基于萘酰亞胺的 Cu²⁺ 熒光探針的構(gòu)建及其應(yīng)用

中圖分類號：0657.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-0935（2025）07-01200-05

在自然界及生物體中存在著豐富的金屬離子，其中很多是維持人體功能正常運轉(zhuǎn)所必需的微量元素[1]。由于近年來工業(yè)生產(chǎn)中大量金屬鹽的使用，使土壤及水中富集了無法被降解的重金屬離子，對環(huán)境造成極大傷害。銅作為一種必需的微量元素，在很多生理過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，人體長時間接觸重金屬離子會引起慢性中毒和發(fā)育異常[2]銅缺乏會導(dǎo)致酶的活性大幅降低，也會造成骨骼發(fā)育異常進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[3-4]。另外，阿爾茨海默病和帕金森病以及心腦血管等疾病的發(fā)生概率與銅離子濃度呈線性關(guān)系[5-6]。因此，建立能夠高效檢測Cu²⁺ 的方法具有十分重要的意義。

常用的用于檢測重金屬離子的方法主要有原子吸收光譜法（AAS）[]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）[8]、紅外光譜法（FTIR）[9]、紫外光譜法（UV）[10]、電化學(xué)方法[11]等，這些方法都存在成本高、儀器復(fù)雜、耗時長等缺陷。近年來，熒光分析以其高靈敏度和動態(tài)成像等優(yōu)點成為檢測重金屬離子的重要方法[12-15]。萘酰亞胺是性能優(yōu)良的熒光團(tuán)，它因其具有較大的斯諾克位移、優(yōu)秀的熒光量子產(chǎn)率和易于結(jié)構(gòu)修飾的特點在有機(jī)熒光染料、光電轉(zhuǎn)換材料、熒光標(biāo)記及熒光分析、生物檢測及環(huán)境污染檢測等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[16-18]，目前已經(jīng)研發(fā)出基于萘酰亞胺的不同功能的熒光分子探針[19-23]。此類探針的靈敏度、水溶性和生物兼容性并不是很理想。WEI等[24]合成了一種可用于細(xì)胞中檢測 Cu²⁺ 的萘酰亞胺類熒光探針BHBD，其識別Cu²⁺ 的線性范圍為 0～25μmol?L^-1 、檢測限為0.48μmol?L^-1 。BHAT等[25]合成了一種可用于水溶液中識別 Cu²⁺ 的基于羅丹明的比色型熒光探針。其識別Cu²⁺ 的線性范圍為 1～4μmol?L^-1 ，檢測限為 4.59×10^{- 7}mol?L^-1 。因此，開發(fā)性能優(yōu)良的用于識別 Cu²⁺ 的萘酰亞胺類熒光探針是研究的熱點領(lǐng)域[26]。本研究以取代甲酰基的萘酰亞胺和肼基吡嗪為原料制備了熒光探針NYS。探針NYS響應(yīng) Cu²⁺ 后綠色熒光大幅猝滅。利用質(zhì)譜探究了NYS對 Cu²⁺ 的響應(yīng)機(jī)制。探針NYS被應(yīng)用于雞血中外源性 Cu²⁺ 的檢測以及細(xì)胞中 Cu²⁺ 的生物成像研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

3-甲酰基-4-羥基-N-丁基-1，8-萘二甲酰亞胺按ZHANG等[26方法合成，2-氯吡嗪、甲醇、N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸、冰醋酸、乙酸乙酯、二甲基亞砜（DMSO）、金屬硝酸鹽（ Ni²⁺ 、 Zn²⁺ 、 Ca²⁺ 、 Cd²⁺ ）Ag⁺ 、 Co³⁺ 、 Fe²⁺ 、 Ba²⁺ 、 Fe³⁺ 、 Cu²⁺ 、 Al³⁺ 、 Mg²⁺ 、Hg²⁺ 、 Pb²⁺ 、 Cr³⁺ ）（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、石油醚、乙醇（AR，阿拉丁試劑）。

1.2 材料與試劑

AR224CN電子天平（奧豪斯公司）； 6530Q-TOFLC/MC液-質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫公司）；AVANCE400MHz 核磁共振儀（BRUKER公司）；Lambda-900紫外分光光度計（安捷倫公司）；LS55熒光分光光度計（PerkinElmer公司）；SPX-260生化培養(yǎng)箱（云飛科技有限公司）；Starter3100/fpH計（奧豪斯有限公司）；AniView100動物活體成像儀（博鷺騰生物科技有限公司）；CarlZeissLSM900共聚焦顯微鏡（創(chuàng)誠致佳科技有限公司）。

