吳茱萸湯對(duì)酒精性胃潰瘍的影響及其機(jī)制

[摘要］目的探討吳茱萸湯對(duì)酒精性胃潰瘍的影響及其機(jī)制。方法將雌性8周齡KM小鼠120只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組）、模型對(duì)照組（B組）、雷尼替丁組（C組）和吳茱萸湯低、中、高劑量組（D、E、F組），每組各 20只。A組和B組小鼠灌胃常溫蒸餾水 （10mL/kg） ，C組灌胃雷尼替?。?30mg/kg） ！ D～F 組灌胃吳茱萸湯湯劑（5、10.20mL/kg） ，持續(xù)灌胃7d后從 A～F 組小鼠中各抽取10只小鼠腹主動(dòng)脈全血無菌分離血清后用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，其余小鼠繼續(xù)灌胃蒸餾水或各藥物持續(xù) 21d 。分別于第7、14、21、28天時(shí)觀察并記錄各組小鼠的體質(zhì)量和進(jìn)食量。第 29天時(shí)，收集各組小鼠血清、胃液和胃組織，肉眼觀察各組小鼠胃組織的形態(tài)，通過 HE染色觀察胃黏膜組織病理學(xué)變化，檢測胃液體積、 pH 值和總酸度;通過ELISA法檢測小鼠血清IL-6、IL-1O、TNF- α 和PGE2水平；通過WB實(shí)驗(yàn)檢測小鼠胃黏膜組織中PI3K/Akt/NF- κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；通過生化指標(biāo)檢測評(píng)估各組小鼠胃黏膜組織中MDA、CAT、SOD和GSH- ?Px 水平。將人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）分為 a1～e1 組和 a2～f2 組，其中a1～e1 組細(xì)胞分別加入A、C、D、E、F組小鼠無菌血清； b2～f2 組細(xì)胞經(jīng) 0.8mol/L 乙醇處理， a2 組細(xì)胞加入等體積PBS， 后 a2～f2 組分別加入 A～F 組小鼠無菌血清，通過CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力。結(jié)果動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與B組相比， c～F 組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量均顯著升高，胃黏膜組織充血水腫、點(diǎn)狀潰瘍和炎性細(xì)胞浸潤情況均有不同程度改善，胃液體積和總酸度均顯著降低， pH 值顯著升高，血清IL-6、TNF- α?α∝ 、PGE2水平和胃黏膜組織 p -AKT/AKT比值、MDA水平均顯著降低，血清IL-1O 水平和胃黏膜組織 SOD、GSH- ?Px 水平顯著升高;C、E、F組小鼠在第14、21、28天進(jìn)食量均顯著升高，胃黏膜組織中核內(nèi)P65/胞漿P65 比值顯著降低;C、E組小鼠胃黏膜組織CAT水平顯著升高； D～F 組胃黏膜組織中 p -PI3K/PI3K比值顯著降低；E、F組小鼠胃黏膜組織中 p-IκBα/IκBα 比值顯著升高 （F=3.4～1 013.0，q=4.1～78.7，Plt;0.05） 。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn) c1～e1 組與al組相比細(xì)胞活力均無顯著性差異（ ΔPgt;0.05Δ ，培養(yǎng)第12、24、48小時(shí)時(shí) c2～f2 組細(xì)胞活力均顯著高于b2組 146.1，q=4.6～22.3，Plt;0.05） 。結(jié)論吳茱萸湯對(duì)酒精性胃潰瘍具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞PI3K/Akt/NF- ?κB 信號(hào)通路和炎癥因子水平以及抑制其氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

