沙棘枝干總黃酮的提取和抗氧化活性研究

中圖分類號R285文獻標識碼A文章編號 0517-6611（2025）11-0172-09

doi：10.3969/j. issn. 0517-6611.2025.11.037開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Extractionand Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Sea-buckthorn Branches and Stems

XU Xuan， SHEN Yan，CHEN Yin （Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316000）

AbstractUsingsea-bucktobrancesasrmaterials，teetractionprocessoftotalfavonoidsasotiizedusinsinglefactorprmentsandresposesfaceethdology，nditsprotetieectolohlicliverjury（A）wssudiedTeesultssowdatetotal flavonoid content in the branches and trunks of sea-buckthorn was 0.64% . The optimal extraction process for total flavonoids from sea-buckthorn branches was ultrasonic frequency of 50kHz ，powerof 2OoW，extraction temperatureof 55^°C ，liquid-material ratio of 23：1，ethanol concentration of 61% ，extraction time of 2 hours.Under these conditions，the total flavonoid extraction amount was 4 .19mg/g . Total flavonoids were purified and enriched using X-5 macroporous resin. In vitro antioxidant tests showed that the 40% ethanol purified product had the best antioxidantactivity.ThescavengingratesofDPPH，ABTS，hydroxylandsuperoxideanionradicalswere3.17，37.O6，792.51and （204號 262.42μg/mL ，respectively.Cellexperimentsshowedthattotalflavonoids fromsea buckthornbranchescould effctivelyreduce thedamageof ethanol to HepG2 cells，and protect HepG2 cells through the Keapl/Nrf2/HO-1 pathway.

KeywordsSea-buckthorn branches;Total flavonoids;Extraction;Antioxidant activity

沙棘（HippophaerhamnoidesLinn.）又稱為酸棗、醋柳等，是胡頹子科沙棘屬的一種落葉性灌木漿果植物[1]，主要分布于我國西南和西北地區(qū)[2]，被視為一種藥食同源食物。現(xiàn)代醫(yī)學研究，沙棘可降低膽固醇、緩解心絞痛發(fā)作和防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟，可以保護細胞免受氧化應激和自由基的傷害以及抑制癌細胞生長擴散[3]。沙棘的根、莖、葉、花、果特別是果實含有豐富的營養(yǎng)物質和生物活性物質，包括多糖、脂肪酸、氨基酸、甾醇類、黃酮類和多酚類等[4]，可以廣泛應用于食品和醫(yī)藥等國民經濟的許多領域。果實人藥具有正咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效，而且自前對沙棘的開發(fā)利用主要集中在果實中的多糖和黃酮類成分以及沙棘籽中的油脂類成分。由于沙棘特殊的采收方式以及修剪方式會產生大量的沙棘枝干和樹葉，對沙棘枝干中活性成分的研究和開發(fā)利用將有助于沙棘資源的充分利用和深度開發(fā)。

肝損傷是肝臟在各因素影響下觸發(fā)的損傷反應，酒精性肝損傷（ALI）是較為常見的一種，其患者肝功能指標會出現(xiàn)明顯異常，如谷丙轉氨酶、轉肽酶和白細胞數(shù)量會有明顯升高[5]。人飲酒后，多數(shù)酒精進人肝臟進行分解，其中的代謝分為主要的氧化途徑和次要的非氧化途徑。酒精本身及酒精氧化代謝產生的乙醛和自由基等中間產物是影響人體健康的主要因素，它們以多種方式共同作用誘導細胞壞死和組織產生免疫反應，激活炎癥，從而造成肝損傷[。已有研究表明，與ALI有關的通路和靶點包括IL-6/STAT3炎癥信號通路[7] TGF-β1/Smad 信號通路[8]、PERK/eIF2α 通路[9]Bcl-2/Bax信號通路[10]、脂聯(lián)素信號通路[1]、AMPK/SIRT1信號通路[12] NF-κB 信號通路[13]、庫普弗細胞活化信號通路[14]、JAK/STAT信號通路[15]等。