1.3探針NYS的合成

1.3.1 中間體2-肼基吡嗪的合成

于 50mL 的燒瓶中加入2-氯吡嗪 0.23g （2mmol），水合肼 15mL ，無水乙醇 20mL ，加熱回流8h ，冷卻，抽濾，將粗品用無水乙醇重結(jié)晶，得白色粉末狀固體，收率為 59% 。中間體2-胖基吡嗪的合成路線如圖1。

1.3.2 探針NYS的合成

如圖2。于 50mL 燒瓶中加入3-甲?；?4-羥基-N-丁基-1，8-萘二甲酰亞胺 0.35g （ 1.2mmol ），2-肼基吡嗪 0.13g （ 1.2mmol ）和 20mL 冰醋酸加熱回流 ^9h ，有大量固體析出，抽濾，粗品經(jīng)柱分離（二乙/石油醚 ：=6：4 ）得黃色晶體。收率： 48% 。HR-MS（positive mode m/z ）for C₂₁H₁₉N₅O₃ [ NYS⁺H⁺]⁺ calcd：412.138 6， found： 412.1381 7。 ¹H NMR （DMSO- ?d₆. 400MHz ） δ （ppm）： 13.36 （s，1H），11.68 （s，1H），8.67（d， scriptstyleJ=8Hz ，1H），8.61 （s，1H），8.57（s，1H），8.49 （d，scriptstyleJ=8Hz ，1H）， 8.36（d，J=4Hz，1H） ，8.24（s，1H），8.07（s，1H），7.85 （t， J=8Hz ，1H），4.05 （t， scriptstyleJ=4Hz ，2H），1.65-1.58 （m，2H）， 1.40～1.31 （m，2H）， 0.95 （t， J=8Hz， （23H）。 ¹³C NMR （DMSO-d6， 101 MHz） δ （ppm）： 163.92，163.28，159.44，151.58，142.80，142.64，136.08，132.64，131.96，131.82，129.49，128.82，126.94，123.23，122.49，115.31，113.75，40.53，30.18，20.27，14.21。

1.4 溶液配制

（1）NYS儲備液

于 50mL 容量瓶中加人 0.0021gNYS ，以DMSO定容配制 1×10^-4mol?L^-1 的濃溶液（避光保存）。測試時用DMSO：HEPES ：=2：8 的緩沖液稀釋至1×10^-5mol?L^-1

（2）離子溶液

稱取一定量的 AgNO₃ 、 Mg（NO₃）₂ 、 Fe（NO₃）₂ 、FeCl₃ 、 Cr（NO₃）₃ 、 CuSO₄ 、 Ca（NO₃）₂ ！ Z_n（NO3）2 、Pb（NO₃）₂ 、 Hg（NO₃）₂ 人 BaCl₂ 1 AlCl₃ ！ Cd（NO₃）₂ ！Co（NO₃）₂ 、 NiCl₂ 至 10mL 容量瓶中定容，配制成2×10^-2mol?L^-1 的金屬離子溶液。

（3）HEPES溶液的配制

稱取HEPES（ 2.38g ）用去離子水（ 250mL ）定容，再稱取 NaOH（1g） 用去離子水（ 25mL ）定容。將NaOH加入到HEPES溶液中，調(diào)節(jié)pH為7.4，移至 1 000mL 容量瓶中用去離子水定容，配制 20mmol?L^-1 HEPES緩沖液。

1.5 細(xì)胞毒性的測定

在DMSO/HEPES（2：8，V/V，pH為7.4，20mmol ?L^-1 ）條件下（所有測試均在此條件進(jìn)行），采用標(biāo)準(zhǔn)MTT法[27評估NYS對細(xì)胞的毒性，利用公式（1）計算。

細(xì)胞活力 （%）% 處理組空白吸光度平均值/對照組空白吸光度平均值 ×100 （1）

1.6 細(xì)胞成像

將細(xì)胞在 1% 青霉素、 1% 鏈霉素和 10% 牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后在含有 5% CO₂ 和 95% 空氣的培養(yǎng)箱中控溫 37°C 培養(yǎng) 20h 除去培養(yǎng)基，細(xì)胞用NYS（ 10μmol?L^-1） 的HEPES溶液（ 0.01mol?L^-1 ， pH 為7.40）孵育 ^1h ，再用緩沖溶液洗兩次，共聚焦顯微鏡在藍(lán)色通道下成像。然后加人 Cu²⁺ （ 10μmol?L^-1 ）處理 20min ，用新鮮的DMEM進(jìn)行共聚焦成像。

2結(jié)果與討論

2.1探針NYS對 Cu²⁺ 的紫外光譜響應(yīng)

