基于納米硒的嘧菌酯納米農(nóng)藥制備及對番茄晚疫病菌抑制作用

關(guān)鍵詞：納米硒；嘧菌酯；納米農(nóng)藥；抑菌活性；番茄晚疫病中圖分類號： TQ450.6;S436.412.1⁺2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）10-0152-07

嘧菌酯（Azo）屬于甲氧基丙烯酸酯類難溶性化合物，既能抑制菌絲生長，又能抑制孢子萌發(fā)，并且對幾乎所有真菌病害都具有保護(hù)和治療作用[1]由于Azo具有殺菌效果極佳、殺菌譜廣、毒性小等特點(diǎn)，使其成為目前使用最廣泛的殺菌劑之一[2]。但有研究發(fā)現(xiàn)，大量使用Azo使得病原菌對其產(chǎn)生抗藥性，降低了Azo的防治效果[3]。因此，根據(jù)Azo 理化性質(zhì)研究制備納米緩釋劑，降低病原菌對Azo的抗藥性、提高 Azo 的防治效果具有重要意義[4-5] 。硒在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用研究已經(jīng)有幾十年，適量的硒有助于提高作物產(chǎn)量，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，增強(qiáng)植物的抗逆性[6-9]。硒納米顆粒（Se）可以通過調(diào)控其表面性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)藥物的包裹和傳遞，這使得硒納米顆粒在藥物遞送系統(tǒng)中具有廣闊的應(yīng)用前景[10-12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Se 表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，對細(xì)菌和真菌具有殺滅作用[13-15]?；谝陨咸攸c(diǎn)，對Se的載藥性能和抗菌特性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究[16-18]。本試驗(yàn)采用模板法制備 Se，通過溶劑揮發(fā)法對嘧菌酯進(jìn)行負(fù)載，再利用羧甲基殼聚糖（CMCS）對其進(jìn)行包封，制備 CMCS@Azo@S e，并探究其載藥能力、緩釋性能與抗菌能力。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器和材料

Tecnai12透射電鏡（荷蘭Philips公司）Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）、S－4800域的FESEM（日本Hitachi公司）、Tensor27傅里葉紅外光譜儀（布魯克光譜儀器公司）、比表面及孔徑綜合分析儀（美國康塔儀器公司）Pyris1TGA熱重分析儀（美國PerkinElmer公司）、L-2000 高效液相色譜儀（日本Hitachi公司）。

98% 嘧菌酯原藥，購自江蘇省農(nóng)用激素工程技術(shù)研究中心有限公司； 70% 嘧菌酯懸浮劑，購自深圳諾普信作物科學(xué)股份有限公司；乙晴（色譜純），購自美國Tedia公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，99% ）亞硒酸鈉（ Na₂SeO₃ ）、氧化鋅（ zno ）、維生素C（Vc）聚乙二醇400（PEG-400）、羧甲基殼聚糖（CMCS）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽、2-嗎啉乙磺酸、 ??N?- 羥基琥珀酰亞胺鹽酸（ 37% ）等，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

番茄晚疫病菌［Phytophthorainfestans（Mont.）DeBary］由植物病理系提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1硒納米粒子的制備方法將 405mg Na₂SeO₃?150mgZnO_?1.095g CTAB和 160mL 去離子水加入圓底燒瓶中，并在室溫下攪拌 6h 。而后加入 40mL 含有 850mg 維生素C的溶液，并將反應(yīng)液 pH 值調(diào)節(jié)至7.4，在 35^qC 攪拌 12h 。通過離心收集沉淀，將沉淀超聲分散于 100mL 乙醇：鹽酸（95：5） 溶液中，并在 70% 酸洗回流 ^12h 。離心收集沉淀，用乙醇和去離子水進(jìn)行洗滌。最后將所得沉淀進(jìn)行冷凍干燥 ^12h ，得到 Se 。

1.2.2硒納米粒子的表征方法形貌觀察：將SeNPs樣品鍍金后利用掃描電鏡（SEM）觀察樣品形態(tài)；將Se超聲分散于乙醇后，取少量樣品置于銅網(wǎng)上通過透射電鏡（TEM）進(jìn)行觀察[19]。動態(tài)粒徑測定（DLS）：將Se超聲分散于去離子水中，并使用激光光散射儀對納米顆粒的粒徑進(jìn)行分析[20]。介孔結(jié)構(gòu)分析：稱取一定量的Se樣品，在脫氣溫度120°C 、脫氣時(shí)間 120min 、環(huán)境溫度 30% 、飽和蒸氣壓 101.49kPa 和恒浴溫度 77.3K 的條件下，采用比表面積測定儀測定Se的比表面積、孔徑以及孔容，并分析Se的介孔結(jié)構(gòu)[21]

