脂氧素A4通過抑制鐵死亡減輕心肌缺血/再灌注損傷的機制研究

摘要目的：探討脂氧素A4脂質(zhì)體（LXA4）在大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）損傷中的心臟保護作用及其機制，尤其對心肌細胞鐵死亡的影響。方法：采用雄性SD大鼠建立心肌I/R損傷模型，隨機分為對照組、LXA4組、IR組和I/R十LXA4組。通過心肌組織蘇木精-伊紅（HE）染色、普魯士藍（Perls）染色、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westem Blot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）等方法評估 LXA4對心肌結(jié)構(gòu)、心肌炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及鐵死亡等相關(guān)標志物的影響。結(jié)果：LXA4顯著減輕V/R誘導(dǎo)的心肌結(jié)構(gòu)損傷和心肌炎癥反應(yīng)。LXA4還通過提高谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性，抑制鐵死亡相關(guān)蛋白溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）和基因鐵響應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（IREB2）、ATP合成酶F0復(fù)合體亞基C3（ATP5G3）等的異常表達，減少心肌細胞鐵死亡的發(fā)生。結(jié)論：LXA4可能通過抑制心肌細胞鐵死亡，提高心肌抗氧化和抗炎能力，來減輕心肌IR損傷，發(fā)揮其心臟保護作用。LXA4作為一種新的內(nèi)源性化合物，不僅可以作為一種預(yù)防和治療心肌I/R損傷的有效藥物，而且可能在心肌細胞鐵死亡相關(guān)疾病中發(fā)揮作用。

AbstractObective：ToexplorethecardiacprotectiveefectoflipoxinA4liposome（LA4）onmyocardialishemia/reperfusio（/）ijuy inrats，especllitsifuenenfrrotosisofardiomyocytesthodsemyocardialinjumodelwaestbisdusingale Sprague-DawleySD）atsandrandomlydividedintothecontrolgroup，theLXA4group，theI/RgroupandtheI/RLXA4group.Teeectsof LXA4onrelatedmarkerssuchasmyocardialstructure，myocardialinflammatoryresponse，oxidativestressandferrcdeathwere evaluatedbyhematoxylineosin（HE）staining，Pruianblue（Perls）staning，WesternBlotandrealtimepolymerasechinraction （RT-PCR）Results：LX4signifcantlyaleviatedmyocardialstructuralinjuryandmyocardialinfmmatoryresponseinducedby/4 alsoenhancedectiftato（GH）ataeCAndspeoideutaseODItdtbef feroptose-relatedproteinsolatecarierfamily7member1（SLC7A11），glutathioneperoxidase4（GPX4），geneironresponseeleent bindingprotein（REB2），ATPsynthaseFOcomplexsubunitC3（ATP5G3），etc.，andreducedtheoccurrnceofferoptosisin cardiomyocytes.Conclusin：LXA4mayaleviatemyocardialI/injuryandexertitscardacprotectiveefectbyinibitingferrotosisof myocardialcellsandenhancingteatioxidantandantiflammatorycapabiesofthemyocardium.Asanewendogenousompound， LXA4notonlysevsasanefectivedrugforthepreventionndtreatmentofmyocardialI/njuryutalsomayexertpotentiaectin diseases related ferroptosis of cardiomyocytes.

Keywordsmyocardial ischemia/reperfusion injury; lipoxin A4; ferroptosis；experimental study

急性心肌梗死（acutemyocardial infarction，AMI）是因長時間心肌缺血導(dǎo)致的心肌細胞死亡，最終導(dǎo)致心力衰竭、致命性心律失常、心源性休克、心臟破裂以及血栓栓塞等嚴重并發(fā)癥，危及病人生命[12]。盡管經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術(shù)等技術(shù)能夠促進冠狀動脈血流再灌注，從而限制心肌缺血的發(fā)展，但再灌注的過程也可能迅速加劇心肌損傷，這種損傷被稱為心肌缺血/再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷[34]。但在臨床工作中，針對預(yù)防和改善心肌I/R損傷的藥物仍有待開發(fā)。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致心肌I/R損傷的主要發(fā)病機制[57]。因此，開發(fā)或探究具有抗炎、抗氧化的新型藥物，用來預(yù)防和改善心肌I/R損傷一直是研究的熱點。