利用紫外光譜考察探針NYS對金屬離子的識別性能，如圖3（a）所示，當(dāng)加人金屬離子（ Ca²⁺ Ag⁺ ， Al³⁺ ， Cr²⁺ ， Hg²⁺ ， Zn²⁺ ， Co³⁺ ， Pb²⁺ ， Fe²⁺ Fe³⁺ ， Ba²⁺ ， Mg²⁺ ， Cd²⁺ ， Ni²⁺ ）后，探針NYS的紫外吸收光譜幾乎沒有變化，但加入 Cu²⁺ 后探針在397nm 的最大吸收波長紅移至 448nm ，表明探針NYS能夠選擇性識別 Cu²⁺ 。然后考查了NYS對不同濃度 Cu²⁺ 的紫外響應(yīng)。如圖3（b）所示，隨著 Cu²⁺ 濃度不斷增加，NYS于 345nm 和 397nm 處的吸光度逐漸降低，同時在 448nm 和 358nm 處的吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。由圖3可知， Cu²⁺ 濃度達(dá) 時，紫外光譜不再變化即滴定達(dá)到平衡。上述結(jié)果表明探針NYS對 Cu²⁺ 有良好的紫外選擇性。

2.2探針NYS對Cu2+的熒光光譜響應(yīng)

接下來考察了NYS對不同濃度 Cu²⁺ 的熒光響應(yīng)，如圖4所示，探針NYS在 540nm 處的熒光強(qiáng)度隨著 Cu²⁺ 的逐漸加入而不斷降低，且波長也發(fā)生小幅藍(lán)移。它可歸因于NYS與 Cu²⁺ 配位生成NYS-Cu²⁺ 配合物導(dǎo)致的螯合熒光猝滅效應(yīng)（CHEQ）。由圖3（a）可以看出，當(dāng) Cu²⁺ 達(dá)到 10μmol?L^-1 時滴定達(dá)到平衡；由圖4（a）可以看出，探針識別 Cu²⁺ 后其綠色熒光完全猝滅。由圖4（b）可知，NYS的熒光強(qiáng)度與 Cu²⁺（ 1～6μmol?L^-1 ）呈線性關(guān)系（ R²=0.995 4）。根據(jù)公式 LOD=3σ/k 可計算NYS識別 Cu²⁺ 的檢測限為 1.79×10^-8mol?L^-1 。該探針可適用于對水樣及生物樣本中痕量級 Cu²⁺ 的檢測。

在 DMSO/HEPES（2：8， u/ν ，pH為 7.4，20mmol L^-1 ）中，考查了NYS對金屬離子的熒光響應(yīng)，如圖5（a）所示，向NYS中加入不同金屬離子（ Fe³⁺ Ca²⁺ ！ Cu²⁺ ， Mg²⁺ ， Ni²⁺ ， Al³⁺ ， Hg²⁺ ， Zn²⁺ ， Ba²⁺ Co³⁺ ， Fe²⁺ ， Ag⁺ ， Cr²⁺ ， Cd²⁺ ， Pb²⁺ ） 20μmol?L^-1 ）后，發(fā)現(xiàn)只有 Cu²⁺ 的加人使探針NYS 的熒光大幅猝滅，而其他離子的加入則對NYS的熒光幾乎沒有影響。

接下來考察了競爭離子的存在對NYS識別Cu²⁺ 是否存在影響。如圖5（b）所示，向NYS溶液（1號黑色柱）中加入除 Cu²⁺ 以外的競爭離子（2～15號陰影柱）后，探針熒光強(qiáng)度沒有明顯改變。當(dāng)向上述溶液中進(jìn)一步加入 Cu²⁺ 后，NYS的熒光強(qiáng)度均明顯減?。?～15號白色柱），且和NYS僅識別 Cu²⁺ 的強(qiáng)度基本一致（1號格子柱），故競爭離子對NYS識別 Cu²⁺ 的性能沒有造成干擾。

對NYS識別 Cu²⁺ 的化學(xué)計量比進(jìn)行了考察，將不同摩爾分?jǐn)?shù)的 Cu²⁺ 加入NYS溶液中，探針熒光變化如圖6（a）所示。由圖可知，當(dāng) Cu²⁺ 的摩爾分?jǐn)?shù)為0.5時，NYS熒光猝滅幅度最大，意味著NYS識別 Cu²⁺ 的配位計量比為1：1。

由熒光滴定曲線提取NYS熒光強(qiáng)度隨濃度的變化值，結(jié)果見圖6（b）。由圖6可知，1/（ F₀ -F）與 1/[Cu²⁺] 呈線性相關(guān)（ R²=0.990 6 ），根據(jù)Benesi-Hildebrand方程可計算NYS識別 Cu²⁺ 的絡(luò)合常數(shù)為 4.53×10⁴mol?L^-1