[中圖分類號(hào)] R573.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

Effect of Wuzhuyu Decoction on alcoholic gastric ulcer and its mechanism GAO Ruiyang ，LI Jing yao ， LI Pingxiang，GE Keli（Qingdao Medical College，Qingdao University，Qingdao 266073，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the efect of Wuzhuyu Decoction（WZYD）on alcoholic gastric ulcer and its mechanism. MethodsA total of120 female KM mice，aged 8 weeks，were randomly divided into normal control group（group A），model control group （group B），ranitidine group（group C），and low-， midle-，and high-dose WZYD groups （groups D ?-? F），with20 mice in each group. The mice in groups A and B were given distilled water （ 10mL/kg at room temperature by gavage，thosein group C were given ranitidine （30mg/kg ）by gavage，and those in groups D -F were given WZYD by gavage at a dose of 5，10，and 20mL/kg ，respectively. After 7 consecutive days of intragastric administration，10 mice were selected from each group，andserumwascollctedunderasepticconditionsfrcellexperiments，andtheremainingmicewerestillgivendistilldwaterorthedrugbygavageforanother21days.Bodyweightandfoodintakeofthe miceineachgroupwererecordedondays7，14，21，and 28.Onday29，serum，gastric juice，and gastrictisue samples werecolected;gastric morphology wasobserved withthenaked eye，andHEstainingwasusedtoobservethe histopathologicalchangesofgastric mucosa;thevolume，pHvalue，andtotalacidityof gastricjuice were measured；ELISA was used to measure the serum levels of IL-6，IL-1O，TNF- α ，and PGE2；Western blot（WB）wasused to measure the expression of PI3K/Akt/NF- κB pathway-related proteins in gastric mucosa；biochemical assays were used tomeasure the levels of MDA，CAT，SOD，and GSH- ?Px in gastric mucosa. Human gastric mucosal epithelial cells （GES-1） were divided into groups al-el and a2-f2 . The cels in groups al一el were treated with the aseptic serum from groups A，C，D，E，andF，respectively. The cells in groups b2-f2 were treated with 0.8mol/L ethanol，while those in group a2 were treated with an equalvolume of PBS；after 4 hours of treatment，the cells in groups a2-f2 were treated with the aseptic serum from groups A-F . CCK8 assay was usedto measurecellviabilityineach group.ResultsThe animal experiment showedthatcompared with groupB， groups C-F had a significant increase in body weight at different time points，along with varying degrees of improvements in congestion，edema，punctate ulcers，and inflammatory cell infiltration ofgastric mucosa，significantreductionsinthevolumeandtotalacidityofgastricjice，asignificantinreaseinthepHvalueofgastric juice，significant reductions in the serum levels of IL-6，TNF- α ， and PGE2 and p-AKT/AKT ratio and MDA level in gastric mucosal tissue，and significant increases in the serum level of IL-1O and the levels of SOD and GSH- .Px in gastric mucosa; groups C，E， andFhadasignifcantincreaseinfoodintakeondays14，21，and28andasignificantreductionintheratioofP65inthenucleus to P65in the cytoplasm；groups Cand Ehadasignificant increase in the level ofCAT in gastric mucosal tissue;groups D F had asignificantreductioninp-PI3K/PI3Kratioingastricmucosal tssue;groupEandFhdasignificantincreaseinp-IBa/IBaratio in gastric mucosal tissue ?F=3.4-1 013.0，q=4.1-78.7，Plt;0.05） . CCK-8 assay showed that there was no significant difference in cell viability between groups c1-e1 and group al at any time point （ Pgt;0.05） ，and groups c2-f2 had a significantly higher cell viability than group b2 at 12，24，and 48 hours of culture （F=15.5-146.1，q=4.6-22.3，Plt;0.05） .ConclusionWZYD can exert a protective effect against alcoholic gastric ulcers by modulating the PI3K/Akt/NF- κB signaling pathway，regulating inflammatory cytokines，and inhibiting oxidative stress.

[KEY WORDs]Stomach ulcer;Wuzhuyu Decoction；Qxidative stress；Phosphatidylinositol 3-kinases；Proto-oncogene pro teins c-akt；NF-kappa B; Signal transduction

酒精性胃潰瘍是一種由過度飲酒引起的胃黏膜病理性損害[]。胃黏膜組織暴露于高濃度乙醇中會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[2]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口服乙醇可引起胃部急性病變和潰瘍[3]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中多種基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞因子表達(dá)，從而參與機(jī)體免疫反應(yīng)及細(xì)胞的分化、增殖和凋亡[4]。核因子 κB（NF- κB 是Akt下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，被激活的Akt能夠通過調(diào)控 激酶（IKK）等 NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)分子，提高 NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性并啟動(dòng)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄[5]。研究表明，吳茱萸湯對(duì)脾胃虛寒型和幽門結(jié)扎型胃潰瘍具有治療作用[6-7]，但其對(duì)酒精性胃潰瘍的作用及機(jī)制尚未可知。本研究通過建立乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍模型和人胃黏膜上皮細(xì)胞損傷模型，探究吳茱萸湯對(duì)酒精性胃潰瘍的保護(hù)作用及其機(jī)制，旨在為吳茱萸湯的臨床應(yīng)用提供理論參考?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