很多物質如維生素和動植物天然活性成分對酒精性肝損傷具有保護作用，包括多肽、萜類、黃酮類、多酚類、多糖類等[16]，主要是這些物質具有毒性小、副作用少、參與多途徑和多靶點等優(yōu)點，其作用機理主要是與酒精代謝過程中產生的醛類結合或者清除酒精代謝產生的過剩自由基。而且黃酮類化合物大量存在于各種天然來源的植物中，根據結構可分為六大類即黃酮類、黃酮醇類、兒茶素、黃烷醇類、花青素類和異黃酮類[17]。研究者們用各種技術對沙棘不同部位提取物進行了分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)提取物中富含黃酮類成分[18]，主要包括蘆丁、槲皮素、異鼠季素、山柰酚等昔元及其與葡萄糖和鼠李糖等組成的糖苷?；诖?，該研究以沙棘枝干為原料，應用響應面法優(yōu)化其總黃酮提取工藝并研究其對ALI的保護作用，以期為沙棘枝干的高效利用和后期藥物的開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試材。沙棘枝干采摘自新疆，清洗后， 50^qC 烘至恒重，粉碎。索氏提取法脫脂后備用，同時留下未脫脂部分測定其脂肪含量。人肝腫瘤細胞HepG2購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2試劑。石油醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、六水合氯化鋁、無水乙醇、蘆丁、鹽酸均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；水飛薊素、轉膜液、緩沖液、細胞增殖和毒性（CCK-8）檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司；HepG2細胞專用培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸購自賽文創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.1.3儀器與設備。藥材粉碎機（濟南慧峰機械設備有限公司）;MSA225S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；-80°C 冰箱（賽默飛科技中國有限公司）；TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器有限公司）；SK5210LHC超聲清洗機（上海科導超聲儀器有限公司）；烘箱（滄州翰銘儀器設備有限公司）;脂肪測定儀（山東云唐智能科技有限公司）；分光光度計（上海穩(wěn)贏機電設備有限公司）;Multisjan酶標儀（伯樂生命醫(yī)學有限公司）；高速冷凍離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1主要營養(yǎng)成分和活性成分測定。

1.2.1.1 水分。采用直接干燥法[19]，精密稱取原料 5.00g ，平鋪于皿中，在 100^°C 下干燥 5h ，將蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻，精密稱定重量。再在 100^°C 干燥1h，冷卻，稱重，至連續(xù)2次稱重的差異不超過 5mg 。根據損失重量，計算原料中水分的含量。

1.2.1.2 灰分。準確稱取 5.00g 原料，用直接灰化法[20]測定灰分含量。

1.2.1.3脂肪。用索氏提取法測定脂肪含量[21]。將提取杯烘干，準確稱取提取杯質量，將未脫脂的原材料用濾紙包好，每份 ，石油醚為提取溶劑，放入提取杯后，以 60^°C 在脂肪測定儀上進行加熱回流提取，直至石油醚無色，將提取杯中剩余少量石油醚旋蒸干，稱取提取杯質量，計算前后差異和脂肪含量。

1. 2. 1. 4 總多糖。

（1）樣液提取。準確稱取 1.00g 脫脂原料，與 20mL 純水一起加入容器混勻，在沸水中提取 30min ，反復提取3次，提取液過濾合并后純水定容到 50mL 并冷卻得到樣液。

（2）含量測定。采用苯酚硫酸法[22]測定總多糖含量。將 10mg 葡萄糖溶于 100mL 純水配制成 0.1mg/mL 的標準葡萄糖溶液，分別吸取 0.100，200，300，400 和 500μL 的標準溶液加入試管，用純水稀釋到 500μL ，加入 300μL 的 6% 苯酚和 1.5mL 的濃硫酸，搖勻，沸水浴 15min ，冷卻后在490nm 波長下測定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。用相同方法測定樣液吸光度并代入標準曲線方程，計算得到總多糖含量。

1.2.1. 5 蛋白質。

（1）樣液提取。取脫脂后的原料 1.00g ，加 20mL 純水混勻，在 50^qC 條件下浸泡 ^1h ，然后常溫超聲提取 30min ，離心收集上清，過濾。共提取2次，合并2次濾液并用純水定容到 50mL 。

（2）含量測定。采用考馬斯亮藍法[23]測定蛋白質含量。配制 0.200，400，600，800 和 1000μg/mL 牛血清蛋白溶液，每個試管加人 0.1mL 蛋白溶液和 5mL 考馬斯亮藍G250溶液，搖勻后常溫放置 2min ，在 595nm 測定吸光度，以牛血清蛋白在體系中的濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。用相同方法測定樣液吸光度并代入標準曲線方程，計算得到蛋白質含量。

1. 2. 1. 6 總黃酮。

（1）樣液提取。將脫脂后的樣品稱取 1. 00g ，加入25mL 的 60% 乙醇混勻，超聲提取 1.5h ，離心取上清液，再加人 25mL 的 60% 乙醇混勻，超聲提取同樣時間，如此反復3次，合并3次上清并用 60% 乙醇定容到 100mL 備用。

