NCOA4對(duì)KRASG12C突變型胰腺癌靶向抑制劑獲得性耐藥的影響及其機(jī)制

[摘要］目的探究核受體共激活因子4（NCOA4）對(duì) KRASG12C突變型胰腺癌靶向抑制劑獲得性耐藥的影響及其機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞、PANC-1細(xì)胞、MIA-PaCa-2 細(xì)胞，利用MIA-PaCa-2 細(xì)胞構(gòu)建MIA-PaCa-2阿達(dá)格拉西布耐藥細(xì)胞系（Res-MIA），并使用慢病毒構(gòu)建敲低 NCOA4 基因的MIA-PaCa-2耐藥細(xì)胞系（Res-MIA-KD）。將Res-MIA細(xì)胞分為a、d組，Res-MIA-KD細(xì)胞分為b、c組，向c和d組中加入阿達(dá)格拉西布（ 2μmol/L） 進(jìn)行處理，a和b組不加入藥物處理。再將MIA-PaCa-2細(xì)胞分為A、B、C組，Res-MIA細(xì)胞分為D、E、F組，A、D組為對(duì)照組，B、E組為索托拉西布 （2μmol/L） 處理組，C、F組為阿達(dá)格拉西布 （2μmol/L） 處理組。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)檢測(cè) MIA-PaCa-2 細(xì)胞與Res-MIA 細(xì)胞間的差異基因表達(dá)，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞活力，通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中NCOA4 和FTH1的相對(duì)表達(dá)水平，通過 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲和遷移能力。將雄性BALB/c裸鼠分為 I～I(xiàn)V 組， I，IV 組裸鼠胰腺原位注射Res-MIA細(xì)胞，I、Ⅲ組裸鼠胰腺原位注射Res-MIA-KD細(xì)胞，從第14天開始，IⅢI、 N 組裸鼠每周2次腹腔注射阿達(dá)格拉西布生理鹽水溶液（ 10mg/kg） ，1、Ⅱ組裸鼠同時(shí)腹腔注射等體積生理鹽水，第28天時(shí)分離腫瘤并計(jì)算腫瘤體積和質(zhì)量。結(jié)果CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng) 0，10，50，100，1 000，2 000nmol/L 阿達(dá)格拉西布處理 ^72h 后，CFPAC-1細(xì)胞和PANC-1細(xì)胞的細(xì)胞活力無顯著變化 ?Pgt;0.05? ，MIA-PaCa-2細(xì)胞的細(xì)胞活力隨阿達(dá)格拉西布濃度升高而顯著降低 （F=239.24，t_LSD=3.68～30.10，Plt;0.05） ；經(jīng) 0，10，50，100，1 000，2 000nmol/L 索托拉西布和阿達(dá)格拉西布處理 ^72h 后，Res-MIA細(xì)胞的細(xì)胞活力無顯著變化 ΔPgt;0.05Δ \" a，d 組的細(xì)胞活力無顯著差異（ ?Pgt;0.05 ），b、c組細(xì)胞活力顯著低于a、d組（ ΔPlt;0.05Δ ，c組細(xì)胞活力顯著低于 b 組 ?Plt;0.05? 。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，Res-MIA細(xì)胞中NCOA4基因表達(dá)水平顯著高于MIA-PaCa-2細(xì)胞（ ?Plt;0.05） 。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組和C組細(xì)胞中NCOA4蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著低于A組，D組顯著高于A組，E組顯著低于D組 Δ^°（F=366.20，t=4.69～22.71 Plt;0.05 ）;B、C組細(xì)胞中FTH1相對(duì)蛋白表達(dá)水平顯著低于A組，D組顯著高于A組，E、F組顯著高于D組（ F= 702.16，t=7.36～49.15，Plt;0.05） ;Res-MIA-KD細(xì)胞中NCOA4和FTH1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著低于Res-MIA細(xì)胞 （t=16.27，92.26，Plt;0.05） 。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Res-MIA細(xì)胞的細(xì)胞遷移數(shù)目和細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著低于Res-MIA-KD細(xì)胞 （t=9.83，7.19，Plt;0.05） 。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，I、Ⅳ組裸鼠腫瘤體積與質(zhì)量無顯著差異C Pgt;0.05） ， I 、I組裸鼠腫瘤體積與質(zhì)量顯著低于I、V組（ Plt;0.05） ，Ⅲ組裸鼠腫瘤體積與質(zhì)量顯著低于Ⅱ組C ?Plt;0.05） 。結(jié)論KRASG12C突變型胰腺癌可通過NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬增強(qiáng)其對(duì)靶向藥物阿達(dá)格拉西布的耐藥性，抑制NCOA4表達(dá)可恢復(fù)耐藥胰腺癌細(xì)胞對(duì)阿達(dá)格拉西布的敏感性。