吳茱萸湯湯劑由青島市海慈醫(yī)院中藥制劑室提供。雷尼替丁膠囊購自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司（國藥批號(hào)：H13021317）。無水乙醇（20220607）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基（R8758）購自美國Sigma公司，PBS（SH30256）購自美國HyClone公司、 0.25% 胰蛋白酶（25200072）購自美國Gbico公司，胎牛血清（04-001-1ACS）購自以色列BI公司，CCK-8試劑盒（40203ES60）以及BCA檢測試劑盒（20201ES76）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，腫瘤壞死因子 α（TNF-α） ）血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）、前列腺素（PGE2）、IL-1OELISA檢測試劑盒（ab181421、ab22503、ab287802、ab185986）購自英國Abcam公司，丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和細(xì)胞漿蛋白與核蛋白抽提試劑盒（S0131S、S0131S、S0101S、P0028）均購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，谷胱甘肽過氧化物酶（ ΔGSH-Px 檢測試劑盒（GL2098）購自北京百奧萊博科技有限公司，山羊抗兔IgG、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα及p65抗體（3900S、4288、4292、9272、4060、2682、2078、6956）購買于美國CST公司。人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）（YB-71563HC）購自鈺博（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及處理

SPF級(jí)健康雌性KM小鼠120只，8周齡，體質(zhì)量為 （23±5）g ，飼養(yǎng)于青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 12h 晝夜循環(huán)光照，溫度 25^°C ，濕度 75% 。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將60只小鼠隨機(jī)平均分為 A～F 組，每組20只。小鼠每日給藥劑量根據(jù)文獻(xiàn)8和藥理實(shí)驗(yàn)當(dāng)中小鼠與人體等效劑量換算公式計(jì)算，正常對(duì)照組（A組）以及模型對(duì)照組（B組）灌胃常溫蒸餾水 （10mL/kg ；雷尼替丁組（C組）灌胃雷尼替丁（ 30mg/kg ，溶于生理鹽水）；吳茱萸湯低、中、高劑量組（D、E、F組）分別灌胃吳茱萸湯湯劑（5、10、20mL/kg ），各組小鼠均每天灌胃2次，持續(xù) ^7d 。從 A～F 組小鼠中各抽取10只小鼠，腹主動(dòng)脈采集全血，靜置 30min 后，于 4^°C 下 3000r/min 離心10min ，無菌分離血清，用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；其余小鼠繼續(xù)進(jìn)行造模，從第8天開始， B～F 組小鼠每天灌胃藥物或蒸餾水 ¹h 后再灌胃體積分?jǐn)?shù)0.56的乙醇溶液 （7mL/kg） ，A組再灌胃等劑量的生理鹽水，持續(xù) 21d 。分別于處理第7、14、21、28天時(shí)記錄各組小鼠體質(zhì)量和進(jìn)食量。每日進(jìn)食量 每籠小鼠每日食物總攝入量/籠內(nèi)小鼠數(shù)量。上述處理結(jié)束后，各組小鼠禁食不禁水 24h 后稱取體質(zhì)量，腹腔注射1% 戊巴比妥鈉 （40mg/kg） 麻醉后，腹主動(dòng)脈采集全血并無菌分離血清， -80°C 保存。打開小鼠腹腔，結(jié)扎賁門，摘取全胃，擦凈血跡后沿胃大彎剪一小口，將胃液傾倒于刻度離心管中，沿胄小彎切取新鮮胃黏膜組織， -80°C 保存用于后續(xù)生化指標(biāo)檢測以及WB實(shí)驗(yàn)。分離各組小鼠胃黏膜組織，置于4% 多聚甲醛中室溫固定 24h ，用于后續(xù)蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.3各組小鼠胃液體積 ?pH 值和總酸度檢測