接下來考查了探針NYS識別 Cu²⁺ 的響應(yīng)時間，由圖7（a）可知，NYS可在 30s 內(nèi)完成對 Cu²⁺ 的識別響應(yīng)。具有廣泛的pH適用范圍是探針具備實際應(yīng)用價值的重要前提條件，因此考察了探針NYS在不同 ΔpH 條件下對 Cu²⁺ 的熒光響應(yīng)，如圖7（b）所示，在 pH 為5.0～12.0的NYS熒光強(qiáng)度波動不大。識別 Cu²⁺ 之后探針在 pH 值范圍為 3.0～8.0 的熒光降低幅度最大，在pH值范圍為9.0～12.0的體系中探針熒光降低幅度雖然不是很理想，但也能實現(xiàn)對 Cu²⁺ 的識別響應(yīng)。結(jié)果表明探針NYS對 Cu²⁺ 的識別具有良好的耐酸堿性。

2.3 探針NYS對 Cu²⁺ 的響應(yīng)機(jī)制

采用HR-MS深人探究探針NYS識別 Cu²⁺ 的機(jī)理。如圖8（a）所示，隨著 Cu²⁺ 的加入，質(zhì)譜中在469.09125處出現(xiàn)的離子峰可歸為[NYS-H⁺+Cu²⁺+H₂O]⁺ 。故提出 NYS對 Cu²⁺ 的響應(yīng)機(jī)制，如圖8（b）所示。

2.4探針NYS識別 Cu²⁺ 的細(xì)胞成像

如圖9（a）所示，HeLa細(xì)胞用NYS（ 0～30 培養(yǎng) 24h 后的存活率大于 80% ，表明NYS的毒性較小。由熒光成像圖9（b）可清晰地看到NYS在細(xì)胞中呈現(xiàn)出藍(lán)色熒光，當(dāng) Cu²⁺ 進(jìn)入細(xì)胞后，藍(lán)色熒光則大幅猝滅。結(jié)果表明，NYS具有較低的細(xì)胞毒性。

2.5 血液樣本中 Cu²⁺ 含量檢測

為了評估該探針的適用性，將探針NYS應(yīng)用于雞血中 Cu²⁺ 的檢測。將不同濃度的 Cu²⁺ 加入到雞血血清當(dāng)中，然后檢測NYS識別 Cu²⁺ 的熒光強(qiáng)度。用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收，如表1所示，血液樣本中Cu²⁺ 的回收率為 97.4%～107.0% （重復(fù)3次實驗）。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于 4.68% 。以上結(jié)果表明，NYS可以用于雞血中 Cu²⁺ 的檢測。

圖9HeLa細(xì)胞用NYS培養(yǎng) 后的活性（a）以及NYS響應(yīng)Cu2的熒光成像圖（b）

3結(jié)論

本研究利用取代甲?；妮刘啺泛碗禄拎簽樵蠘?gòu)建了一種新型 Cu²⁺ 熒光探針NYS，探針NYS可通過熒光猝滅高選擇性識別 Cu²⁺ 。它可歸因于探針NYS與 Cu²⁺ 絡(luò)合后產(chǎn)生的熒光螯合猝滅效應(yīng)（CHEQ）。利用Job曲線和高分辨率質(zhì)譜分析了探針NYS識別 Cu²⁺ 的響應(yīng)機(jī)制。探針NYS識別Cu²⁺ 的檢測限為 1.79×10^-8 mol·L1。探針NYS識別Cu²⁺ 的響應(yīng)速度較快（30s）抗干擾性強(qiáng)且毒性小。當(dāng)前熒光探針成為揭示生物分子生物學(xué)作用的很有前途的工具[28]，本研究已被應(yīng)用于雞血中 Cu²⁺ 的檢測以及細(xì)胞中 Cu²⁺ 的生物成像。

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Construction and Application of Cu²⁺ Fluorescent Probe Based on Naphthalimide

CUI Tong， ZHU Yanshan， XU Yi， GUO Xiaoyun， GAO Yan，GAO Yun （College ofChemical Engineering，UniversityofScience andTechnology Liaoning，Anshan Liaoning 114051，China

Abstract：A novelfluorescent probeNYS was preparedbycondensationreactionof3-formyl-4-hydroxy-n-butyl-1，8-naphthalimide with2-hydrazinepyrazine.Thestructuresof NYS werecharacterizedbyhighresolutionmassspectrometry（HR-MS），hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy （1H NMR） and carbon nuclear magnetic resonance spectroscopy ^-13CNMR） . In the present of Cu²⁺ ，the fluorescence of the probe NYS can be completely quenched within 30s . It can be attributed to the chelating fluorescence quenching effect （CHEQ） caused by the complexation of NYS with Cu²⁺ . The response mechanism of NYS towards Cu²⁺ was investigated by mass spectrometry. The detection limit of Cu²⁺ recognized by NYS can be as low as 1.79×10^-8mol?L^-1 .Probe NYS has been successfully applied to the detection of Cu²⁺ in chicken blood and the confocal imaging of Cu²⁺ in HeLa cells.

Key words： Naphthalimide; Fluorescent probe; Cu²⁺ ; Chicken blood; Cell imaging