[中圖分類號(hào)] R735.9 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

Role and mechanism of action of nuclear receptor coactivator 4 in the development of acquired resistance to targeted inhibitors in pancreatic cancer with KRAS G12C mutationCHANG Hao， WANG Ya' nan， LIU Shihai ，WANG Jing （Department of Oncology，The Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the role and mechanismof actionofnuclearreceptor coactivator4（NCOA4）in acquiredresistancetotargetedinhibitorsinpancreaticcancer withKRASG12Cmutation.MethodsHuman pancreaticcancercell lines CFPAC-1，PANC-1，andMIA-PaCa-2wereculturedinvitro.MIA-PaCa-2cels wereusedtoestablishanadagrasib-resistant celline（Res-MIA），andalentivirus wasusedtoestablishadrug-resistant MIA-aCa-2cellinewith NCOA4knockdown（ResMIA-KD）.Res-MIAcelsweredivided into groupsaandd，whileRes-MIA-KDcells weredividedinto grousbandc;thecels in groups cand d were treated with adagrasib ，while those in groups a and b received no drug treatment. Subsequently，MIAPaCa-2 cells were divided into groups A，B，and C，and Res-MIA cells were divided into groups D，E，and F;groups A and D were established as control groups，the cells in groups B and E were treated with sotorasib （2μmol/L） ，and those in groups C and F were treated with adagrasib 2μmol/L） . The transcriptome sequencing technique was used to detect differentially expressed genes between MIA-PaCa-2 andRes-MIA cels; CCK-8 assay was used to assesscellviability ineach group;Western bloting was usedto measure the relative protein expression levels of NCOA4andFTH1ineach group;Transwellassy wasused toobservecellinvasionand migrationablitiesineach group.Male BALB/cnude mice weredivided into groupsI，I，Il，andIV，andthemice in groups I and IV received orthotopic pancreatic injection of Res-MIA cells，while those in groups I and II were given orthotopic injection of Res-MIA-KD cells. Since day 14，the mice in groups II and IV were given intraperitoneal injection of adagrasib （ .10mg/ （20 kg）in normal saline twice a week，while those in groups I and I were given intraperitoneal injection of an equal volume of normal saline，andtumors wereharvestedonday28 tomeasure tumorvolumeand weight.ResultsCCK-8assyshowedthatafter treatment with adagrasib （0，10，50，100，1 000 ，or 2000nmol/L? for ^72h ，there was no significant change in the viability of CFPAC-1 and PANC-1 cells （ ?Pgt;0.05? ，while the viability of MIA-PaCa-2 cells decreased significantly with the increase in the concentration of adagrasib （F=239.24，t_LSD=3.68-30.10，Plt;0.05） .After treatment with sotorasib or adagrasib（0，10，5O，100， 1000，or 2000nmol/L ）for ^72h ，there was no significant change in the viability of Res-MIA cells（ Pgt;0.05 ），and there was no significant difference in cell viability between groups a and d （ Pgt;0.05 ；groups b and c had a significantly lower cell viability than groups a and d （ ，and group c had a significantly lower cel viability than group b（ Plt;0.05 ）. Transcriptome sequencing showed that theexpresion levelof NCOA4 inRes-MIAcells was significantly higher thanthat in MIA-PaCa-2cels （ ） Western bloting showed that groups Band Chadasignificantly lowerrelative protein expressionlevelof NCOA4 than group A， andgroupDhadasignificantlyhigherexpresionlevelthangroupA，whilegroupEhadasignificantlylowerexpressionlevelthan group D Δ^′F=366.20，t=4.69-22.71，Plt;0.05） ； groups B and C had a significantly lower relative protein expression level of FTH1 thangroup A，groupDhadasignificantly higherexpressionlevel than groupA，and groupsEandFhadasignificantlyhigherexpression level than group D （ ?F=702.16，t=7.36-49.15，Plt;0.05） ； the relative protein expression levels of NCOA4 and FTH1 in Res-MIA-KD cells were significantly lower than those in Res-MIA cells （t=16.27，92.26，Plt;0.05） . Transwell assay showed that compared with Res-MIA-KDcells，Res-MIA cels had significantly lower numbers of cell migration and invasion （ "P "lt; "0 . 0 5" .Animal experiments showed no significant diferences in tumor volume and weight between nude mice of groups Iand V Pgt;0.05? ，and nude mice of groups I and I had significantly lower tumor volume and weight than groups I and N （ Plt; 0.05），while nude mice of group II had significantly lower tumor volume and weight than group I （ Plt;0.05） .Conclusion Pancreatic cancer with KRAS G12C mutation can enhance its resistance tothe targeted agent adagrasib through NCOA4-mediated feritinophagy，and inhibition of NCOA4expression can restore the sensitivityof pancreaticcancer cels to adagrasib.