使用量筒測量各組小鼠胃液體積，并使用 pH 試紙檢測 pH 值。將各組小鼠胃液置于低溫離心機(jī)中 1500r/min 離心 10min ，取上清液 1mL ，加酚紅指示劑1滴， 0.01mol/LNaOH 溶液滴定，直至胃液先呈黃色后轉(zhuǎn)為紅色 2s 內(nèi)不消失，以期間消耗的 ΔNaOH 溶液體積計(jì)算胃液總酸度。胃液總酸度 溶液濃度 x 消耗的NaOH溶液體積/胃液體積。

1.4各組小鼠胃黏膜組織形態(tài)學(xué)及HE染色觀察

觀察并拍攝各組小鼠胃組織形態(tài)、胃黏膜表面潰瘍的大小和深淺。取各組小鼠以 4% 多聚甲醛固定的胃黏膜組織標(biāo)本，沿胃大彎處切開并用生理鹽水洗凈，體積分?jǐn)?shù)0.95乙醇脫水，二甲苯處理，石蠟包埋，切成 3μm 厚的切片，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，

1.5 ELISA法檢測各組小鼠血清炎癥因子水平

取各組小鼠血清樣本，按照相應(yīng)ELISA試劑盒 說明書檢測血清中炎癥因子IL-6、IL-1O、TNF- ?α 和 PGE2水平。

1.6WB實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠胃黏膜組織中各蛋白的表達(dá)

分別用細(xì)胞漿蛋白與核蛋白抽提試劑盒提取各組小鼠胃黏膜組織中的蛋白質(zhì)，BCA試劑盒法檢測蛋白質(zhì)濃度，電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上并進(jìn)行封閉。分別加入p-PI3K、PI3K、AKT、p-AKT、IκBα?p-IκBα?1 p65 一抗（均為 1：1 000? 于 4^°C 下振蕩孵育 12h 后洗膜，加入二抗 （1：5000） 室溫下振蕩孵育 ¹h 后洗膜，ECL顯色液避光顯影，ImageJ軟件計(jì)算各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7各組小鼠胃黏膜組織生化指標(biāo)的檢測

將各組小鼠胃黏膜組織按照相應(yīng)的試劑盒說明書制備為組織勻漿，并且檢測MDA、CAT、SOD和GSH- ?Px 水平。

1.8 CCK-8法檢測各組小鼠血清對(duì)GES-1細(xì)胞活力的影響

GES-1細(xì)胞接種于含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-鏈霉素的RPMI-164O培養(yǎng)基中，置于 37^°C 、含體積分?jǐn)?shù) 0.05CO₂ 、相對(duì)濕度 90% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板（5000個(gè)/孔）中，分為 al～f1 組和 a2～f2 組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。a1～e1 組細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入A、C、D、E、F組小鼠無菌血清。 b2～f2 組細(xì)胞經(jīng) 0.8mol/L 乙醇處理 組加入等劑量PBS處理 ；隨后，a2組細(xì)胞加入A組小鼠血清，b2組細(xì)胞加入B組小鼠血清，c2組細(xì)胞加入C組小鼠血清， d2～f2 組細(xì)胞分別加人 D～F 組小鼠血清。上述各組細(xì)胞中加入的各組小鼠血清占比均為 10% 。各組細(xì)胞置于 、含體積分?jǐn)?shù) 0.05CO₂ 、相對(duì)濕度 90% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng) 12、24、48h 后按照CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測 450nm 波長下各組吸光度值并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力 （對(duì)照組吸光度值一實(shí)驗(yàn)組吸光度值）/對(duì)照組吸光度值，其中al、a2組為對(duì)照組。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPadPrisim1O軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 表示，多組間的比較采用單因素方差分析，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠體質(zhì)量和進(jìn)食量比較

重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析顯示，分組、時(shí)間及分組與時(shí)間的交互作用對(duì)各組小鼠體質(zhì)量和進(jìn)食量均有明顯影響 （ F時(shí)間= 1 0 . 1 ， 3 . 8 ， F分組 = 4 6 1 . 1 ， 5 1 . 4 "F_交互=67.0，6.4，Plt;0.05） 。各組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量比較差異均有顯著性 ?F=9.1～383.6 Plt;0.05） ；進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示， C～F 組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量均顯著高于B組 （q=5.0～ 43.2，Plt;0.05），E，F(xiàn) 組小鼠在第21、28天的體質(zhì)量顯著高于D組 （q=17.1～32.7，Plt;0.05） 。各組小鼠在第14、21、28天時(shí)的進(jìn)食量比較差異均有顯著性 （F=12.6～70.7，Plt;0.05） ；進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，C、E、F組小鼠在第14、21、28天進(jìn)食量均顯著高于B組 （q=4.1～13.0，Plt;0.05），E.F 組小鼠在第14、21、28天的進(jìn)食量顯著高于D組 （q=4.5～ 9.9，Plt;0.05） 。見表1、2。

