葉酸修飾的克班寧納米粒聯(lián)合超聲輻照對M109細胞的體內(nèi)外靶向作用及抗腫瘤機制

中圖分類號R944 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）14-1730-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.14.07

ABSTRACTOBJECTIVETo investigatethe targeting efectoffolicacid-modified crebanine nanoparticles（FA-Cre@PEGPLGANPs，hereinafterreferredtoas“NPs”）combinedwithultrasoundirrdiationonM109cellsinvitroandinvivoafter adminstration，andexplore theant-tumormechanism.METHODSCCK-8assywasusedtodetectthe inhibitoryefectof NPs combinedwithultrasoundiradiationontheproliferationofM109cells，andthebestultrasoundtimewasseleced.Usinghuman lungcancerA549celsasacontrol，thetargetingofNPscombinedwithultrasoundiradiationtoM109celswasevaluatedbyfree folicacid blocking assay and cell uptake assay.The effectsof NPs combined with ultrasound irradiation on the migration， invasion，apoptosis，cell cycle and reactive oxygen species （ROS）levelsofM1o9 cellswere detectedbycell scratch test， Transwell chamber test and flow cytometry at 1hafter administration； the changesof mitochondrial membrane potential （MMP）were observed by fluorescence inverted microscope.A mouse subcutaneoustumormodelofMlo9 cells wasconstructed，andtheinvivotumortargetingofNPscombinedwithultrasoundiradiationasinvestigatedbysallaimalin vivoimagingtechnologyRESULTSNscombinedwithultrasoundiradiationcouldsignificantlyinhibitthproliferationofM109 cell，andtheoptimalultrasoundtimewas1hafteradministration.ThefreefolicacidcouldantagonizetheinhibitoryeectofNPs ontheproliferationofM109cells，andcombinedwithultrasoundiradiationcouldpartiallyreversethisantagonsm.Comparedwith A549 cells，the uptake rate of NPs in M109 cells was significantly higher ），and ultrasound irradiation could promote cellar ptake.NPscombinedwithultrasoundiradiationcould inhibitthemigrationandinvasionofM109cellandblockthecel cycle in the G₀/G₁ and G₂/M phases.Compared with control group，the apoptosis rate of M109 cells and ROS level were increased significantly （Plt;0.01 ），while the MMP decreased significantly（ Plt;0.01 ）in the different concentration（1o0，200， 300μg/mL ） groupsofM109cels.Comparedwiththemiceinnon-ultrasound group，thefluorescenceintensityandtumor-targetingindexof the tumor site in the O h ultrasound group were significantly enhanced （ Plt;0.05 or Plt;0.01 ）.CONCLUSIONS NPs combined with ultrasoundiradiationhveatrongtargetingeffectonM09celsinvitroandinvivo，theanti-tumormechansmicludesiibiing cell migration and invasion，blocking cell cycle，and inducing apoptosis.

KEYWORDsfolicacid-modified nanoparticles；ultrasonic iradiation；M109cels；tumor targeting；anti-tumor mehanism

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的一種惡性腫瘤，尚無理想治療手段。智能納米載藥系統(tǒng)是治療腫瘤的一種新方法，其表面通常會修飾腫瘤特異性配體[如抗體、多肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白和葉酸（folicacid，F(xiàn)A）等，能響應特定的外部或內(nèi)部刺激（如酶、pH、溫度、光學和磁性等），使納米粒靶向到腫瘤部位，用于腫瘤的精準治療2。FA具有廉價易得、安全無毒、相對分子質(zhì)量小的優(yōu)勢，與葉酸受體（folatereceptor，F(xiàn)R）具有高度的親和力，而FR存在于大多數(shù)腫瘤細胞表面，在正常機體細胞中不表達或很少表達，因此FA常被作為理想的腫瘤主動靶向配體。聲動力療法是一種非入侵性的治療方法，使用的超聲波具有良好的組織穿透能力，且安全無創(chuàng)、可控性強，在腫瘤的診斷和治療方面均具有較好的應用前景4。超聲波的空化效應會導致血管內(nèi)皮細胞間隙增大，從而提高細胞膜的通透性，使更多的納米粒進入腫瘤組織，增強腫瘤治療效果[5-]。因此，納米粒聯(lián)合聲動力療法越來越多地應用于腫瘤的治療。