脂氧素A4（LiopxinA4，LXA4）是一種由花生四烯酸（arachidonicacid，AA）通過多形核白細胞中的5-脂氧合酶衍生而來的脂質(zhì)介質(zhì)[6.8]。在多種器官損傷模型中，LXA4已被證實具有顯著的抗炎、抗氧化及抗凋亡等多種作用，因此成了多種疾病的潛在治療藥物[9-14]。既往研究表明，在心肌I/R損傷前后應(yīng)用LXA4可顯著抑制中性粒細胞的活化，減輕心肌炎癥和氧化應(yīng)激損傷，抑制細胞凋亡，減少多種促炎細胞因子及趨化因子的分泌。同時，LXA4通過上調(diào) Na⁺K⁺-ATP 酶的表達，緩解心肌代謝紊亂，發(fā)揮心肌保護作用[4.6.15-18]。然而，LXA4在心肌I/R損傷中發(fā)揮保護作用的具體機制尚不清楚。

鐵死亡是一種鐵依賴性調(diào)節(jié)的細胞死亡形式，其特點包括鐵穩(wěn)態(tài)改變、氧化應(yīng)激防御能力降低和脂質(zhì)過氧化物的異常積累[19]。研究表明，鐵死亡可通過核糖體蛋白L8（ribosomalproteinL8，RPL8）鐵響應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（iron response element binding protein 2，IREB2）、ATP合成酶FO復(fù)合體亞基C3（ATPsynthaseF0complexsubunitC3，ATP5G3）、檸檬酸合酶（citratesynthase，CS）、前列環(huán)素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxidesynthase2，PTGS2）等調(diào)控鐵的吸收、代謝和儲存來維持鐵的體內(nèi)平衡[20-23]。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）通過消除磷脂氫過氧化物，在阻斷鐵死亡中起主要作用[24]。此外，在鐵死亡過程中，溶質(zhì)載體家族7成員11（solutecarrierfamily7member11，SLC7A11）的下調(diào)會導(dǎo)致谷胱甘肽（GSH）合成減少，進而促使鐵死亡的發(fā)生[22]。研究表明，鐵死亡在多種心血管疾病的發(fā)病和進展中起重要作用，包括心肌I/R損傷，抑制鐵死亡能夠顯著保護心肌細胞[25-29]。丙二醛（MDA）可間接反映心肌細胞受到的氧化損傷程度[30]。GSH和過氧化氫酶（CAT）活性可間接反映細胞的抗氧化能力[1]。通過測定超氧化物歧化酶（SOD）、銅-鋅-SOD（Cu/Zn-SOD）和錳-SOD（Mn-SOD）活性，評估LXA4在I/R誘導(dǎo)的細胞氧化損傷中的作用[22]。目前，關(guān)于LXA4對心肌IR損傷中鐵死亡的作用的報道較少。因此，本研究旨在探討外源性LXA4對SD大鼠心肌I/R損傷過程中心肌細胞鐵死亡的作用及其影響。

1材料與方法

1.1建立大鼠心肌I/R損傷模型與給藥

動物實驗程序符合國際、國家及機構(gòu)的動物保護和使用準則要求。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過（No.SBQDL-2022-127）。 7～8 周齡、體質(zhì)量 220～2509 的健康雄性SD大鼠購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。大鼠在進行實驗前的12h內(nèi)，實施禁食，仰臥位腹腔注射戊巴比妥鈉（ 45mg/kg） 進行麻醉。麻醉后，于胸骨左側(cè)第四肋間開胸，打開心包后使用30絲線連接左冠狀動脈前降支（LAD），并將一段聚乙烯管置于距正常位置左心房尖端 1mm 處。 10min 后縫線拉緊以阻斷冠狀動脈。隨后迅速將心臟放回胸腔并關(guān)胸。在缺血 45min 后，解除結(jié)扎，進行24h再灌注。