（2）含量測定。采用氯化鋁法[24測定總黃酮含量。取0.010g 蘆丁，用少量 60% 乙醇溶解后，加人 60% 乙醇定容至100mL ，混合均勻得濃度為 0.1mg/mL 的蘆丁標準液。分別精密吸取的蘆丁標準溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 和 0.6mL 于EP管中，分別加入 5% 三氯化鋁溶液 0.5mL ，混勻后用 60% 乙醇定容至刻度，搖勻，室溫下靜置 10min 。以不加蘆丁標準液為空白對照，于 400nm 波長下測定吸光度，以顯色液中蘆丁質量為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。用相同方法測定樣液吸光度并代入標準曲線方程，計算得到總黃酮含量。

1.2.2總黃酮提取條件優(yōu)化試驗。選擇效率高、結果穩(wěn)定的超聲波水浴提取法，溶劑為乙醇水混合溶液，超聲波頻率為50kHz ，功率為 200W 。選擇提取時間、提取溫度、液料比和乙醇濃度這4個因素進行試驗，每個單因素試驗重復3次。

乙醇濃度因素：稱取 1.00g 脫脂過的原料，乙醇濃度設置為 20%.40%.60%.80%.100% ，在提取時間 ^2h 提取溫度50^qC 和液料比 20：1（mL：g） 條件下提取，所得溶液離心過濾，測定總黃酮提取率。

提取時間因素：提取時間設置為 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5， 3.0h ，在乙醇濃度 60% 、提取溫度 50^qC 和液料比 20：1 條件下提取，所得溶液離心過濾，測定總黃酮提取率。

液料比因素：液料比設置為 21，在乙醇濃度 60% 、提取溫度 50^qC 和提取時間 ^2h 條件下進行，所得溶液離心過濾，測定總黃酮提取率。

溫度因素：提取溫度設置為 40，45，50，55，60^°C ，在乙醇濃度 60% 液料比 20：1 和提取時間 ^2h 條件下進行，所得溶液離心過濾，測定總黃酮提取率。

結合單因素試驗結果，選擇乙醇濃度、液料比和溫度進行響應面法的設計和試驗。用Box-Behnken試驗設計優(yōu)化，根據響應面試驗結果，得出總黃酮最佳提取工藝方案。

1.2.3總黃酮的純化。將沙棘枝干總提取物旋蒸濃縮，加入5倍體積的乙醇，醇沉除去多糖和蛋白，繼續(xù)濃縮并冷凍干燥形成粉末。上樣前用純水溶解并加入少許乙醇稀釋成濃度為 1mg/mL 左右。濕法上柱，填料為X-5大孔樹脂，上樣 30mL ，吸附 1.5h ，先用4倍純水沖洗，再分別用2倍20% 40% ） 60% ） 80% 、 100% 乙醇洗脫。收集洗脫液，濃縮凍干，并檢測其中的總黃酮含量。

1.2.4 體外抗氧化活性。

1.2.4.1DPPH自由基清除能力測定。配制 0.1mmol/L 的DPPH醇溶液和 0.5mg/mL 的 v_c 水溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。配制一定濃度的樣品溶液，樣品組為樣品溶液 100μL 中加入DPPH醇溶液 100μL ；空白組為樣品溶液 100μL 中加入無水乙醇 100μL ；對照組為DPPH醇溶液 100μL 中加人純水 100μL 。溶液混合搖勻后，在 517nm 測吸光度，以v_c 為陽性對照[25]。DPPH自由基清除率計算公式如下：

清除率 =[1-（A_s-A_b）/A_c]×100% 式中： Ω_：As 為樣品組吸光度； A_b 為空白組吸光度； A_c 為對照組吸光度。1.2.4.2ABTS自由基清除能力測定。將 5mL 的 7mmol/L ABTS[2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]和 88μL 的 140mmol/L 過硫酸鉀混合，在室溫、避光的條件下靜置過夜，形成自由基儲備液。使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在 30^qC.734nm 波長下的吸光度為0.7。取100μL 不同濃度的樣品乙醇溶液，加入 2mL 的ABTS溶液，振蕩，在 734nm 測定反應液的吸光度，以 v_c 為陽性對照[26]ABTS自由基清除率計算公式如下：