克班寧（crebanine，Cre）是從防己科千金藤屬植物云南地不容StephaniaYunnanensisH.S.Lo及其他幾種同屬植物中提取得到的異喹啉類阿樸菲型生物堿。研究發(fā)現(xiàn)，Cre對多種腫瘤細胞均具有一定的抑制作用[8-9]。然而Cre毒性大、水溶性差、半衰期短的缺點限制了其臨床應用。為解決以上問題，本課題組前期制備了FA修飾的Cre納米粒（FA-Cre@PEG-PLGANPs，以下簡稱“NPs”，其以FA修飾的聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物（PEG-PLGA-FA）為外殼，內(nèi)部包載藥物Cre、熒光染料（DiR）和液態(tài)氟碳（PFP）。NPs在提高Cre生物利用度的同時使其具有主動靶向腫瘤細胞的能力；而且與Cre原藥相比，NPs聯(lián)合超聲輻照具有更好的體外抗腫瘤作用[1]。在此基礎上，本研究通過細胞實驗及活體成像實驗探究NPs聯(lián)合超聲輻照對小鼠肺癌M109細胞的體內(nèi)外靶向作用，并初步探討其抗腫瘤機制，以期為后續(xù)體內(nèi)藥效學研究及臨床應用提供參考。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用的主要儀器有M90SCI型獸用彩色多普勒超聲系統(tǒng)（深圳邁瑞動物醫(yī)療科技股份有限公司）、VarioskanLUX型多功能酶標儀（美國ThermoFisherScientific公司）、MF52-N型倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）FACSCelesta型流式細胞儀（美國BD公司）IVISLuminaSeriesⅢ型小動物活體成像儀（美國PerkinElmer公司）、BPN-190CH型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）HH-2型恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）L550型低速大容量離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2主要藥品與試劑

NPs[Cre含量為 6g/L， 包封率為 83.78% 、粒徑為（ 247.67±2.49 ） nm 、Zeta電位為 （-9.40±0.54） mV]和空白NPs（不載Cre）均由云南中醫(yī)藥大學藥劑實驗室自制；胎牛血清、青霉素-鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自上海達特希爾生物科技有限公司；超聲耦合膠購自天津津亞科技發(fā)展有限公司；CCK-8試劑盒（批號ATWD07091）購自亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司；FA（批號CR2204101，純度 98% ）、DAPI染料（批號CR2307030）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；細胞周期檢測試劑盒（批號2406263）購自武漢普美克生物技術(shù)有限公司；細胞調(diào)亡試劑盒（批號MA0220-2）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）檢測試劑盒（批號011124240515）購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；JC-10線粒體膜電位（mitochondrialmem-branepotential，MMP）檢測試劑盒（批號240007002）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 細胞株

小鼠肺癌M109細胞購自湖南豐暉生物科技有限公司；人肺癌A549細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.4 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠15只，4周齡，雄性，體重 14～ 16g ，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2021-0002。小鼠飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于溫度為 22～25^°C. 相對濕度為50%～70%.12h 光照與 12h 黑暗交替的環(huán)境中。本研究方案經(jīng)云南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理審查委員會批準（批準號：R-062024008）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將M109和A549細胞接種于含 10% 胎牛血清和 1% 雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于 37^°C?5%CO₂ 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞匯合率達 80%～90% 時傳代，使用處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2 給藥后超聲時間點的篩選