[KEY WORDs]Pancreatic neoplasms；Feritinophagy；Apoferritins；Nuclearreceptorcoactivator4；Adagrasib；Sotorasib; Molecular targeted therapy；Drug resistance，neoplasm；Proto-oncogene proteins p21（ras）；Mutation

胰腺癌是致死率極高的惡性腫瘤，患者總體五年生存率低于 10% ，大多治療方案無效，整體預(yù)后不佳[1]。Kirsten大鼠肉瘤病毒癌（KRAS）基因是人體惡性腫瘤當(dāng)中最常見的致癌突變基因之一，約90% 的胰腺癌存在KRAS突變]。KRAS基因的突變會(huì)使其下游信號(hào)通路異?；罨?，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，進(jìn)而引發(fā)惡性腫瘤[3-4]。KRAS基因突變大多發(fā)生在其第12和13個(gè)密碼子上，例如G12C突變（第12個(gè)密碼子的甘氨酸被半胱氨酸取代）[5]。有研究表明，KRASG12C抑制劑索托拉西布和阿達(dá)格拉西布能夠抑制KRAS依賴性信號(hào)傳導(dǎo)[，從而緩解KRASG12C突變型惡性腫瘤患者的疾病進(jìn)展[7-9]。然而，KRASG12C抑制劑存在原發(fā)性耐藥與獲得性耐藥等問題[10]，嚴(yán)重影響藥物對(duì)胰腺癌的療效。鐵自噬是以鐵重鏈蛋白1（FTH1）為主的鐵蛋白在選擇性自噬適配器蛋白核受體共激活因子4（NCOA4）介導(dǎo)下進(jìn)行溶酶體降解的過程，可釋放胞內(nèi)鐵離子供腫瘤細(xì)胞利用，與胰腺癌患者的生存率以及治療抵抗密切相關(guān)[1]。本研究構(gòu)建KRASG12C突變型胰腺癌耐藥細(xì)胞系及胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型，從體內(nèi)外探究NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬在KRASG12C突變型胰腺癌對(duì)靶向抑制劑獲得性耐藥中的作用及其機(jī)制，旨在為對(duì)靶向抑制劑獲得性耐藥的KRASG12C突變型胰腺癌患者的治療方案提供思路。

T 材料與方法

1.1 材料來源

索托拉西布、阿達(dá)格拉西布、CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司，慢病毒產(chǎn)品購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，RNAisoPlus購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)用電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽以及電泳槽購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，PVDF膜購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，三色預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，兔源性NCOA4抗體、FTH1抗體、兔源性 β -actin抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，RIPA細(xì)胞裂解液、 4% PFA固定液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理