清除率 =（A_c-A_s）/A_c×100% 式中： A_s 為樣液和ABTS溶液混合后的吸光度； A_c 為無水乙醇和ABTS溶液混合后的吸光度。1.2.4.3羥基自由基清除能力測定。取 50μL 不同濃度的樣品溶液，依次加入 50μL 的 FeSO₄ 水溶液（ 6mmol?L ）、100μL 的 H₂O₂ 水溶液（ 6mmol/L ），充分搖勻后，室溫放置10min ，加人 50μL 水楊酸溶液 （ 6mmol/L ），溶劑為乙醇，充分搖勻后，室溫放置 30min 。然后以 4 000r/min 離心10min ，取上清液，在 510nm 測吸光度，以 v_c 為陽性對照[27]。羥基自由基清除率計算公式如下：

清除率 =（A₀-A_i）/A₀×100% 式中： ?：A₀ 為空白組（以 50μL 純水代替樣品加人反應體系中）吸光度； ?_?A_i 為樣品組吸光度。1.2.4.4超氧陰離子自由基清除能力測定。配制2.52mmol/L 的氯化硝基四氮唑藍（NBT）溶液、 624μmmol/L 的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）溶液和 120μmmol/L 的吩嗪硫酸甲酯（PMS）溶液。在 100μL 的 NBT溶液中加人100μL NADH溶液、 100μL 樣品溶液和 100μL PMS 溶液，搖勻，在 25^°C 水浴 5min ，在 560nm 測定吸光度，以 v_c 為陽性對照[28]。超氧陰離子自由基清除率計算公式如下：

清除率 =（A_s–A_c）/A_s×100% 式中 Ω：A_s 是對照組（用純水替換樣品溶液加入反應體系）吸光度： ?_{^Ac 是樣品組吸光度。1.2.5沙棘枝干總黃酮對酒精誘導的HepG2細胞損傷模型的作用效果。1.2.5.1HepG2細胞復蘇。從 -80°C 的冰箱中取出凍存的細胞，快速在 37^°C 水浴中融化，隨后在凍存管中加入1＼～2mL 完全培養(yǎng)基，吹散，快速將細胞懸液轉移至 10mLEP 管中， 1200r/min 離心 5min ，棄掉上清，加入HepG2細胞專用培養(yǎng)基，反復吹打使得沉降成團的細胞均勻分布在培養(yǎng)基中，放入 37% （204號 CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5.2酒精誘導的HepG2細胞損傷模型的建立。細胞在對數(shù)生長期長到密度 90% 左右時，消化傳代，吹成單細胞懸液，進行計數(shù)，制備成 1×10⁴ 個/孔的細胞懸液，并加入96孔板中置于 37% （20號 CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育 24h ，加入濃度梯度為 50100200400.800μmol/L 的無水乙醇 20μL 誘導肝細胞損傷，吸出孔板中所有溶液，每孔加入 100μL 含 10% CCK-8的培養(yǎng)基， 后在 450nm 測定吸光度。細胞存活率計算公式如下：

細胞存活率 =OD_iffuceff/OD_∵iffuceff×100%

1.2.5.3細胞毒性檢測。細胞在對數(shù)生長期長到 90% 左右時，消化傳代，吹成單細胞懸液，進行計數(shù)，制備成 1× 10⁴ 個/孔的細胞懸液，并加入96孔板中置于 37% （204號 CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育 24h ，以DMSO將 40% 乙醇洗脫組分溶解為80mg/mL ，再用PBS稀釋到 0.1% ，加入不同濃度的沙棘枝干總黃酮樣品 20μL 培養(yǎng) 24h ，吸出孔板中所有溶液，每孔加入 100μL 含 10% CCK-8的培養(yǎng)基， ^1h 后在 450nm 測定吸光度。細胞存活率計算公式如下：

細胞存活率 =OD_ijfigeff/OD_ggH^*H;HH;H×100%

1.2.5.4不同濃度沙棘枝干總黃酮對HepG2細胞酒精損傷的保護作用。用 400mmol/L 的無水乙醇造模，作用于細胞24h 建立酒精損傷模型，用 20μg/mL 水飛薊素作為陽性藥對照組，用濃度為 5.20.80μg/mL 的沙棘枝干總黃酮保護細胞，然后加入無水乙醇損傷細胞。采用CCK-8法測定細胞成活率，以此來判斷不同濃度沙棘枝干總黃酮對被無水乙醇損傷細胞的保護效果。