將M109細胞以每孔 1×10⁴ 個接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng) 24h ，設置不超聲組和給藥后 0，1，2h 超聲組。每組分別加人不同質(zhì)量濃度的 NPs（50，100，150，200， 250，300，350，400μg/mL ，以Cre計；根據(jù)預實驗及文獻[10]確定質(zhì)量濃度），每個質(zhì)量濃度設置5個復孔；同時設置對照孔和空白孔。除不超聲組外，其余3組均在對應時間點聯(lián)合超聲輻照（超聲探頭垂直于孔板底面，每孔超聲 2min ，下同）。培養(yǎng) 24h 后，用PBS清洗1次，每孔加入新配的含 10%CCK-8 試劑的完全培養(yǎng)基 100μL 放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2nΩ ，用酶標儀在 450nm 波長處檢測吸光度 （A） 值，計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率 0

2.3 游離FA對M109、A549細胞的阻斷實驗

稱取FA粉末 10mg ，加入 1mL 磷酸氫二鈉水溶液中 （pH9.0） 充分溶解，用DMEM完全培養(yǎng)基分別稀釋至0、10，100，1 000μg/mL ，再用磷酸二氫鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH=7 后備用。分別將M109和A549細胞以每孔 1× 10⁴ 個接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng) 24h ，設置游離FA組和游離FA+NPs（NPs質(zhì)量濃度為 200μg/mL ，以Cre計）組，兩組的FA質(zhì)量濃度均為 0.10?100?1 000μg/mL （根據(jù)預實驗結(jié)果確定質(zhì)量濃度），每組設置5個復孔。兩組細胞分別進行給藥后不超聲和給藥后聯(lián)合超聲輻照處置（按“2.2”項下篩選的超聲時間點進行超聲輻照，下同），放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24h ，按\"2.2\"項下方法計算細胞增殖抑制率。

2.4M109、A549細胞對NPs的體外攝取實驗

2.4.1倒置熒光顯微鏡觀察

分別將M109和A549細胞以每孔 5×10⁵ 個接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng) 24h ，加人 2mL 含空白NPs的完全培養(yǎng)基（DiR質(zhì)量濃度為 25μg/mL ），分為不超聲組和超聲組，每組設置3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)3、6、12h后，用PBS清洗3次，加入 400μL 即用型DAPI染色液（質(zhì)量濃度為2μg/mL ），室溫避光染色 10min ，再用PBS清洗3次，最后用倒置熒光顯微鏡觀察細胞對NPs的攝取情況（細胞膜被DiR染色，呈紅色；細胞核被DAPI染色，呈藍色）。

2.4.2 NPs攝取率檢測

分別將M109和A549細胞以每孔 1×10⁴ 個接種于黑色96孔板中，常規(guī)培養(yǎng) 48h ，分為空白組（不含細胞）、對照組（空白培養(yǎng)基）不超聲實驗組和超聲實驗組，每組設置5個復孔。除對照組外，其余各組每孔加人100μL 含空白NPs的完全培養(yǎng)基。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)3、6、12h，用PBS清洗3次，用多功能酶標儀（激發(fā)波長為750nm ，發(fā)射波長為 782nm ）測定各孔熒光強度，計算細胞對NPs的攝取率：攝取率 （%）= （實驗組熒光強度一對照組熒光強度）/空白組熒光強度 ×100% 。

2.5M109細胞遷移和侵襲能力檢測

2.5.1 細胞遷移能力檢測

采用細胞劃痕實驗進行檢測。將M109細胞以每孔1×10⁶ 個接種于底部用黑色馬克筆畫有3條平行線的6孔板中，培養(yǎng) 24h ，使用 200μL 槍頭垂直在孔板中劃豎痕，使之與黑色標記線相交并垂直，用PBS清洗1次，除去劃下的細胞團塊。隨后更換培養(yǎng)基為含 2% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，設置對照組（空白培養(yǎng)基）和NPs低、中、高濃度 （100，200，300μg/mL ，根據(jù)預實驗結(jié)果確定質(zhì)量濃度）組，每組設置3個復孔。給藥并聯(lián)合超聲輻照后，使用倒置顯微鏡拍照記錄同一劃痕在 0.24h 的變化。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，并計算細胞劃痕愈合率：細胞劃痕愈合率 （%）=（0h 劃痕寬度 -24h 劃痕寬度） /0h 劃痕寬度 ×100% 。