人胰腺癌細(xì)胞系MIA-PaCa-2細(xì)胞（含KRASG12C突變）購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司，使用含 10% 胎牛血清、 5% 馬血清和 1% 青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）培養(yǎng)；人胰腺癌細(xì)胞系CFPAC-1細(xì)胞和PANC-1細(xì)胞購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，使用含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MIA-PaCa-2細(xì)胞構(gòu)建MIA-PaCa-2 阿達(dá)格拉西布耐藥細(xì)胞系（Res-MIA細(xì)胞）[12]，并使用慢病毒（上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司）構(gòu)建敲低NCOA4基因的MIA-PaCa-2耐藥細(xì)胞系（Res-MIA-KD細(xì)胞）。上述各細(xì)胞均置于培養(yǎng)箱（ 37^°C 、含體積分?jǐn)?shù) 0.05CO₂ 、濕度 95% ）中培養(yǎng)。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CFPAC-1細(xì)胞、PANC-1細(xì)胞、MIA-PaCa-2細(xì)胞、Res-MIA細(xì)胞接種到96孔板（每孔含5000個(gè)細(xì)胞）中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 后，分別加入0、10、50、100、1000.2000nmol/L 的阿達(dá)格拉西布或索托拉西布繼續(xù)培養(yǎng) ^72h 。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Res-MIA細(xì)胞和Res-MIA-KD細(xì)胞接種到96孔板（每孔含5000個(gè)細(xì)胞）中，將Res-MIA細(xì)胞分為a、d組，ResMIA-KD細(xì)胞分為b、c組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 后，向c組和d組中加入阿達(dá)格拉西布 （2μmol/L） ，a組和b組不加人藥物，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) ^72h ，用于后續(xù)CCK-8實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MIA-PaCa-2細(xì)胞和Res-MIA細(xì)胞以約 50% 的細(xì)胞密度接種于 25cm² 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，MIA-PaCa-2細(xì)胞分為A、B、C組，Res-MIA細(xì)胞分為D、E、F組。其中，A、D組細(xì)胞使用完全培養(yǎng)基，B、E組細(xì)胞使用含 2μmol/L 索托拉西布的完全培養(yǎng)基，C、F組細(xì)胞使用含 2μmol/L 阿達(dá)格拉西布的完全培養(yǎng)基，各組細(xì)胞均置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ^72h 后用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.3轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序及基因富集分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MIA-PaCa-2、Res-MIA細(xì)胞，使用 1mL RNAisoPlus充分裂解，液氮凍存，每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣本，委托徐州元莘生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序。對(duì)基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析，獲得兩種細(xì)胞間的差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能富集分析（http：//geneontology.org）以及KEGG通路富集分析（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）。

1.4蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中NCOA4、FTH1蛋白表達(dá)水平

取 A～F 組細(xì)胞和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Res-MIA細(xì)胞、Res-MIA-KD細(xì)胞，使用PBS清洗后，加入RI-PA裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，使用BCA試劑盒對(duì)蛋白的濃度進(jìn)行檢測(cè)，而后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳， 290mA 條件下轉(zhuǎn)膜， 5% 的脫脂奶粉封閉，加入NCOA4、FTH1蛋白一抗 （1：1000） 于 4^°C 下孵育過夜，加入兔二抗 （1：5000） 室溫孵育 ¹h 。使用ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒在凝膠成像系統(tǒng)中顯影后，使用蛋白印跡膜再生液剝脫一抗與二抗，孵育 β- actin抗體，而后進(jìn)行顯影。使用ImageJ軟件定量分析蛋白條帶灰度值。以 β -actin為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平 °leddash 目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力

取 a～d 組細(xì)胞和經(jīng)不同濃度阿達(dá)格拉西布、索托拉西布處理 ^72h 后的CFPAC-1、PANC-1、MIA-PaCa-2、Res-MIA細(xì)胞，按照CCK-8試劑盒說明書的要求，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在 450nm 波長(zhǎng)下的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

用于檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的Transwell小室中加人 200μL 無血清DMEM培養(yǎng)基，用于細(xì)胞侵襲能力的Transwell小室中加人 80μL 基質(zhì)膠和無血清DMEM培養(yǎng)基的混合液 （1：7） ，均放入24孔板中并置于 培養(yǎng)箱中孵育 3h 。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Res-MIA與Res-MIA-KD細(xì)胞，接種于上述的各Transwell小室中（每孔含 1×10⁵ 個(gè)細(xì)胞），下室中加入 600μL 含 30% FBS 的DMEM培養(yǎng)基，置于37^°C 、含體積分?jǐn)?shù) 0.05CO₂ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12h 取出各組Transwell小室，使用 4% PFA固定液固定 20min ，擦去Transwell小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，置于結(jié)晶紫染液中染色 5min ，PBS清洗3次，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。每孔記錄5個(gè)視野，結(jié)果取平均值。