將所購SD大鼠隨機分為4組，對照（Con）組：暴露左冠狀動脈前降支但不結(jié)扎，同時股靜脈注射生理鹽水；LXA4組：股靜脈注射LXA4（ 100μg/κg ，溶于2mL/kg生理鹽水）[15]，其余處理與對照組相同;I/R組：左前降支結(jié)扎 45min ，隨后股靜脈注射生理鹽水（2mL/kg），再灌注 組：缺血 45min 后，股靜脈注射LXA4（ 100μg/κg ，溶于2mL/kg生理鹽水），隨后再灌注 。

1.2心肌組織蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

將左心室心肌組織固定于 4% 多聚甲醛中 隨后進行石蠟包埋。制備厚度為 5μm 的心臟組織切片，固定后沖洗并用HE染色，最后在光學(xué)顯微鏡下進行成像和拍照記錄。

1.3普魯士藍（Perls）染色

心臟組織切片用 4% 多聚甲醛溶液（PFA）固定 15min 后，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次。為增強鐵染色信號，切片在Perls溶液孵育后，再次用PBS清洗，并浸人二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液中。根據(jù)玻片圖像對心臟中的鐵沉積進行評估和分析。

1.4心肌損傷標記物檢測

進行再灌注后，通過股靜脈穿刺采集血液以檢測心肌損傷標記物。在 4^°C 下以 5000×g 離心 20min ，分離血清。使用大鼠心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponinI，cTnl）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（Solarbio），肌酸激酶（creatinekinase，CK）活性檢測試劑盒（Solarbio）和乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒（Solarbio），按照制造商說明書所述步驟測定cTnl、CK和LDH的含量。

1.5氧化水平及抗氧化水平標志物含量檢測

MDA含量使用硫代巴比妥酸檢測試劑盒（Beyotime）在 532nm 處進行測定。GSH水平按照還原型GSH測定試劑盒（Solarbio）制造商的說明在412nm處測定。通過在 240nm 波長下的吸光度減少速率，計算CAT活性。根據(jù)T-SOD檢測試劑盒（Solarbio）制造商的說明，通過羥胺法在 560nm 處測定總SOD的吸光度值?；诳係OD活性測定，使用氫氰酸（HCN）抑制劑區(qū)分Cu/Zn-SOD與Mn-SOD的活性。Cu/Zn-SOD活性通過抑制Mn-SOD后測定，Mn-SOD活性在抑制 Cu/Zn-SOD 后測定，從而分別獲得Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性水平。

1.6 蛋白免疫印跡法（WesternBlot）

使用RIPA裂解液對心肌組織進行充分裂解，并使用二辛可酸（BCA）試劑盒測定總蛋白質(zhì)濃度。使用12% 干二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）凝膠對每個處理組樣品中的總蛋白進行電泳分離，然后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。將載有目的蛋白的PVDF膜用 5% 脫脂牛奶封閉1h，然后在 4^°C 下，與SLC7A11 1：1000 ;ab175186;Abcam，USA）、GPX4（ 1：1 000 ;ab125066；Abcam，USA）和β -actin（ 1：5000 ;ab227387;Abcam，USA）一抗孵育過夜。使用含 0.1% Tween20的Tris緩沖鹽溶液洗滌3遍后，在室溫下與山羊抗兔二抗共孵育2h，通過增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯像。最后，以 β -actin為內(nèi)參，用ImageJ軟件對圖像灰度值進行半定量分析。

1.7實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-timepolymerasechainreaction，RT-PCR）

使用TRlzol試劑盒（Invitrogen，Thermo FisherScientific，USA）按照說明從心肌梗死周圍組織中提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Invitrogen，ThermoFisherScientific）將 2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，根據(jù)SYBRq-PCR試劑盒（TaKaRa，Japan）的說明書的要求，加入引物和SYBR熒光染料，測定目的基因的表達量。引物序列見表1。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPadPrism8軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù) ± 標準差 表示，兩組比較采用Student'st-test檢驗，多組變量比較則采用單向方差分析并進行Bonferroni校正。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 LXA4減輕I/R誘導(dǎo)的SD大鼠心肌損傷