2.5.2 細胞侵襲能力檢測

采用Transwell小室實驗進行檢測。將Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按1：8的體積比混勻，取 60μL 滴加到Transwell小室上室鋪勻，將小室放人24孔板內(nèi)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中放置3h成膜。將M109細胞以每孔5×10⁵ 個接種于6孔板中，培養(yǎng) 24h ，設置對照組（空白培養(yǎng)基）和NPs低、中、高濃度 （100，200，300μg/mL ，根據(jù)預實驗結(jié)果確定質(zhì)量濃度）組，每組設置3個復孔。給藥并聯(lián)合超聲輻照，培養(yǎng) 24h 后，離心收集細胞，用PBS清洗1次，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞并調(diào)整細胞密度為1×10⁵ 個/mL；取 200μL 細胞懸液接種到Transwell小室上室，下室加入 500μL 完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h 。使用棉簽抹掉未侵襲的細胞，以 4% 多聚甲醛溶液固定 20min，0.1% 結(jié)晶紫染液染色 10min ，用PBS清洗后，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞侵襲情況并計數(shù)。細胞侵襲數(shù)量越多說明侵襲能力越強。

2.6M109細胞凋亡檢測

將M109細胞按“2.5.2\"項下方法分組、給藥及聯(lián)合超聲輻照。24h后，使用不含EDTA的胰酶消化細胞，用PBS清洗1次，于流式管中加入 500μL 1× BindingBuf-fer重懸細胞，每管加入 5μL Annexin ΔV -FITC和 10μL PI，室溫避光培養(yǎng) 10min ，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.7 M109細胞周期分布檢測

將M109細胞按“2.5.2”項下方法分組、給藥及聯(lián)合超聲輻照。 24h 后，消化并收集細胞，用PBS清洗1次，加入預冷的 70% 乙醇 1mL ，于 4^°C 固定過夜。次日離心，棄上清，加入預配的染色工作液（PI+RNaseA）500μL 并混勻， 37^°C 避光培養(yǎng) 30min ，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

2.8 M109細胞內(nèi)ROS水平檢測

將M109細胞按“2.5.2”項下方法分組、給藥及聯(lián)合超聲輻照。 24h 后，消化收集細胞，用PBS清洗1次，加人 500μL 稀釋的DCFH-DA染色液重懸細胞，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 20min （每隔 5min 輕搖混勻1次，使探針和細胞充分接觸）。培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS清洗1次，加入 500μL PBS重懸細胞，然后轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細胞儀檢測細胞熒光強度。熒光強度越大表明細胞內(nèi)ROS水平越高。

2.9 M109細胞內(nèi)MMP變化檢測

將M109細胞按“2.5.2\"項下方法分組、給藥及聯(lián)合超聲輻照。 24h 后，消化并收集細胞，用PBS清洗1次，加入 1mL JC-10染色工作液并混勻，于 37^°C 下培養(yǎng)20min。離心，棄上清，用預冷的JC-10染色緩沖液洗滌細胞2次，加人 2mL 完全培養(yǎng)基，用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。使用ImageJ軟件分析各組細胞的紅/綠熒光比值（紅/綠熒光比值 °leddash 紅色熒光強度/綠色熒光強度），比值越低表明細胞內(nèi)MMP越低。

2.10小動物活體成像觀察

調(diào)整M109細胞的密度為 5×10⁷ 個 /mL ，取 100μL 細胞懸液，注射于小鼠右腋下，構(gòu)建小鼠M109皮下瘤模型。待腫瘤體積長至（ 200±20 ）mm時，選取體重及腫瘤體積無顯著差異的小鼠隨機分為不超聲組、給藥后0h超聲組（給藥后立即超聲）和給藥后1h超聲組，每組5只。每只小鼠尾靜脈注射 0.2mLNPs （DiR質(zhì)量濃度為0.5mg/mL ），超聲組給藥后使用超聲探頭對腫瘤部位超聲 20min 。分別于給藥前和給藥后 0.5，1，1.5，2，4，8， 24、48、72、96、120h進行活體熒光拍攝，觀察各組小鼠的體內(nèi)熒光分布情況。使用LivingImage軟件對圖像進行處理，量化熒光強度。根據(jù)腫瘤靶向指數(shù)（tumor-targetingindex，TTI）以及梯形法計算的TTI-時間曲線下面積（areaundertheTTI-timecurve，AUTC）來評價NPs在小鼠體內(nèi)的腫瘤靶向能力[1]。 TTI（%）= 腫瘤區(qū)域熒光強度/全身熒光強度 ×100% 。