1.7 動(dòng)物分組及處理

SPF級(jí)雄性BALB/c裸鼠24只，4周齡，體質(zhì)量 14～16g ，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，每周更換無菌墊料及飼料。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將24只裸鼠隨機(jī)分為 I～ N組，每組6只。通過動(dòng)物氣體麻醉機(jī)，使用異氟烷麻醉裸鼠，于左肋下約 0.5cm 處開腹并找到胰腺，胰腺原位注射 200μL 含有 2×10⁶ 個(gè)腫瘤細(xì)胞（I、V組裸鼠為Res-MIA細(xì)胞，I、IⅢ組裸鼠為Res-MIA-KD細(xì)胞）的PBS混懸液，分層縫合腹腔。從第14天開始，Ⅲ、 IV 組腹腔注射阿達(dá)格拉西布生理鹽水溶液 （10mg/kg） ，I、Ⅱ組裸鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，均每周注射2次，每次間隔 3.5d 。第28天時(shí)經(jīng)異氟烷麻醉后脫頸椎處死各組裸鼠，解剖并分離腫瘤，測(cè)量腫瘤體積和質(zhì)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用R4.2.1、GraphpadPrism 9 和 SPSS26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 表示。多組間比較采用單因素方差分析，細(xì)胞活力、腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量數(shù)據(jù)采用 2×2 析因設(shè)計(jì)的方差分析進(jìn)行比較，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD- ?t 檢驗(yàn)；兩組間的比較采用獨(dú)立樣本 Ψ_t 檢驗(yàn)。以 Plt;0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度阿達(dá)格拉西布對(duì)三種胰腺癌細(xì)胞系細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng) 0，10，50，100，1 000 、2000nmol/L 阿達(dá)格拉西布處理后，CFPAC-1細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為 （100.00±1.89）% （100.07± 2.11）% 、 （99.63±3.23）% 、 （100.38±3.96）% （101.96±5.48）% 三， （101.30±2.47）% ，各組之間無顯著性差異 （Pgt;0.05） ；PANC-1的細(xì)胞活力分別為（100.00±1.93）% （100.12±1.93）% 、 （99.69± 2.85）%_s（98.98±2.76）%_s（100.00±3.16）% 、（98.59±4.22）% ，各組間比較沒有顯著性差異（ Pgt; 0.05）;MIA-PaCa-2的細(xì)胞活力分別為 （100.00± 8.74）% 、 65.36±1.95）% 、 （55.37±2.52）% 、號(hào) （40.33±3.66）% 、 （26.48±2.35）% 、（ 18.19± 2.31）% ，各濃度組間比較差異具有顯著意義（ F= 239.24，Plt;0.05） ，各濃度間兩兩比較差異均具有顯著性 （t_LSD=3.68～30.10，Plt;0.05） 。

2.2不同濃度索托拉西布和阿達(dá)格拉西布對(duì)RestMIA細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng) 0.10，50，100，1 000 2000nmol/L 索托拉西布處理之后，Res-MIA細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為 （100.00±6.13）% 二 （87.69± 6.47）% 、 90.44±5.78）% 、（ 90.50±4.41）% （94.49±9.02）% （ （91.59±7.36）% ，各濃度組間相比較差異無顯著性 （Pgt;0.05） 。經(jīng)0、10、50、100、1000.2000nmol/L 的阿達(dá)格拉西布處理后，Res-MIA細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為 （100.00±3.69）% ，電 （100.93±7.67）% （ （100.38±7.62）% ： （94.91± 7.45）%_v（94.29±7.11）%_v（95.41±12.36）% ，各濃度組間比較差異無顯著性 （Pgt;0.05） 。

2.3各組細(xì)胞中NCOA4和FTH1基因和蛋白表達(dá)水平比較

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，與MIA-PaCa-2細(xì)胞相比，Res-MIA細(xì)胞中有1247個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，534個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)，其中NCOA4基因與FTH1基因表達(dá)水平顯著上調(diào) （Plt;0.05 。