1.2.5.5細胞樣品制備和蛋白免疫印跡試驗。細胞在對數(shù)生長期長到 90% 左右時，消化傳代，吹成單細胞懸液，接種于直徑 100mm 的培養(yǎng)皿中，每個血加入 9mL 懸液，約 3× 10⁶ 個細胞，將培養(yǎng)皿置于 37% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育24h ，空白組和模型組加入 1mL 的PBS，陽性對照孔加入1mL 濃度為 20μg/mL 的水飛薊素，其同樣先用DMSO溶解，然后用PBS稀釋到 0.1% ，每孔分別加入濃度為5、20、80μg/mL 的沙棘枝干提取物 40% 乙醇洗脫組分 1mL 。將培養(yǎng)皿置于 培養(yǎng)箱中孵育 24h ，加入乙醇造模液 1mL ，于相同條件下再孵育 24h 。將培養(yǎng)皿拿出置于冰上，棄去血內所有液體，PBS清洗3次，加入高效細胞裂解液，冰上裂解 30min ，冷凍離心 10min ，轉速 12000r/min ，棄去沉淀，獲得總蛋白樣品。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）按大小分離蛋白質，再通過電印跡轉移到膜上，然后用封閉溶液處理膜，加入一抗和二抗依次孵育。將濾膜放入配好的顯色液中反應 1min ，計算機掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號ModelGelDoc2000）分析處理。

1.3統(tǒng)計分析 數(shù)據處理和圖表制作使用Excel2019和Origin2021;顯著性差異用IBM SPSS Statistics。

2 結果與分析

2.1沙棘枝干中的成分經分析，沙棘枝干中水分、灰分、總多糖、蛋白質、脂質和總黃酮占比分別為 8.73%.1.30% 、5.75% 、0. 82% 、1. 13% 和 0.64% 。沙棘枝干大多由較難分解的木質素和纖維素組成，水分和總多糖相對來說含量較高，無機鹽、蛋白質和脂質含量較少，因為大部分都運送至花、果實和葉中?？傸S酮含量在 1% 以下，可能是因為果實和葉是儲存營養(yǎng)的器官，所以枝干的總黃酮含量較少。

2.2 單因素試驗

2.2.1乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。從圖1可以看出，在乙醇濃度為 0～100% ，總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，當乙醇濃度為 60% 時，提取率最大?？赡苁且驗樯臣Ω芍械狞S酮類物質與 60% 乙醇的極性最為接近，所以在其中溶解度最大，之后隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大，溶液極性發(fā)生變化，總黃酮溶解度減小，提取率也變小。所以選定乙醇濃度為 60% 。

2.2.2提取時間對總黃酮提取率的影響。從圖2可以看出， 0.5～2.0h 總黃酮提取率逐漸增加，到 2.0h 之后，提取率變化幅度很小。說明總黃酮在 2.0h 內已經被溶出大部分，之后只是繼續(xù)延長提取時間的話，提取率很難有明顯提高，所以選擇提取時間為 2.0h 。

2.2.3液料比對總黃酮提取率的影響。從圖3可以看出，液料比小于 20：1 時，總黃酮提取率隨著液料比的增大而增大，原因是隨著溶液體積的增加，溶劑和原料之間的接觸面積增大，總黃酮向溶液中轉移的速度加快；之后繼續(xù)增大液料比，總黃酮提取率反而下降，可能是由于過多的溶劑導致原料內其他物質的溶出，影響了總黃酮的提取率。考慮到之后還有醇沉、旋蒸濃縮等步驟，為了避免溶劑浪費，所以選擇液料比為 20：1 。

2.2.4提取溫度對總黃酮提取率的影響。從圖4可以看出，從 40% 開始，總黃酮提取率隨著溫度升高而增大，到55^°C 后達到最大值，隨后開始下降。當提取溫度升高時，物質內部分子運動也加快，所以擴散和滲透的速度也加快，黃酮類物質在溶劑內的溶解度也隨溫度升高而變大，但是當溫度太高時，可能會使原料中的總黃酮發(fā)生氧化。所以選擇提取溫度為 55^°C 。

2.3響應面試驗選取溫度、液料比和乙醇濃度3個因素進行響應面試驗，超聲提取時間均為 ^2h 。中心點為溫度55^°C 、液料比 20：1 和乙醇濃度 60% ，試驗結果如表1所示。

用Designexpert8.0軟件進行二次多項回歸方程的擬合，得出二次多項回歸方程：總黃酮提取量 0.160 0B+0. 001 3C+0. 026AB+0. 087AC+0. 016BC-0. 15A²- 0.13B²-0.23C²