1.2.3羥基修飾的硒（MSe）的制備方法將合成的Se超聲分散于 70mL 含有 1.2gPEG-400 溶液中，在 35^°C 條件下攪拌 24h 。在 10 000r/min 轉(zhuǎn)速下離心收集Se，并用去離子水洗滌，冷凍干燥^12h 后得到MSe。

1.2.4載Azo 納米顆粒（ Azo@ Se）的制備方法以丙酮為溶劑配制質(zhì)量濃度為 5mg/mL 的Azo溶液。將 200mgM Se超聲分散于 20mL Azo 溶液中，在室溫下密閉攪拌 ^12h 。而后開蓋繼續(xù)攪拌直至丙酮完全揮發(fā)。用乙醇和去離子水進(jìn)行洗滌，冷凍干燥后得到 Azo@Se 。

1.2.5 CMCS@Azo@ Se 的制備方法將 200mg CMCS溶解在 30mL 含有0.1MMES（ pH 值 =5.8 ）的溶液中，在 85^°C 下以 800r/min 攪拌 ¹h 。而后將溫度降至 35^qC 后攪拌 0.5h 。在上述溶液加入550mg1- 乙基-3-（3-甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽攪拌 0.5h ，之后再加人 羥基琥珀酰亞胺繼續(xù)活化 1.5h 。將合成的 Se加入到反應(yīng)溶液，降低轉(zhuǎn)速至 500r/min 繼續(xù)攪拌 24h 。通過離心收集沉淀，用乙醇洗滌和去離子水洗滌后進(jìn)行冷凍干燥，得到CMCS@ Azo@ Se[22]1.2.6Azo@Se 和 CMCS @ Azo@Se的表征方法1.2.6.1紅外光譜（FTIR）分析將 Azo@ Se和CMCS@ Azo@Se樣品與溴化鉀混合制成溴化鉀壓片，利用紅外光譜儀對樣品進(jìn)行紅外光譜分析。1.2.6.2載藥率（LE）測定將 50mgAzo@ Se超聲分散于乙腈當(dāng)中，通過高效液相色譜（HPLC）測定載藥率。Azo的HPLC的檢測條件：色譜柱： C₁₈ 色譜柱（ 250nm×64nm ）；檢測波長為 210nm ，溫度為25‰ 10μL 1mL/min

;進(jìn)樣量為 ，速度設(shè)定為 ;流動相為乙腈：水（體積比 =60：40 ），并根據(jù)公式（1）計(jì)算載藥率。

載藥率=載藥體系中Azo的重量 ×100% 。載藥體系的總重量

1.2.6.3 熱重分析（TGA）將 Azo（α） Se和 CMCS@Azo（a） Se樣品置于 800^°C 和氮?dú)鈼l件下采用熱重分析儀對樣品進(jìn)行熱重分析。

1.2.7 CMCS @ Azo@Se的緩釋性能測定方法以含有 30% 乙腈的PBS溶液為釋放介質(zhì)（ pH 值分別為5.8、7.2、9.0），稱取 60mgCMCS⊕Azo（a Se裝人透析袋中。然后向透析袋中加入適量釋放介質(zhì)，將透析袋置于 60mL 釋放介質(zhì)中。在 35^°C 下，調(diào)整轉(zhuǎn)速為 250r/min 進(jìn)行釋放。在指定時(shí)間取 1mL 釋放介質(zhì)并采用高效液相色譜法測定其中Azo的濃度，并向體系中補(bǔ)充 1mL 介質(zhì)來保持相同體積。按公式（2）計(jì)算累計(jì)釋放量。

式中： E_p 為Azo的累計(jì)釋放量； V_e 為每次取出懸浮液的體積（ 1mL ）； C_i 為第 χ_i 次取樣時(shí)釋放介質(zhì)中Azo的濃度， mg/mL V₀ 為釋放介質(zhì)的總體積（ 60mL ）； C_n 為第 n 次取樣時(shí)釋放介質(zhì)中Azo的濃度， mg/mL;n 為取樣的次數(shù)； m_p 為加載到Se中Azo的總量， mg 。