2.11 統(tǒng)計學方法

使用SPSS26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準 α=0.05 。

3結(jié)果

3.1給藥后超聲時間點的篩選結(jié)果

總體而言，給藥后聯(lián)合超聲輻照能提高NPs對M109細胞的增殖抑制率 （Plt;0.05 ）。與不超聲組或給藥后0h超聲組比較，給藥后 ^1，2h 超聲組的細胞殺傷力更強（ ΔPlt;0.05 ；但與給藥后1h超聲組比較，給藥后 2h 超聲組細胞增殖抑制率的提升不明顯 （Pgt;0.05 。因此，本研究確定后續(xù)體外細胞實驗的超聲時間點為給藥后 1h 。結(jié)果見表1。

表1給藥后不同時間點超聲對 M109Ω 細胞增殖抑制率的影響 ）

a：與不超聲組比較， Plt;0.05 ；b：與給藥后0h超聲組比較， Plt; 0.05。

3.2 游離FA對M109、A549細胞的阻斷結(jié)果

游離FA組2種細胞的增殖抑制率均在 -3%～3% 之間，說明在聯(lián)合或不聯(lián)合超聲輻照的條件下，游離FA在 0～1000μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對2種細胞的生長均無明顯影響。游離 FA⁺NPs 組在不超聲時，與同組的0μg/mL 比較，隨著游離FA質(zhì)量濃度的增加（ Δ?10μg/mL 質(zhì)量濃度除外），NPs對M109細胞的增殖抑制率下降L （Plt;0.05） ，而對A549細胞無明顯影響（ （Pgt;0.05） ；與不超聲比較，給藥后1h超聲時，在各游離FA質(zhì)量濃度下，2種細胞的增殖抑制率均顯著升高 （Plt;0.01 。結(jié)果見表2。

表2游離FA對M109、A549細胞增殖抑制的影響 s，n=5） （2號

a：與同組不超聲時比較， Plt;0.01 ;b：與游離FA+NPs組的 0μg/mL 比較， Plt;0.05_lt;

3.3 M109、A549細胞對NPs的攝取結(jié)果

3.3.1 倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果

隨著培養(yǎng)時間的延長，2種細胞的DiR熒光強度均呈上升趨勢，且無論聯(lián)合超聲輻照與否，M109細胞在各個時間點的DiR熒光強度均明顯強于A549細胞。聯(lián)合超聲輻照后，2種細胞在各時間點的DiR熒光強度均增加。結(jié)果見圖1（圖1僅展示 12h 時的顯微圖，全部時間點的圖片可掃描本文首頁二維碼，進人“增強出版”頁面查看附圖1）。

圖1M109、A549細胞對NPs攝取的顯微圖（DiR染色）

3.3.2 NPs攝取率檢測結(jié)果

在不超聲實驗組中，隨著培養(yǎng)時間的延長，2種細胞的攝取率均逐漸升高；而在相同培養(yǎng)時間下， M109 細胞的攝取率顯著高于A549細胞（ （Plt;0.01 ）。與不超聲實驗組同類型細胞比較，超聲實驗組的2種細胞在各培養(yǎng)時間點下的攝取率均有所提高，其中M109細胞在培養(yǎng)3h時和A549細胞在培養(yǎng) 12h 時的攝取率差異均有統(tǒng)計學意義（ （Plt;0.05） 。這表明聯(lián)合超聲輻照能促進細胞攝取，與倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果一致。結(jié)果見表3。