由表2可知，建立的回歸模型 Plt;0.01 ，差異極顯著；失擬項 P=0.773 9 ，不顯著，表明模型的擬合度較好； R²= 0.9689，且 R_Adj²=0.929 0 ，表明擬合模型可信度較高，試驗誤差較小。該響應面模型具有顯著性，可以用此模型對試驗數(shù)據進行分析和預測。一次項中因素 B （液料比）對結果影響極顯著。從 F 值可知單因素的影響順序為 Bgt;Agt;C ，二次項中 A²?B² 和 C² 對結果影響都極顯著； AC 交互對結果影響顯著， _，AB 和 BC 交互對結果影響不顯著

如圖5所示，在乙醇濃度一定時，溫度為 50～60^circC ，總黃酮提取量先升高后降低，影響較為明顯，而液料比為 15：1～ ，總黃酮提取量先升高后稍微降低，影響不明顯；等高線圖顯示溫度和液料比交互顯著。如圖6所示，在液料比一定時，溫度為 50～60^cC ，乙醇濃度為 40%～80% ，總黃酮提取量先升高后降低；但是在等高線圖中顏色較淺，沒有紅色范圍出現(xiàn)，說明這2個因素交互對試驗結果的影響不明顯。如圖7所示，在溫度一定時，乙醇濃度為 40%～80% ，總黃酮提取量先升高后降低，影響較為明顯；而等高線圖顯示出橢圓形，說明乙醇濃度和液料比交互極顯著，對總黃酮提取量的影響極明顯。

Fig.5Response surface and contour plots of the interaction between liquid-material ratio and temperatu

綜上所述，在超聲波頻率為 50kHz 、功率為 200‰ 的條件下，沙棘枝干總黃酮最佳提取工藝為提取溫度 55.36^°C 、液料比 23.12：1 乙醇濃度 60.77% 、提取時間 ^2h ，預計的總黃酮提取量理論值為 4.07mg/g 。進一步驗證采用優(yōu)化條件進行3次平行試驗，優(yōu)化條件為提取溫度 55^°C 、液料比 23：1 、乙醇濃度 61% 、提取時間2h，總黃酮提取量為 4.19mg/g ，與理論值的誤差為 2.95% ，說明試驗結果與模型符合良好，并達到試驗過程中的最高提取量，說明此響應面模型具有可行性。

2.4純化產物抗氧化試驗

2.4.1純化前后總黃酮含量變化。粗提物中的總黃酮含量為 1.24% 。其中 20%.40%.60% 乙醇洗脫液可用肉眼觀察到棕黃色， 40% 乙醇洗脫液的顏色最深，旋蒸后凍干樣的總黃酮含量也最高，為 12.30% 20% 乙醇洗脫液次之，凍干樣的總黃酮含量為 8.62% 60% 乙醇洗脫液顏色最淡，凍干樣的總黃酮含量為 3.17% 。 80% 和 100% 乙醇洗脫液肉眼觀察無色且無黃酮類物質檢測出。

2.4.2 體外抗氧化活性。

2.4.2.1DPPH自由基清除能力。已知 IC₅₀ 值越小，清除自由基效果越好。如圖8所示，其中 20% 乙醇洗脫組分、 40% 乙醇洗脫組分 60% 乙醇洗脫組分 的DPPH自由基清除率 IC₅₀ 值分別為 8.45，3.17，22.69，2.40μg/mL， 。從圖8可以看出，在 2～10μg/mL， 20% 和 40% 乙醇洗脫組分對DPPH自由基的清除效果上升得很快； 40% 乙醇洗脫組分對DPPH自由基的清除效果最好，但比 v_c 弱； 20% 乙醇洗脫組分次之， 60% 乙醇洗脫組分效果最差。當樣液濃度在 8μg/mL 以上時， 40% 乙醇洗脫組分和 v_c 溶液的清除率上升速度均開始減緩且相差很小。這證明 40% 乙醇洗脫組分清除DPPH自由基的效果相對較好。

Fig.6Response surface and contour plot of the interaction between ethanol concentration and temperature

Fig.7Response surfaceand contour plotof the interaction between ethanol concentration and liquid-material ratio