2.2各組小鼠胃黏膜組織形態(tài)學(xué)及其各評(píng)價(jià)指標(biāo)比較

A組小鼠胃黏膜組織未見黏膜充血水腫和潰瘍性改變，B組小鼠胃黏膜組織有明顯黏膜充血水腫和片狀紅斑， C～F 組小鼠胃黏膜組織充血水腫和點(diǎn)狀潰瘍均有不同程度改善，其中F組較 C～E 組病變程度更輕。見圖1。HE染色結(jié)果顯示，A組胃黏膜組織沒有明顯的損傷，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，腺體排列緊密規(guī)則，輪廓清晰，黏膜表面胃小凹清晰可見，未見細(xì)胞脫落、壞死等現(xiàn)象。與A組相比，B組小鼠胃黏膜組織損傷嚴(yán)重，深層黏膜層發(fā)生嚴(yán)重出血和破壞，炎性細(xì)胞大量浸潤，腺體排列紊亂，黏膜上皮細(xì)胞大量壞死、脫落，損傷深度達(dá)胃黏膜全層。與B組相比，D組和E組小鼠胃黏膜組織炎性細(xì)胞浸潤減少，黏膜下輕度水腫和白細(xì)胞浸潤，胃黏膜層的破壞程度較輕；C組和F組小鼠胃黏膜損傷顯著改善，腺體結(jié)構(gòu)完整，腺體排列緊密規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。見圖2。

2.3各組小鼠胃液相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)比較

各組小鼠的胃液體積、 pH 值和總酸度比較差異均具有顯著性 （F=26.4～70.6，Plt;0.05） 。與A組相比，B組小鼠胃液體積和總酸度顯著升高， pH 值顯著降低 （q=13.3～22.2，Plt;0.05） 。與B組相比， C～F 組的胃液體積和總酸度均顯著降低（ 4.9～21.0，Plt;0.05），pH 值均顯著升高 _（q=5.0～ 14.2，Plt;0.05） 。與D組相比，E、F組小鼠胃液體積顯著降低，F(xiàn)組小鼠胃液總酸度顯著降低、 pH 值顯著升高 （q=6.6～14.2，Plt;0.05） 。與C組相比，F(xiàn)組小鼠胃液體積顯著性降低、 pH 值顯著升高（ ?_?q= 7.1～8.2，Plt;0.05） ，胃液總酸度無顯著性差異（ ??Pgt; 0.05）。見表3。

表1 A～F 組小鼠體質(zhì)量比較

表2 A～F 組小鼠每日進(jìn)食量比較

A～F 分別代表 A～F 組，紅色箭頭表示深層黏膜層嚴(yán)重出血和破壞，藍(lán)色箭頭表示黏膜下充血、水腫，黃色箭頭表示炎性細(xì)胞浸潤，黑色箭頭顯示上皮和黏膜層的組織學(xué)結(jié)構(gòu)完整;HE染色，A、D：1O0倍，B、E、F：4OO倍，C：40倍

2.4各組小鼠血清中各炎癥因子水平比較

各組小鼠血清 IL-6，TNF-α，IL-10 及PGE2水 平比較均有顯著差異 （F=46.6～667.2，Plt;0.05） 。 與A組相比，B組小鼠血清中 IL-6.TNF-α 和PGE2 水平顯著升高，而IL-1O水平顯著降低 （q=20.0～ 78.7，Plt;0.05） 。與B組相比， c～F 組小鼠血清 IL-6.TNF-α 和PGE2水平均顯著降低，IL-1O水平 顯著升高 （q=6.5～44.4，Plt;0.05） ;與D組相比， E、F組小鼠血清 IL-6.TNF-α 和PGE2水平均顯著 降低，F(xiàn)組小鼠血清IL-1O水平顯著升高 （q=4.9～ 23.7，Plt;0.05） ；與C組相比，F(xiàn)組小鼠血清IL-6和 PGE2水平顯著降低，而IL-1O水平顯著升高（ ?_q=6.1～20.0，P＜0.05）， α 水平則無顯著性差異（ （Pgt;0.05） 。見表4。