表3培養(yǎng)不同時間后 M109Ω A549細胞對NPs的攝取率比較

a：與不超聲實驗組A549細胞比較， .Plt;0.01 ;b：與同類型細胞、同培養(yǎng)時間的不超聲組比較， Plt;0.05， 。

3.4M109細胞遷移與侵襲實驗結(jié)果

與對照組[細胞劃痕愈合率 （71.80±6.22）% 、細胞侵襲數(shù)（ 442.00±43.31 ）個]比較，NPs低、中、高濃度組的細胞劃痕愈合率[分別為 （62.20±2.63）% 、 40.79± 5.51% 、 （29.84±4.93）% 和細胞侵襲數(shù)[分別為0 217.00±7.21 、 （163.67±9.29 、 （92.67±8.14） 個]均顯著降低或減少（ ΔPlt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結(jié)果見圖2、圖3。

3.5M109細胞凋亡及細胞周期檢測結(jié)果

與對照組比較，NPs低、中、高濃度組細胞凋亡率均顯著升高（ （Plt;0.01） 。與對照組比較，NPs低、中、高濃度組S期細胞比例均顯著降低（ （Plt;0.01 ，而 G₀/G₁ 和 G₂/M期細胞比例均明顯升高 ?Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結(jié)果見表4（流式圖可掃描本文首頁二維碼，進人“增強出版\"頁面查看附圖2、附圖3）。

圖2各組M109細胞劃痕實驗的顯微圖

圖3各組M109細胞Transwell小室實驗的顯微圖（結(jié)晶紫染色）

表4各組 M109Ω 細胞的凋亡率及細胞周期占比檢測結(jié)果比較

a：與對照組比較， Plt;0.01;b; 與對照組比較， Plt;0.05_lt;

3.6M109細胞內(nèi)ROS水平及MMP變化檢測結(jié)果

與對照組比較，NPs低、中、高濃度組細胞內(nèi)ROS水平均顯著升高 （Plt;0.01 ），紅/綠熒光比值均顯著降低（Plt;0.01） 。結(jié)果見表5。

表5各組M109細胞的R0S熒光強度、紅/綠熒光比值比較 ））

a：與對照組比較， Plt;0.01

3.7小動物活體成像觀察結(jié)果

各組小鼠腫瘤部位在給藥后 120h 仍有較強的紅色熒光，表明NPs能長時間滯留在腫瘤部位。與不超聲組比較，給藥后 ^0h 超聲組小鼠腫瘤部位的熒光強度及各時間點下的TTI均顯著增加（ ΔPlt;0.05 或 Plt;0.01 ）；而給藥后1h超聲組與不超聲組比較，差異無統(tǒng)計學意義0 Pgt;0.05 ）。給藥后 0h 超聲組和給藥后1h超聲組小鼠的AUTC分別為不超聲組的1.14倍和0.99倍，給藥后0h超聲組小鼠腫瘤部位的熒光強度、TTI和AUTC均高于不超聲組和給藥后1h超聲組。這表明給藥后 ^0h 聯(lián)合超聲輻照能增加NPs在腫瘤部位的蓄積，延長滯留時間，具有更好的腫瘤靶向效果；而給藥后1h超聲組結(jié)果與不超聲組類似，對NPs靶向性的提升作用不明顯。結(jié)果見圖4、圖5（圖4僅展示0、2、24、72、120h時的活體成像圖，全部時間點的圖片可掃描本文首頁二維碼，進入“增強出版\"頁面查看附圖4）。

4討論

近年來，隨著納米載藥技術(shù)及超聲成像技術(shù)的發(fā)展，納米粒聯(lián)合超聲輻照以其獨特的優(yōu)勢成為了肺癌治療的研究熱點[2]。超聲波的空化效應使腫瘤部位的細胞膜通透性增加，對納米粒的攝取增多。這些納米粒通常包載治療藥物、聲敏劑或造影劑，在超聲輻照的作用下，納米粒子會劇烈振蕩和膨脹，導致其破裂，使藥物在腫瘤部位集中釋放，增強腫瘤治療效果[13]。本課題組前期制備的NPs具有較好的生物相容性及腫瘤靶向能力，