首先，通過HE染色評估LXA4對I/R誘導(dǎo)的心肌損傷結(jié)果的影響。HE染色顯示，Con組和LXA4組大鼠心肌結(jié)構(gòu)正常，排列規(guī)則，橫紋無明顯紊亂。與Con組相比，I/R組大鼠心肌纖維出現(xiàn)斷裂，細胞外間隙擴大，表明IR組大鼠心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的病理損傷。而在 1/R+LXA4 組，大鼠心臟切片顯示橫紋肌纖維損傷較少，排列更為清晰。本研究測定了血漿中cTnl、CK和LDH水平，以評估心臟損傷程度。與Con組相比，I/R組血清cTnI、CK和LDH水平顯著升高，而I/R十LXA4組血清cTnI、CK、LDH水平明顯降低。結(jié)果表明，LXA4對IR引起的心肌損傷具有一定的保護作用。詳見圖1、圖2。

2.2LXA4減輕I/R誘導(dǎo)的SD大鼠心肌炎癥反應(yīng)

與Con組相比，I/R組大鼠TNF -α 、IL-18、IL-6和IL-1β mRNA表達升高（ ?Plt;0.05） ，與I/R組比較，I/R + LXA4組TNF- α 、IL-18、IL-6和IL- $| ＼beta ＼rrangle$ mRNA表達下降 Plt; 0.05）。表明LXA4可以減輕I/R引起的心肌炎癥反應(yīng)。詳見圖3。

（A為各組大鼠TNF -α mRNA表達比較；B為各組大鼠IL-18mRNA表達比較；C為各組大鼠IL-6mRNA表達比較D為各組大鼠IL-1 β mRNA表達比較。與Con組相比， ^?Plt;0.05 ;與I/R組相比，# Plt;0.05 ）

2.3LXA4改善I/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷

與Con組相比，IR組大鼠MDA含量增加，GSHCAT、SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性降低（ Plt; 0.05）。與I/R組比較，I/R+LXA4組大鼠MDA含量降低，GSH、CAT、SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性升高 ?Plt;0.05） 。表明LXA4可減輕I/R誘導(dǎo)的SD大鼠心肌細胞氧化損傷，并提高其抗氧化能力。詳見圖4。

2.4LXA4減輕I/R誘導(dǎo)的SD大鼠心肌細胞鐵死亡

Peris染色結(jié)果顯示，與Con組相比，I/R組大鼠鐵沉積區(qū)域明顯增加，而LXA4處理能夠顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象（見圖5）。與Con組相比，I/R組鐵死亡關(guān)鍵蛋白SLC7A11和GPX4的表達下降（ Plt;0.05 ；與I/R組相比，I/R + LXA4組SLC7A11和GPX4表達上調(diào)（ Plt; 0.05），詳見圖6、圖7。與Con組相比，IR組鐵死亡相關(guān)基因IREB2、ATP5G3、CS、RPL8和PTGS2的mRNA表達上升（ Plt;0.05 ；與I/R組相比， 1/R+LXA4 組鐵死亡相關(guān)基因IREB2、ATP5G3、CS、RPL8和PTGS2表達顯著降低 ?Plt;0.05） ，詳見圖8。表明LXA4可減輕I/R誘導(dǎo)的SD大鼠心肌細胞鐵死亡的發(fā)生。

3討論

心肌再灌注過程可能加劇心肌細胞損傷，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致心肌I/R損傷的主要發(fā)病機制之一[5.33]。心肌I/R損傷時出現(xiàn)鐵死亡現(xiàn)象，并伴隨心肌酶水平的變化，減少鐵死亡的發(fā)生，可以減輕心肌I/R損傷[3436]。本研究結(jié)果表明，在I/R損傷時，給予LXA4治療，可以降低心肌酶損傷水平，減輕炎癥反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激損傷，并可預(yù)防或減輕心肌細胞鐵死亡的發(fā)生。表明LXA4可能通過抑制心肌細胞鐵死亡，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平來減輕心肌I/R損傷。