2.5各組小鼠胃黏膜組織中PI3K/Akt/NF- κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

各組小鼠胃黏膜組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT，p-IκBα/IκBα 、核內(nèi)P65/胞漿P65比值均有顯著性差異 'F=50.9～1013.0，Plt;0.05） 。與A組相比較，B組小鼠胃黏膜組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT以及核內(nèi)P65/胞漿 P65 比值均顯著升高， p^- IκBα/IκBα 比值顯著降低 （q=6.8～74.8，Plt;0.05） 。與B組相比較， D～F 組小鼠胃黏膜組織 p-PI3K/ PI3K比值顯著降低，C、E、F組小鼠胃黏膜組織 p^- AKT/AKT、核內(nèi)P65/胞漿P65比值顯著降低（ 6.8～46.5，Plt;0.05），E.F 組小鼠胃黏膜組織中 p^- IκBα/IκBα 比值顯著升高 （q=4.5～16.5，Plt;0.05） 。與D組相比，E、F組小鼠胃黏膜組織中 p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT和核內(nèi)P65/胞漿P65比值顯著降低，E組小鼠胃黏膜組織 p-IκBα/IκBα 比值顯著升高 （q=9.0～57.3，Plt;0.05） 。與C組相比，F(xiàn)組小鼠胃黏膜組織 p -PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和核內(nèi)P65/胞漿P65比值顯著降低， p-IκBα/IκBα 比值則顯著升高 （q=7.8～35.6，Plt;0.05） 。詳見圖3、表5。

2.6各組小鼠胃黏膜組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平比較

各組小鼠胃黏膜組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA、CAT、GSH- ?Px 及SOD水平比較均具有顯著性差異（F=75.6～146.8，Plt;0.05） 。與A組相比，B組小鼠胃黏膜組織MDA水平顯著升高，CAT、GSH-Px及SOD水平顯著降低 （q=20.1～40.2，Plt;0.05） 。與B組相比， C～F 組小鼠胃黏膜組織MDA水平顯著降低，SOD和GSH- ?Px 水平顯著升高（ _（q=4.3～ 27.2 ：，Plt;0.05 ，C、E組小鼠胃黏膜組織CAT水平顯著升高 （q=4.4～6.0，Plt;0.05） 。與D組相比，E、F組小鼠胃黏膜組織MDA水平顯著降低，GSH-Px 水平顯著升高 （q=7.7～19.2，Plt;0.05），F(xiàn) 組小鼠胃黏膜組織SOD水平顯著升高，CAT水平顯著降低 （q=7.1～9.1，Plt;0.05） 。與C組相比，F(xiàn)組小鼠胃黏膜組織 GSH-Px 水平顯著性升高，MDA和CAT水平顯著降低 （q=5.3～12.0，Plt;0.05） ，SOD水平無顯著性差異 （Pgt;0.05） 。見表6。

2.7 各組細(xì)胞活力比較

重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析顯示，時(shí)間、分組及分組與時(shí)間的交互作用對(duì)于 a1～e1 組和 a2～e2 組的細(xì)胞活力均具有明顯的影響 （F_#fifi=715.1，192.6 F₃₄₄=25.3，144.4，F(xiàn)₃₄₄=3.4，6.9，Plt;0.05） 。 a1～ e1組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力均有顯著性差異 （F=176.0～200.3，Plt;0.05） ;進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，在第12、24、48小時(shí)時(shí)，與a1組相比，b1組細(xì)胞活力顯著降低 （q=5.8～11.6，Plt;0.05），cl～ el組細(xì)胞活力均無顯著差異 （Pgt;0.05） 。 a2～f2 組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力均有顯著性差異（ F= 15.5～146.1，Plt;0.05） ；進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，在第12、24、48小時(shí)時(shí)，與a2組相比，b2組細(xì)胞活力顯著降低 （q=12.2～23.8，Plt;0.05） ；與b2組相比， c2～f2 組的細(xì)胞活力均顯著升高（ q=4.6～ 22.3，Plt;0.05） 。見表7、8。