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， A～F 組NCOA4蛋白相對(duì)表達(dá)水平各組間比較具有顯著差異（ F= 366.20，Plt;0.05） ；其中，B、C組顯著低于A組 ?_t= 22.66～22.71 ， Plt;0.05 ），D組顯著高于A組（ ?_t= 4.69，Plt;0.05）， D組亦顯著高于E組 （t=5.42，Plt; 0.05），D、F組間無顯著差異 （Pgt;0.05） 。 A～F 組FTH1相對(duì)蛋白表達(dá)水平比較存在顯著差異（ F= 702.16，Plt;0.05） ；其中，B、C組顯著低于A組 （t= 28.18～49.15 ， Plt;0.05 ），D組顯著高于A組（ ?_t= 7.36，Plt;0.05），E，F(xiàn) 組顯著高于D組（ t=16.56～ 46.00，Plt;0.05） 。見圖1、表1。

Res-MIA細(xì)胞以及Res-MIA-KD細(xì)胞當(dāng)中的NCOA4蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為 1.191±0.063 ，0.593±0.008 ，F(xiàn)TH1蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為1.419±0.017，0.404±0.009 ，與Res-MIA細(xì)胞相比，Res-MIA-KD細(xì)胞中NCOA4、FTH1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低 （t=16.27，92.26，Plt;0.05） 。見圖2。

2.4 a～d 組細(xì)胞活力比較

Ω₁～dΩ 組細(xì)胞活力分別為 （100.00±1.89）% 、（77.42±2.27）% 、（ （41.69±1.38）% 、 92.41± 1.30）% ，各組間細(xì)胞活力的比較采用 2×2 析因設(shè)計(jì)方差分析，其中兩因素分別為“敲低類型（是否敲低NCOA4基因）\"和“藥物處理（是否進(jìn)行阿達(dá)格拉西布處理）”。結(jié)果顯示， 敲低類型+藥物處理 430.84， Plt;0.05 。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，給予敲低NCOA4基因處理時(shí)，兩種藥物處理組的平均值差值為 35.74，Plt;0.05 ;進(jìn)行阿達(dá)格拉西布處理時(shí)，兩種敲低類型組的平均差值為 50.72，Plt;0.05 。

2.5Res-MIA 細(xì)胞和Res-MIA-KD細(xì)胞遷移與侵襲能力比較

Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，Res-MIA細(xì)胞和 Res-MIA-KD細(xì)胞的細(xì)胞遷移數(shù)目分別為 （63.6± 8.3）和 （23.4±3.8） 個(gè)，兩組間比較差異具有顯著意 義 （t=9.83，Plt;0.05） ；兩種細(xì)胞的細(xì)胞侵襲數(shù)目分 別為 （44.0±9.9） 和 （8.6±4.8） 個(gè)，兩組間比較差異 具有顯著性 （t=7.19，Plt;0.05） ，見圖3。

2.6各組裸鼠腫瘤體積與質(zhì)量比較

I～N 組裸鼠腫瘤體積為（ 460.12±89.11） ！（ 263.33±31.45） 、 （141.24±17.50） 以及 （455.92± 92.12）mm³ 。各組之間腫瘤體積的比較采用 2×2 析因設(shè)計(jì)的方差分析，其中兩因素分別為“敲低細(xì)胞（是否使用敲低NCOA4基因的細(xì)胞成瘤）\"和“藥物治療（是否進(jìn)行阿達(dá)格拉西布治療）”。結(jié)果顯示，F(xiàn) ：F 敲低細(xì)胞+藥物治療 =4.71 ， Plt;0.05 。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，條件為“使用敲低NCOA4基因的細(xì)胞成瘤\"時(shí)，兩藥物治療組的平均值差值為 122.09，Plt;0.05 ；條件為“進(jìn)行阿達(dá)格拉西布治療”時(shí)，兩敲低細(xì)胞組的平均差值為 314.68，Plt;0.05 ；條件為“不進(jìn)行阿達(dá)格拉西布治療”時(shí)，兩敲低細(xì)胞組的平均差值為196.78，Plt;0.05 。