圖4各組小鼠在給藥后不同時間點的活體成像結(jié)果圖

a：與不超聲組比較， Plt;0.01 ;b：與不超聲組比較， Plt;0.05， 0

給藥后聯(lián)合超聲輻照，不僅能促進腫瘤細胞對NPs的攝取，同時在超聲波的機械效應和熱效應作用下，NPs內(nèi)部包載的PFP會由液態(tài)納米乳滴轉(zhuǎn)變?yōu)闅怏w微泡，使NPs膨脹爆破并在腫瘤部位釋藥[14，增強對腫瘤細胞的殺傷力。前期的體內(nèi)實驗表明，NPs聯(lián)合超聲輻照對肝癌小鼠具有較好的治療效果[15-16]

超聲輻照能提高NPs對腫瘤細胞的增殖抑制作用。本研究顯示，與給藥后0h超聲比較，給藥后1h后再超聲，可以使NPs有足夠的時間通過FA的靶向作用而富集在腫瘤細胞表面及周圍，此時聯(lián)合超聲輻照可以使NPs在腫瘤細胞周圍瞬間爆破釋藥，增強對腫瘤細胞的殺傷力；給藥后2h超聲與給藥后1h超聲的細胞增殖抑制率比較，差異無統(tǒng)計學意義。筆者推測給藥后1h時與細胞表面FR結(jié)合的NPs接近飽和，故給藥后2h再超聲與給藥后1h超聲的結(jié)果差別不大。有研究發(fā)現(xiàn)，游離FA會占據(jù)人口腔癌KB細胞表面FR的位置，使KB細胞對FA修飾的納米載藥膠束的攝取減少[17]。本研究結(jié)果表明，游離FA能減弱NPs對M109細胞的增殖抑制作用，而對A549細胞幾乎無影響；細胞攝取實驗結(jié)果也表明，F(xiàn)R高表達的M109細胞對NPs的攝取率顯著強于FR低表達的A549細胞。這提示NPs可能是通過FA介導的內(nèi)吞作用進入細胞，具體的攝取機制有待進一步研究。

與體外細胞實驗結(jié)果不同的是，活體成像結(jié)果表明，給藥后0h聯(lián)合超聲輻照具有更好的腫瘤靶向效果。對于體內(nèi)實驗來說，給藥1h后再超聲，NPs會隨著時間的延長，在體內(nèi)各器官分布，被肝臟及其他組織大量截留，導致存在于血液循環(huán)中的NPs濃度降低、被動靶向能力減弱，故給藥后1h超聲組小鼠體內(nèi)的腫瘤靶向效果較給藥后 0h 超聲組差。NPs在大鼠體內(nèi)的藥動學研究證實了這一推測：NPs經(jīng)尾靜脈注射后，在大鼠體內(nèi)主要由肝臟代謝，隨著給藥后時間的延長，大鼠血漿中NPs的含量逐漸降低；給藥后 60min 后的NPs平均血藥濃度較給藥后 5min 降低約 37%^[16] 。因此，在后期進行體內(nèi)藥效學實驗時建議給藥后立即超聲。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，分為外源性凋亡和內(nèi)源性凋亡（又稱線粒體凋亡）。凋亡機制復雜，涉及多種信號通路，受到基因的精細調(diào)控，在腫瘤發(fā)展的過程中常伴有相關凋亡基因的異常表達[18]。ROS在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，過高的ROS水平會導致氧化應激，引起MMP降低，誘發(fā)線粒體膜通透性改變，使細胞色素C及其他因子釋放到細胞質(zhì)中，啟動caspase級聯(lián)反應，最終誘導細胞凋亡[19-20]。本研究結(jié)果顯示，NPs聯(lián)合超聲輻照能誘導細胞產(chǎn)生ROS，降低MMP。這提示NPs聯(lián)合超聲輻照可能通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。

綜上所述，NPs聯(lián)合超聲輻照對M109細胞具有較強的體內(nèi)外靶向性；其抗腫瘤機制包括抑制細胞遷移與侵襲、誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期等。

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