3討論

胃潰瘍屬中醫(yī)“胃皖痛”范疇[9]，主要病因?yàn)榉晴摅w抗炎藥的過量使用、幽門螺桿菌感染以及過量飲酒等[10]。乙醇會(huì)導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞壞死[11]和黏膜下血管內(nèi)皮損傷[12]，并引起局灶性潰瘍、胃黏膜水腫和炎性細(xì)胞浸潤[13]。目前臨床上用于治療胃潰瘍的藥物主要包括抗酸劑、胃黏膜保護(hù)劑和抗生素，這些藥物能在一定程度上緩解癥狀，但復(fù)發(fā)率較高，并伴有不同程度的副作用，因此需要尋找療效更好、副作用更少的新藥物。吳茱萸湯方劑出自于漢代張仲景的《傷寒論》與《金匱要略》二書[14]，由吳朱臾、生姜、人參、大棗四味中約組成，具有\(zhòng)"溫中補(bǔ)虛、降逆止嘔\"之功效，主要用于治療嘔吐、頭痛等疾病。韓蓁等[15]研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸湯在常規(guī)藥物治療脾胃虛寒型胃潰瘍中具有增效作用；張明發(fā)等[16]研究結(jié)果顯示，吳茱萸水煎劑具有治療鹽酸性胃潰瘍和消炎痛加乙醇性胃潰瘍的作用；此外，吳茱萸湯中的活性成分吳茱萸次堿對(duì)由乙酰水楊酸和水浸應(yīng)激引起的小鼠胃黏膜損傷具有保護(hù)作用[17。本研究通過建立乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍模型和人胃黏膜上皮細(xì)胞損傷模型，探究吳茱萸湯對(duì)酒精性胃潰瘍的保護(hù)作用及其機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， C～F 組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量和C、E、F組小鼠在第14、21、28天的進(jìn)食量均顯著高于B組；其中E、F組小鼠在第21、28天的體質(zhì)量和第14、21、28天的進(jìn)食量顯著高于D組。與B組相比， C～F 組小鼠胃黏膜組織充血水腫、點(diǎn)狀潰瘍和炎性細(xì)胞浸潤情況均有不同程度的改善，胃液體積和總酸度均顯著降低，pH值顯著升高；其中，F(xiàn)組小鼠胃黏膜形態(tài)學(xué)損傷的改善程度較 C～E 組更為顯著。與D組相比，E、F組小鼠胃液體積顯著降低，F(xiàn)組小鼠胃液總酸度顯著降低、pH值顯著升高；與C組相比，F(xiàn)組小鼠的胃液體積顯著降低， pH 值顯著升高。這些結(jié)果提示，吳茱萸湯可緩解乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍模型小鼠胃黏膜損傷，且高劑量吳茱萸湯的療效明顯優(yōu)于陽性藥物雷尼替丁和低、中劑量吳茱萸湯。此外，本研究在體外探討了吳茱萸湯處理后小鼠的含藥血清對(duì)GES-1細(xì)胞的作用，目的在于保留藥物代謝活性成分，以更真實(shí)地模擬體內(nèi)藥效環(huán)境[18]。結(jié)果顯示，在第12、24、48小時(shí)時(shí)，b1組細(xì)胞活力與a1組相比顯著降低， c1～e1 組細(xì)胞活力均無顯著差異；b2組細(xì)胞活力與a2組相比顯著降低， c2～f2 組的細(xì)胞活力與b2組相比均顯著升高，提示吳茱萸湯具有保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷的作用，并且無明顯細(xì)胞毒性。上述研究表明，吳茱萸湯對(duì)于胃黏膜損傷和對(duì)酒精性胃潰瘍具有保護(hù)作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