I～I(xiàn)V 組裸鼠腫瘤質(zhì)量分別為 （0.29±0.03） ！（0.19±0.02 、 （0.10±0.02） 、 （0.29±0.09）g 。各組之間腫瘤質(zhì)量的比較采用 2×2 析因設(shè)計(jì)的方差分析，其中，兩因素分別為“敲低細(xì)胞（是否使用敲低NCOA4基因的細(xì)胞成瘤）\"和“藥物治療（是否進(jìn)行阿達(dá)格拉西布治療）”。結(jié)果顯示， F_#amp;#####=34.51 ，Plt;0.05;F_z;0;0;0;0;0=1.94，Pgt;0.05;F 敲低細(xì)胞 + 藥物治療 3.28，Pgt;0.05 ，交互效應(yīng)為邊緣顯著。見圖4。

3討論

KRAS是人類惡性腫瘤中最常見的致癌突變基因之一，大約占所有人類致癌突變基因頻率中的14% ，約 90% 的胰腺癌存在KRAS突變2]。多年來，研究人員投人了大量精力研發(fā)能夠直接抑制KRAS蛋白的藥物，但截至2021年，尚未有任何直接靶向KRAS蛋白的藥物被證實(shí)具有臨床療效，這使得KRAS突變長(zhǎng)期都被視為不可成藥靶點(diǎn)[13]2021年至今，索托拉西布、阿達(dá)格拉西布等靶向KRASG12C突變的共價(jià)抑制劑相繼獲批上市，這些藥物能夠抑制KRAS依賴性信號(hào)的傳導(dǎo)[，從而緩解KRASG12C突變惡性腫瘤患者的疾病的進(jìn)展[7-9]。然而，KRASG12C抑制劑存在原發(fā)性以及獲得性耐藥等問題[10]，嚴(yán)重影響其對(duì)胰腺癌的治療效果。

腫瘤細(xì)胞可以通過基因突變、表觀遺傳變化以及微環(huán)境的影響來獲得耐藥性[14-17]。研究表明，腫瘤細(xì)胞可以通過增加基因突變頻率來提升自身生存概率[18]。為了克服腫瘤的獲得性耐藥問題，目前已有許多策略被開發(fā)出來，例如使用BCL-2抑制劑與化療藥物聯(lián)合治療以增強(qiáng)藥物的抗腫瘤效果并減少耐藥性[19]，然而仍需進(jìn)一步研究以尋找更好的解決方案。

鐵自噬是選擇性自噬的一種特殊類型，其能夠在NCOA4的介導(dǎo)下，特異性降解以FTH1蛋白為主的鐵蛋白復(fù)合體，促使儲(chǔ)存鐵轉(zhuǎn)化為具有生物活性的游離鐵供腫瘤細(xì)胞利用[20-21]。觸發(fā)其他類型細(xì)胞死亡是克服傳統(tǒng)惡性腫瘤療法中耐藥性的一種新方法[22]，該策略在依托泊苷與順鉑耐藥神經(jīng)母細(xì)胞瘤和順鉑耐藥骨肉瘤的治療中已經(jīng)取得了一定成效[23-24]。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)研究中，促進(jìn)NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑治療的敏感性[25]。此外，NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬在胰腺惡性腫瘤維持存活和產(chǎn)生耐藥過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。然而，鐵自噬在KRASG12C抑制劑的獲得性耐藥方面的作用及其相關(guān)機(jī)制尚不明確?；谏鲜鲅芯勘尘?，本研究通過構(gòu)建KRASG12C突變型胰腺癌耐藥細(xì)胞系和胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型[12]，分別從體內(nèi)外探究NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬在KRASG12C突變型胰腺癌對(duì)靶向抑制劑獲得性耐藥中的作用及其機(jī)制。

為了探究胰腺癌針對(duì)阿達(dá)格拉西布耐藥的問題，本研究首先探討了PANC-1、CFPAC-1、MIA-PaCa^-2 三種人胰腺癌細(xì)胞在不同濃度阿達(dá)格拉西布處理下的細(xì)胞活力變化，結(jié)果顯示經(jīng)0、10、50、 阿達(dá)格拉西布處理 ^72h 后，CFPAC-1細(xì)胞和PANC-1細(xì)胞的細(xì)胞活力無顯著變化，MIA-PaCa-2細(xì)胞的細(xì)胞活力隨阿達(dá)格拉西布濃度升高而顯著降低，提示攜帶KRASG12C突變的MIA-PaCa-2細(xì)胞對(duì)阿達(dá)格拉西布存在特異性敏感。隨后本研究使用逐步遞增培養(yǎng)基中靶向藥物濃度的方式[12]構(gòu)建了針對(duì)阿達(dá)格拉西布耐藥的Res-MIA細(xì)胞，經(jīng) 0，10，50，100，1 000，2 000nmol/ L索托拉西布和阿達(dá)格拉西布處理 ^72h ，Res-MIA細(xì)胞的細(xì)胞活力均無顯著變化。該結(jié)果提示本研究構(gòu)建的Res-MIA細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性，并且對(duì)兩款已上市的KRASG12C靶向抑制劑均具耐藥性。

