影響強弱，依次為48hpf幼魚（YJ果皮提取物 gt;HP 果皮提取物 gt;CM 果皮提取物）、72hpf幼魚（YJ果皮提取物 gt;CM 果皮提取物 HP果皮提取物）、96hpf幼魚（CM果皮提取物gt;YJ果皮提取物gt;HP果皮提取物）、 120hpf （YJ果皮提取物gt;CM果皮提取物gt;HP果皮提取物）。

3 討論

3.1金桔果皮提取物毒性效應的種質(zhì)特異性

柑橘屬的水果被認為是生物活性化合物如維生素、類胡蘿卜素、纖維和酚類化合物等的健康來源（BOCCOetal.，1998；GORINSTEINetal.，2001；YANGetal.，2011），但對金桔類果實果皮提取物的安全性研究尚未見報道。本研究首次系統(tǒng)揭示了滑皮金桔（HP）、脆蜜金桔（CM）、油桔（YJ）3個金桔品種果皮提取物對斑馬魚幼魚的急性毒性差異，其 LC₅₀ 值排序為：HP果皮提取物

3.2不同發(fā)育時段斑馬魚幼魚的毒性響應機制

本研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚幼魚對金桔果皮提取物的敏感性存在顯著發(fā)育時段差異。72hpf幼魚在較低濃度處理下即出現(xiàn)死亡率升高。72hpf屬于斑馬魚胚胎發(fā)育的孵化期，此時胚胎開始突破卵膜進入自由游動階段，卵膜原本對胚胎具有物理保護作用，但孵化后幼魚直接暴露于提取物，導致防御屏障消失（KIMMELetal.，1995），可能是此階段較低濃度提取物即可引起幼魚死亡的原因。值得注意的是，120hpf幼魚在 0.5LC₅₀ 濃度處理下呈現(xiàn)體長顯著增加，可能是因為隨著孵化后幼魚經(jīng)過48h 的環(huán)境適應后對金桔果皮提取物的耐受性增強的緣故。

3.3 肝臟發(fā)育的生物標志物響應

肝臟是許多外源物質(zhì)毒害作用的重要靶器官（KENNON-MCGILLandMCGILL，2017；LIetal.，2020b ；LIUetal.，2023）。肝臟熒光標記轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，可以直觀地在熒光顯微鏡下觀察到外源物質(zhì)暴露下fabpla基因在肝臟表達的部位和表達量，從而表征肝臟可能的尺寸變化，以評估外源物質(zhì)對斑馬魚的肝臟毒性（LIetal.，2023a；XIAetal.，2020；李秋熳等，2025）。本研究利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型首次揭示了金桔果皮提取物對幼魚肝臟發(fā)育的階段性影響。安全濃度（ 0.1LC₅₀ ）下48hpf呦魚肝臟熒光強度顯著升高，提示果皮提取物中的特定成分可能通過激活肝細胞增殖相關通路促進肝臟發(fā)育（OBERetal.，2006）。其熒光面積未發(fā)生顯著改變且肝臟形態(tài)正常，表明該效應屬于生理性調(diào)節(jié)而非病理性改變。

3.4安全性評價的系統(tǒng)性啟示

本研究構建的多參數(shù)毒性評價體系表明，傳統(tǒng)LC5指標需結(jié)合器官特異性生物標志物進行綜合解析。聚類分析顯示YJ提取物在安全濃度下對早期發(fā)育時段（48～72hpf）幼魚的影響最為顯著，提示金桔食用安全評估應特別關注胚胎期及幼體期的暴露風險。盡管當前研究未檢測具體毒性成分，但急性毒性強度與果皮脫脂工藝殘留脂溶性物質(zhì)的相關性值得深入探究。

4結(jié)論

本研究通過系統(tǒng)評價HP果皮提取物、CM果皮提取物、YJ果皮提取物對斑馬魚幼魚的急性毒性效應，首次揭示了金桔品種特異性毒性強弱規(guī)律（HP果皮提取物 gt;YJ 果皮提取物gt;CM果皮提取物）及不同金桔果皮提取物處理下斑馬魚不同發(fā)育時段的差異特征。實驗表明，72hpf幼魚對毒性響應最為敏感，安全濃度（ 0.1LC₅₀ ）下金桔果皮提取物雖未顯著抑制幼魚體長發(fā)育，但油桔提取物可特異性誘導早期發(fā)育時段（48hpf）幼魚肝臟細胞增殖。研究結(jié)果為金桔果皮食用安全評估提供了關鍵毒理學數(shù)據(jù)，后續(xù)研究將結(jié)合成分組學解析毒性的物質(zhì)基礎，并針對敏感發(fā)育期建立差異化安全閾值標準。

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（責任編輯 謝紅輝）