LXA4是一種內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和促溶解作用[6.9.13]。LXA4通過平衡炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善包括心肌I/R損傷在內(nèi)的多種疾病[3739]。Zhou等[39]研究發(fā)現(xiàn)，LXA4抑制了NLRP3（NLRfamilypyrindomain-containing3）炎性小體的組裝及 ASC（apoptosis-associated speck-like proteincontainingaCARDdomain）與NLRP3的相互作用；同時，LXA4抑制了NLRP3炎性小體激活的上游事件一氧化應(yīng)激，減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生，減輕煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活和線粒體功能障礙；LXA4還可抑制抗氧化途徑中關(guān)鍵分子核因子E2相關(guān)因子2（nuclearfactorE2-related factor2，Nrf2）的激活，從而抑制Kruppel樣因子9（Kruppel-ikeFactor9，KLF9）的表達，并促進Nrf2下游分子硫氧還蛋白還原酶2基因（thioredoxinreductase2gene，TXNRD2）的表達。在心肌IR損傷前后應(yīng)用LXA4可明顯抑制中性粒細胞活化，發(fā)揮心肌保護作用[4]。與上述結(jié)果類似，本研究結(jié)果顯示，LXA4通過抑制MDA的表達，促進GSH、CAT、SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD等的活性，提高心臟組織的抗氧化能力，減輕I/R誘導(dǎo)的SD大鼠心肌細胞氧化損傷。最終，顯著抑制了SD大鼠I/R損傷引起的心臟炎癥反應(yīng)和心肌結(jié)構(gòu)損傷，并降低了血清中cTnI、CK和LDH水平。這些結(jié)果表明LXA4可能通過抗氧化、抗炎作用，對IVR導(dǎo)致的心肌損傷產(chǎn)生保護作用。

鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡途徑，其關(guān)鍵特征是GPX4的耗竭和脂質(zhì)過氧化物的積累[40]。多項研究表明，鐵死亡在包括心肌IR損傷在內(nèi)的許多心血管疾病中發(fā)揮重要作用[25-26.28-29]。鐵死亡與心肌I/R損傷密切相關(guān)，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、ROS產(chǎn)生、GPX4和自噬依賴的鐵死亡途徑調(diào)節(jié)心肌IR損傷，此外鐵死亡的發(fā)生會促進炎癥反應(yīng)的加重，因此，鐵死亡是心肌IR損傷的重要靶點[21.41]。本研究心肌I/R損傷模型中可觀察到心肌細胞的抗氧化能力降低，鐵積累減少，GPX4和SLC7A11活性降低，同時鐵死亡相關(guān)基因的表達增加。這表明在I/R模型中心肌細胞出現(xiàn)了鐵死亡的損傷。然而，在接受LXA4治療后，心肌細胞抗氧化能力有所提升，鐵沉積增加，GPX4和SLC7A11的表達得到增強，與此同時，鐵死亡相關(guān)基因的表達受到了抑制。這表明LXA4治療能夠減少或預(yù)防I/R誘導(dǎo)的心肌細胞鐵死亡。因此，LXA4對心肌IR損傷的保護作用可能通過抑制心肌細胞鐵死亡實現(xiàn)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，在SD大鼠心肌IR損傷中，LXA4可能通過抑制心肌細胞鐵死亡，提高心肌抗氧化和抗炎能力來減輕心肌I/R損傷，發(fā)揮其心臟保護作用。因此，LXA4作為一種新的內(nèi)源性化合物，不僅可以作為一種預(yù)防和治療心肌IVR損傷的有效藥物，而且可能在心肌細胞鐵死亡相關(guān)疾病中具有應(yīng)用潛能。

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