炎癥反應(yīng)在胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt信號(hào)通路通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄程序及細(xì)胞因子表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，在免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖與凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。 NF-κB 信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)急性期發(fā)揮重要調(diào)控作用，其通過介導(dǎo)細(xì)胞中多種炎癥相關(guān)基因的表達(dá)參與胃黏膜損傷進(jìn)程[6，19]。研究表明， NF-κB 作為Akt關(guān)鍵下游轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄活性的恢復(fù)依賴于Akt的激活[6。當(dāng)該通路被激活時(shí)，活化的 NF-κB 會(huì)發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞中IL-6、TNF- α 等促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[20]。IL-6和TNF- α 主要由活化的單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌，其血清濃度與胃炎嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)[21-23]。IL-10 作為關(guān)鍵性抑炎因子，可通過負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞促炎因子水平，其表達(dá)水平可作為評(píng)估機(jī)體炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的重要指標(biāo)[24-25]。PGE2可通過抑制促炎介質(zhì)生成及促進(jìn)黏膜修復(fù)等作用參與胃黏膜屏障穩(wěn)態(tài)維持。研究表明，使用特異性抑制劑阻斷細(xì)胞內(nèi) NF-κB 信號(hào)通路從而抑制促炎因子的釋放能夠顯著改善胃黏膜病理損傷[6]。本研究結(jié)果顯示，與B組相比， C～ F組小鼠血清 IL-6.TNF-α 和PGE2水平和胃黏膜組織p-AKT/AKT均顯著降低、血清IL-1O水平顯著升高，C、E、F組小鼠胃黏膜組織中核內(nèi)P65/胞漿P65 比值顯著降低， D～F 組小鼠胃黏膜組織 p-PI3K/PI3K比值顯著降低，E、F組小鼠胃黏膜組織p-IκBα/IκBα 比值顯著升高;與D組相比，E、F組小鼠血清IL-6、TNF- α 、PGE2水平和胃黏膜組織 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、核內(nèi)P65/胞漿P65比值均顯著降低;F組小鼠血清IL-1O水平顯著升高；E組小鼠胃黏膜組織 p-IκBα/IκBα 比值顯著升高；與C組相比，F(xiàn)組小鼠血清IL-6、PGE2水平和胃黏膜組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、核內(nèi)P65/胞漿P65比值顯著降低，血清IL-1O水平和胃黏膜組織 p-IκBα/IκBα 比值顯著升高。上述結(jié)果提示，吳茱萸湯可能通過調(diào)控PI3K/Akt/NF- ?κB 信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥因子水平，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)酒精性胃潰瘍的保護(hù)作用，且高劑量吳茱萸湯的作用明顯優(yōu)于陽性藥物雷尼替丁和低、中劑量吳茱萸湯。

氧化應(yīng)激與乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷密切相關(guān)，高濃度乙醇暴露可引發(fā)胃黏膜組織內(nèi)活性氧的爆發(fā)性生成，促進(jìn)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA的氧化修飾，進(jìn)而誘發(fā)黏膜屏障功能障礙和細(xì)胞程序性死亡[26-27]研究表明，靶向補(bǔ)充抗氧化劑可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)的氧化炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可成為酒精性胃損傷防治的新方向[28-29]。MDA是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，其蓄積提示細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，而CAT、SOD及 GSH-Px 活性下降則反映抗氧化系統(tǒng)衰竭[30]。本研究結(jié)果顯示，與B組相比， C～F 組小鼠胃黏膜組織MDA水平顯著降低，SOD和 GSH-Px 水平顯著升高，C、E組小鼠胃黏膜組織CAT水平顯著升高；與D組相比，E、F組小鼠胃黏膜組織MDA水平顯著降低， GSH-Px 水平顯著升高，F(xiàn)組小鼠胃黏膜組織SOD水平顯著升高；與C組相比，F(xiàn)組小鼠胃黏膜組織GSH- ?Px 水平顯著升高，MDA和CAT水平顯著降低。上述結(jié)果提示，吳茱萸湯可能通過抑制氧化應(yīng)激，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)酒精性胃潰瘍的保護(hù)作用，且高劑量吳茱萸湯的作用明顯優(yōu)于陽性藥物雷尼替丁和低、中劑量吳茱萸湯。

綜上所述，吳茱萸湯對(duì)酒精性胃潰瘍具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞PI3K/Akt/NF-κB 信號(hào)通路和炎癥因子水平以及抑制其氧化應(yīng)激水平有關(guān)。本研究為吳茱萸湯治療酒精性胃潰瘍的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，有利于該治療方法的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)附屬海慈醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)2021HC-12LZ018）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》的條例進(jìn)行。

作者聲明：高瑞陽、葛科立、李平香參與了研究設(shè)計(jì)；高瑞陽、葛科立、李景堯參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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