2.4.2.2ABTS自由基清除能力。從圖9可以看出， 20% 乙醇洗脫組分、 40% 乙醇洗脫組分、 60% 乙醇洗脫組分、 v_c 的IC₅₀ 值分別為 45.80，37.06，75.79，32.98μg/mL 。在 20～ 100μg/mL ，幾種樣品溶液對ABTS自由基的清除率均呈上升趨勢。 40% 乙醇洗脫組分對ABTS自由基的清除效果最好，但比 v_c 弱； 20% 乙醇洗脫組分次之， 60% 乙醇洗脫組分效果最差。所以沙棘枝干總黃酮提取純化產物對ABTS自由基的清除效果是 V_cgt;40% 乙醇洗脫組分 gt;20% 乙醇洗脫組分 ?gt;60% 乙醇洗脫組分。

2.4.2.3羥基自由基清除能力。從圖10可以看出， 20% 乙醇洗脫組分、 40% 乙醇洗脫組分、 60% 乙醇洗脫組分 .v_c 的IC₅₀ 值分別為 905.80，792.51，1785.32，597.06μg/mL 。在200～1000μg/mL ，幾種樣品溶液對羥基自由基的清除率均呈上升趨勢。但是 40% 乙醇洗脫組分的清除率上升速度最快，而 20% 乙醇洗脫組分在溶液濃度達到 800μg/mL 之后變緩， 60% 乙醇洗脫組分的清除率上升速度最小?？梢?40% 乙醇洗脫組分對羥基自由基的清除效果最好，比 v_c 弱； 20% 乙醇洗脫組分次之， 60% 乙醇洗脫組分效果最差?？傮w來看，對羥基自由基的清除效果是 V_cgt;40% 乙醇洗脫組分 gt;20% 乙醇洗脫組分 gt;60% 乙醇洗脫組分。

2.4.2.4超氧陰離子自由基清除能力。從圖11可以看出，20% 乙醇洗脫組分、 40% 乙醇洗脫組分、 60% 乙醇洗脫組分、v_c 的 IC₅₀ 值分別為 394.87.262.42.709.55 和 60.99μg/mL 在 200～1000μg/mL ，幾種樣品溶液對超氧陰離子自由基的清除率均呈上升趨勢，而 v_c 在最低濃度時，清除率就很高。40% 乙醇洗脫組分的清除率上升速度最快，在到達600μg/mL 時幾乎不再增長，并且在濃度為 1000μg/mL 時，40% 乙醇洗脫組分和 20% 乙醇洗脫組分對超氧陰離子自由基的清除能力沒有顯著差別。而 60% 乙醇洗脫組分的清除率上升速度最小?？梢?40% 乙醇洗脫組分對超氧陰離子自由基的清除效果最好，但比 v_c 弱； 20% 乙醇洗脫組分次之，60% 乙醇洗脫組分效果最差。總體來看，對超氧陰離子自由基的清除效果是 V_cgt;40% 乙醇洗脫組分 gt;20% 乙醇洗脫組分 gt;60% 乙醇洗脫組分。

2.4.3無水乙醇誘導的HepG2細胞酒精性肝損傷模型的建立。從圖12可以看出，在 0～800mmol/L ，相較于空白組，細胞存活率隨乙醇濃度升高而呈現(xiàn)下降趨勢，乙醇濃度每擴大2倍時，細胞存活率與前一組有顯著差異，細胞存活率接近50% 時，視為成功造模。乙醇濃度為 400mmol/L 時，細胞存活率為 52.31% ，因此選取此乙醇濃度為造模成功時的濃度。

注：不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05） 。

Note：Different lowercase lettersindicate significant differences （Plt;0.05） ：

2.4.4不同濃度沙棘枝干總黃酮對HepG2細胞的生物毒性。從圖13可以看出，沙棘枝干總黃酮在 0～80μg/mL ，細胞存活率沒有顯著差異，并且都接近 100% ，說明沙棘枝干總黃酮在此濃度范圍內對細胞幾乎沒有毒性。

2.4.5不同濃度沙棘枝干總黃酮對HepG2細胞酒精損傷的 保護作用。從圖14可以看出，沙棘枝干總黃酮低劑量使細 胞存活率到達 53.22% ，中劑量使細胞存活率到達 71.64% 高劑量使細胞存活率到達 90.70% 。說明沙棘枝干總黃酮濃 度與細胞存活率呈劑量依賴性。

2.4.6沙棘枝干總黃酮對 Keap1/Nrf2/H0-1 信號通路蛋白表達的影響。從圖15＼～16可以看出，模型組的Keap1蛋白的表達量有明顯下降，對比空白組，差異極顯著；與模型組比較，低劑量、中劑量和高劑量給藥時，Keap1蛋白的表達量均有不同程度的上升，但是低劑量的效果不顯著，中劑量和高劑量的效果極顯著。說明不同濃度的沙棘枝干總黃酮對酒精性肝損傷的保護作用隨著濃度的升高而增大，而且具有濃度依賴性。