1.2.8 CMCS @ Azo@Se對番茄晚疫病菌的抑制作用采用平板法測定載藥顆粒對番茄晚疫病菌的抑菌活性。配制黑麥培養(yǎng)基，并按照培養(yǎng)基：藥 ε=9：1 的比例向培養(yǎng)基中分別加入Se、 Se、CMCS @ Azo@ Se、嘧菌酯原藥和懸浮劑配制成藥物培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中各納米顆粒的濃度分別為0（對照）12.5、25.0，50.0，100.0mg/L 。待培養(yǎng)基固化后將致病疫霉病菌接種到藥物培養(yǎng)基上，每個(gè)處理濃度重復(fù)3次，觀察菌絲生長情況，評價(jià) CMCS@Azo@ Se對番茄晚疫病菌的抑菌效果。

1.2.9CMCS @ Azo@Se對番茄植株安全性探究2023年10月在溫室將番茄種子浸種催芽并在幼苗長出3張真葉后進(jìn)行移栽。待番茄生長4周后，將 100mL 質(zhì)量濃度為 100mg/L 的 CMCS@Azo@ Se藥液噴灑到番茄葉片表面。在施藥處理后7d，測量對照組和 CMCS@Azo@ Se處理組番茄植株的株高、根長、干重和鮮重。剪取各組番茄同一部位 _0.1g 的葉片，用于檢測葉綠素和類胡蘿卜素含量。每組加入 3mL 80% 丙酮進(jìn)行提取，避光靜置 24h 。離心過濾后，吸取 3mL 上清液置于比色血中，以 80% 丙酮為對照，用紫外-可見分光光度計(jì)測定波長分別為 663，645，440nm 處的吸光度 （D）^[23] 。根據(jù)下列公式計(jì)算葉綠素以及類胡蘿卜素的濃度：

葉綠素a的濃度 （C_a）=12.7×D_663nm-2.69× D645 mm ; （3）

葉綠素 b 的濃度 （C_b）=22.9×D_645nm-4.68× D663 nm;； （4）

類胡蘿 h 素濃度 （C_a+C_b） ： （5）

葉綠素總濃度 （C_r）=C_a+C_b 。

2 結(jié)果與分析

2.1 Se、 Se和 CMCS@Azo@ Se表征結(jié)果

研究表明，所制備的Se呈球形，大小均勻且具有介孔結(jié)構(gòu)（圖1）。SEM和TEM圖像均表明合成的 Azo@Se 在CMCS包裹下進(jìn)一步團(tuán)聚，并觀察到CMCS的包封結(jié)構(gòu)。通過DLS分析測得Se、 Azo@ Se、CMCS@Azo@Se的平均粒徑分別為63.9、72.3、147.1nm （圖2）。

吸附-脫附結(jié)果表明，Se的等溫曲線為 IV 型等溫曲線（圖3）。在分壓 0.8～1.0 時(shí)，出現(xiàn)遲滯環(huán)，表明Se存在介孔結(jié)構(gòu)，并有利于Se吸附更多的農(nóng)藥。研究表明，Se的平均孔徑為 3.53nm ，比表面積為212m²/g ，孔體積為 0.42cm³/g 。

紅外光譜結(jié)果顯示， Azo@ Se和 CMCS@Azo@ Se在 出現(xiàn)了與Azo相同的特征峰，并且 CMCS@Azo@ Se在 1654，1455 、1 311cm 處出現(xiàn)了與CMCS相同的特征峰。結(jié)果表明，Azo成功負(fù)載到Se的孔道中，并且CMCS成功包封于納米顆粒表面（圖4）。

熱重曲線圖（圖5）表明，Se在 0～300^°C 時(shí)重量并未發(fā)生明顯改變，表明Se具有熱穩(wěn)定性。CMCS@Azo@ Se在研究范疇內(nèi)出現(xiàn)了3次減重現(xiàn)象，分別在 250，350，500° 。首次失重是由于CMCS受熱分解產(chǎn)生，第2次失重則是 CMCS@ Azo 中負(fù)載的Azo在高溫下的分解，最后是Se的熱分解階段。由圖5可知，Se和 CMCS@Azo@ Se具有良好的熱穩(wěn)定性并在環(huán)境中穩(wěn)定存在，通過公式（1）得到 Azo（?） Se和 CMCS@Azo@ Se的載藥率為分別為 19% 和 14.3% 。