本研究中，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，相比于MIA-PaCa-2細(xì)胞，Res-MIA細(xì)胞中NCOA4、FTH1等鐵自噬相關(guān)基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B、C組NCOA4、FTH1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于A組且差異較大，E組上述兩種蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于D組但差異較小，F(xiàn)組上述兩種蛋白的相對(duì)表達(dá)水平與D組無顯著差異，說明MIA-PaCa-2細(xì)胞在兩種靶向抑制劑處理后NCOA4、FTH1蛋白表達(dá)被顯著抑制，Res-MIA細(xì)胞中NCOA4、FTH1蛋白表達(dá)水平則基本不受靶向抑制劑影響，提示MIA-PaCa-2細(xì)胞靶向耐藥后鐵自噬水平升高且不受靶向藥物抑制。為探究鐵自噬對(duì)耐藥現(xiàn)象的影響，本研究使用慢病毒敲低Res-MIA細(xì)胞中NCOA4基因的表達(dá)，并通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Res-MIA細(xì)胞與敲低NCOA4基因后的Res-MIA-KD細(xì)胞中NCOA4、FTH1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示敲低效率較佳。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Res-MIA-KD細(xì)胞的侵襲能力與遷移能力顯著低于Res-MIA細(xì)胞。采用 2×2 析因設(shè)計(jì)的方差分析對(duì) a～d 組細(xì)胞的細(xì)胞活力與 I～I(xiàn)V 組裸鼠的腫瘤體積和質(zhì)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在不敲低NCOA4時(shí)，是否給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯影響；而在敲低NCOA4時(shí)，是否給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在明顯影響，即在析因設(shè)計(jì)的方差分析中，相較于是否給藥，是否敲低NCOA4是更為關(guān)鍵的影響因素，對(duì)NCOA4的敲低顯著降低了耐藥胰腺癌細(xì)胞的增殖能力。上述研究結(jié)果提示，NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬在KRASG12C突變型胰腺癌細(xì)胞耐藥中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，KRASG12C突變型胰腺癌可通過NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬增強(qiáng)其對(duì)靶向藥物阿達(dá)格拉西布的耐藥性，抑制NCOA4基因的表達(dá)可恢復(fù)耐藥胰腺癌細(xì)胞對(duì)阿達(dá)格拉西布的敏感性。本研究為KRASG12C突變型胰腺癌患者的靶向抑制劑獲得性耐藥問題提供了可借鑒的解決思路。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（文件號(hào)AHQUMAL20-240417CH）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》當(dāng)中的條例進(jìn)行。

作者聲明：常昊、王靜、王亞南參與了研究設(shè)計(jì)；常昊、王靜、劉世海參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯李京蔓厲建強(qiáng)）

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根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB3358—82《統(tǒng)計(jì)學(xué)名詞及符號(hào)》的規(guī)定，樣本的算術(shù)平均數(shù)用英文小寫斜體 ;標(biāo)準(zhǔn)差用英文小寫斜體 s ;標(biāo)準(zhǔn)誤用英文小寫斜體 s ，下角 ，即 檢驗(yàn)用英文小寫斜體 t：F 檢驗(yàn)用英文大寫斜體 F ；卡方檢驗(yàn)用希臘文小寫斜體 χ² ；相關(guān)系數(shù)用英文小寫斜體 r ；自由度用希臘文小寫斜體 u （鈕）;概率用英文大寫斜體 P ；樣本數(shù)用英文小寫斜體 n 。請(qǐng)作者來稿時(shí)遵照?qǐng)?zhí)行。