注：不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05） N°

Note：Different lowercase letters indicate significant differences 0 Plt;0.05） ：

注：與空白組比較，### ?Plt;0.001Ω ;與模型組比較， ***P?0.001 ，**Plt;0.01 。

Note：Compared with the blank group， ##Plt;0.001 ;Compared with the model group，*** Plt;0.001 ， **Plt;0.01

Fig.15Effects of total flavonoids in sea-buckthorn branches on the expression levels of Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathwayproteins

從圖15和圖17可以看出，模型組的Nrf2蛋白的表達量有明顯下降，對比空白組，差異極顯著；與模型組比較，低劑量、中劑量和高劑量給藥時，Nrf2蛋白的表達量均有不同程度的上升，且中劑量和高劑量的效果極顯著。說明不同濃度的沙棘枝干總黃酮對酒精性肝損傷的保護作用隨著濃度的升高而增大，而且具有濃度依賴性。

從圖15和圖18可以看出，模型組的H0-1蛋白的表達量有明顯下降，對比空白組，差異極顯著；與模型組比較，低劑量、中劑量和高劑量給藥時，HO-1蛋白的表達量均有不同程度的上升，且中劑量和高劑量的效果極顯著。說明不同濃度的沙棘枝干總黃酮對酒精性肝損傷的保護作用隨著濃度的升高而增大，而且具有濃度依賴性。

注：與空白組比較， ###Plt;0.001 ;與模型組比較，* **P?0.001 ， **P?0.01_o （20

Note：Compared with the blank group，### Plt;0.001 ；Compared with the model group，*** Plt;0.001 **Plt;0.01

Note：Compared with theblank group，### Δ^tPlt;0.001 ;compared with the model group， ****Plt;0.001 ：

圖17沙棘枝干總黃酮對HepG2細胞 Nrf2 蛋白表達水平的影響Fig.17Effect of total flavonoids from sea-buckthorn branchesonthe expression level ofNrf2 protein in HepG2 cells

3結論與討論

該試驗得到的沙棘枝干總黃酮最佳提取工藝為超聲頻率 50kHz 、功率 200‰ 、提取溫度 55^°C 、液料比 23：1 乙醇濃度 61% 、提取時間 ²h ，在此條件下總黃酮提取量為4.19mg/g 。

注：與空白組比較， ###Plt;0.001 ;與模型組比較， ???Plt;0.001， □ Note：Compared with the blank group，### Plt;0.001 ; compared with the model group， *****0.001

楊歡歡等[27]用微波輔助提取沙棘果渣，發(fā)現(xiàn)當乙醇濃度為 70% 、料液比 1：25 （ ）、微波時間 2.5min 、功率為600‰ 時，總黃酮提取量為 22.13mg/g 。吳翠芳等[28]用超聲提取沙棘漿果，發(fā)現(xiàn)提取時間為 23min 、提取溫度為 80^qC 、乙醇濃度為 50% 、料液比為 1：20 、總黃酮得率達到2.315mg/g 。劉馨雨等[29]用超聲波微波協(xié)同提取沙棘葉，發(fā)現(xiàn)在乙醇體積分數(shù)為 61% 、協(xié)同提取時間為 18min 、微波功率為 $4 4 6 ～ ＼mathrm { ＼textW }$ 的條件下，總黃酮得率為 42.09mg/g 。結合上述案例可以看到沙棘枝干中總黃酮含量少于果實和葉子，而且單純超聲提取的效果也不如微波和超聲協(xié)同提取。

該研究表明，沙棘枝干提取物的3種純化產物的不同類型自由基清除效果較為一致，均為 40% 乙醇洗脫組分 gt;20% 乙醇洗脫組分 gt;60% 乙醇洗脫組分，但是比 v_c 抗氧化能力還是偏弱。選取 40% 乙醇洗脫組分，用HepG2細胞造模從抗炎層面進行護肝效果研究，結果表明，沙棘枝干總黃酮能通過 Keap1/Nrf2/HO-1 通路，減輕炎癥反應，從而保護了HepG2細胞，減輕了由無水乙醇制造的損傷。之后的研究中，還需要進一步對其組成成分進行鑒定，并進行動物試驗的研究。

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