2.2 CMCS @ Azo（?） Se的釋放性能

由圖6可知，當(dāng) pH 值為5.8時(shí)， CMCS@ Azo @

Se的累計(jì)釋放率最低，而在 pH 值為7.2或9.0的條件下，累計(jì)釋放的Azo較多。CMCS @ Azo @ Se在釋放介質(zhì)中累計(jì)釋放 ^48h 后，在 pH 值為5.8條件下，累計(jì)釋放率為 65% ，而在 pH 值 =7.2 和 pH 值 Σ=Σ 9.0條件下累計(jì)釋放率分別為 75% 和 80% 。結(jié)果表明， CMCS@Azo@ Se對堿性條件敏感，可在堿性

環(huán)境中快速釋放 Azo 0

2.3CMCS @ Azo @ Se對番茄晚疫病菌的作用

研究結(jié)果（表1）表明，5個(gè)處理均對番茄晚疫病菌具有抑制作用，其中 Azo（?） Se的抑制效果最好，抑制中濃度（ EC₅₀ ）值為 33.38mg/L;CMCS@Azo@ Se次之， EC₅₀ 值為 42.50mg/L_? 。而Se雖然效果不如其他制劑，但仍然表現(xiàn)出一定的抑菌作用。結(jié)果表明， Se和CMCS@Azo@Se提高了Azo對番茄晚疫病菌的抑制作用（圖7）。基于以上結(jié)果，繼續(xù)以 50，100mg/L 這2種濃度來探究各處理在不同時(shí)間段對番茄晚疫病菌的抑制變化情況，結(jié)果顯示，96h 時(shí)，CK培養(yǎng)基上已布滿菌絲，而 Azo@ Se和CMCS@Azo@ Se處理的培養(yǎng)基上菌絲分布僅占1/2培養(yǎng)基大?。▓D8）。結(jié)果表明，所制備的 Azo@ Se和 CMCS（ωAzo（ω） Se在離體條件下對番茄晚疫病菌的抑制作用穩(wěn)定。

2.4CMCS @ Azo@Se對番茄植株的安全性CMCS @ Azo@Se處理番茄植株7d，各組植株均生長良好，與CK相比，根長、株高、干重、鮮重生理參數(shù)均顯著（ Plt;0.05） 或極顯著（ Plt;0.01 增加（圖9）。葉綠素和類胡蘿卜素是植物光合作用重要的生理指標(biāo)[24]。進(jìn)一步探究CMCS @ Azo@ Se 對植物光合作用的影響，結(jié)果顯示，噴施 CMCS@ Azo @Se顯著提高番茄植株葉綠素濃度，而對照組與處理組的類胡蘿卜素濃度差異不顯著。綜上，噴施CMCS @ Azo@Se對番茄植株不會產(chǎn)生有害影響，且能促進(jìn)植株的生長和光合作用，表明CMCS @ Azo@Se 對番茄植株具有較好的安全性[25]

3結(jié)論

本研究成功將Azo負(fù)載到Se的孔道中，并結(jié)合CMCS包封構(gòu)建了 pH 值響應(yīng)型嘧菌酯納米控釋劑，結(jié)果表明，所制備的CMCS@Azo@Se對番茄晚疫病菌具有活性， CMCS@Azo@ Se對番茄植株有良好的安全性且具有一定的促生長作用，能提高植株光合效率。本研究制備的嘧菌酯納米農(nóng)藥可作為有效抑制植物病原菌的新型抗菌劑，為研發(fā)更多的用于植物病原菌防控的新型納米抗菌劑提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]張舒亞，周明國.甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的生物學(xué)及應(yīng)用技術(shù)研究［M].中國植物病害化學(xué)防治研究第三卷.北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2002.

[2]姚俊偉.嘧菌酯納米劑型構(gòu)建及其提質(zhì)增效機(jī)理[D].楊凌：西

北農(nóng)林科技大學(xué)，2019.

[3]何烈干，鄒芬，李湘民，等.江西省番茄綿疫病菌對嘧菌酯的敏 感性檢測及抗性風(fēng)險(xiǎn)分析[J]：農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2021，23（1）：117- 123.

[4]GaoTQ，ZhangBR，WuZC，etal.FabricationofROS-responsive nanoparticles by modifying the interior pore-wall ofmesoporous silica for smartdelivery ofazoxystrobinJ].Journal of Materials Chemistry.B，2023，11（48）：11496-11504.

[5]Meng ZY，Wu QC，Wu XY，et al.Nanoparticlesof Fe₃O₄ loaded with azoxystrobin and pectin to enhance resistance of rice to sheath blight[J].ACSAppliedNanoMaterials，2024，7（3）：2675-2686.

[6] Sheikhalipour M ，Esmaielpour B，Behnamian M，et al. Chitosan - selenium nanoparticle（Cs-Se NP） foliar spray alleviates salt stress inbittermelon[J].Nanomaterials，2021，11（3）：684.

[7]Li D，Zhou C R，Ma JL，et al． Nanoselenium transformation and inhibition ofcadmium accumulation byregulating the lignin biosynthetic pathway and plant hormone signal transduction in pepper plants[J].Journal ofNanobiotechnology，2021，19（1）：316.

[8]ZhuYY，DongYW，ZhuN，etal.Foliarapplicationofbiosynthetic nano-seleniumalleviatesthe toxicityofCd，Pb，andHginBrassica chinensisby inhibitingheavymetal adsorptionand improving antioxidant system in plant[J].Ecotoxicologyand Environmental Safety，2022，240：113681.

[9]Kang L，Wu Y L，Zhang JB，et al. Nano - selenium enhances the antioxidant capacity，organicacids and cucurbitacinBin melon （Cucumis melo L.）plants[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2022，241：113777.

[10]Zhang CY，Zhai X N，Zhao G H，etal.Synthesis，characterization， and controlled release of selenium nanoparticles stabilized by chitosan of diffrent molecular weights[J]. Carbohydrate Polymers， 2015，134：158-166.

[11]Cui D X，Yan C Q，Miao JQ，et al. Synthesis，characterization and antitumor properties of selenium nanoparticles coupling with ferulic acid[J].MaterialsScienceamp;Engineering.C，Materialsfor Biological Applications，2018，90：104-112.

[12] Cao J Q，Zhang Y B，Zhang P G，et al. Turning gray selenium into a nanoaccelerator of tissue regeneration by PEG modification[J]. BioactiveMaterials，2022，15：131-144.

[13]Tran P A，Webster T J. Selenium nanoparticles inhibit Staphylococcus aureusgrowth[J].International Journal of Nanomedicine，2011，6： 1553-1558.

[14]Huang XQ，Chen X，Chen Q C，et al. Investigationof functional selenium nanoparticles aspotent antimicrobial agentsagainst superbugs[J].ActaBiomaterialia，2016，30：397-407.

[15]Bartunek V，Vokatá B，Kolakovd K，et al.Preparation of amorphous nano-selenium-PEG composite network with selective antimicrobial activity[J].MaterialsLetters，2019，238：51-53.

[16]LiuJW，ZhuXF，ChenX，etal.Defense and inhibitionintegrated mesoporous nanoselenium delivery system against tomato gray mold [J].Environmental Science：Nano，2020，7（1） ：210-227.

[17]Singh D，Singh M.Hepatocelllar-targeted mRNA delivery using functionalized selenium nanoparticlesin vitro[J].Pharmaceutics， 2021，13（3） ：298.

[18]LiuYN，HuangYQ，LiuJW，etal.Atemperature-responsive selenium nanohydrogel for strawberry grey mould management[J]. Journal ofMaterials ChemistryB，2022，10（27）：5231-5241.

[19]Miglani S，Tani - Ishii N. Biosynthesized selenium nanoparticles： characterization，antimicrobial，and antibiofilm activityagainst Enterococcus faecalis[J]. PeerJ，2021，9：e11653.

[20]Sani-e-Zahra，Iqbal MS，AbbasK，et al.Synthesis， characterizationand evaluation of biological propertiesof selenium nanoparticles from Solanum lycopersicum[J].Arabian Journal of Chemistry，2022，15（7）：103901.

[21]朱龍寶，沈殿晶，趙明，等.水熱合成法制備魚藤酮納米顆粒 的方法研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（4）：74-78.

[22]麥嘉雯，丘潔龍，吳方君，等．石墨烯對 TiO₂ 納米材料性能的影 響[J]．微納電子技術(shù)，2014，51（4）：219-223，242.

[23]劉嘉偉.復(fù)合納米硒載藥體系用于防治植物灰霉病的研究 [D].廣州：暨南大學(xué)，2020.

[24]Alyemeni M N，Ahanger M A，Wijaya L，etal. Correction to： Selenium mitigates cadmium-induced oxidative stress in tomato （Solanum lycopersicum L.）plants by modulating chlorophyll fluorescence，osmolyte accumulation，and antioxidant system[J]. Protoplasma，2018，255（3） ：985-986.

[25]Cheng B X，Wang C X，Chen F R，et al. Multiomics understanding of improved quality in cherry radish（Raphanus sativus L.var. radculusPers.）after foliar application of selenium nanomaterials [J].Science of the Total Environment，2022，824：153712.