鼠李糖乳桿菌胞外蛋白的化妝品功效研究

近年來(lái)，微生物發(fā)酵技術(shù)在化妝品原料開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用受到學(xué)界及產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注。以雅詩(shī)蘭黛“小棕瓶”精華、蘭蔻“小黑瓶”面部精華液和SK-II“神仙水”為代表的產(chǎn)品，充分驗(yàn)證了該技術(shù)在化妝品產(chǎn)業(yè)化中的重要價(jià)值。隨著化妝品行業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)，消費(fèi)者需求已從單一功效轉(zhuǎn)向?qū)Α疤烊?、綠色、溫和”特性的綜合追求[1]。作為生物制造技術(shù)的重要分支，微生物發(fā)酵技術(shù)不僅能滿足化妝品功效原料的開(kāi)發(fā)需求，還能通過(guò)生物轉(zhuǎn)化來(lái)富集活性成分、賦予產(chǎn)物新功能特性[2]，并有效降低天然提取物的毒性[3]。

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus），是一種革蘭氏陽(yáng)性益生菌，屬乳桿菌屬，鼠李糖亞種，常存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，具有厭氧、耐酸且不產(chǎn)芽孢的特性[4]。其顯著的耐酸、耐膽汁鹽及耐多種抗生素的生物學(xué)特性，使其能夠在胃酸和膽汁的嚴(yán)苛環(huán)境中存活，并以活菌形式到達(dá)腸道，發(fā)揮益生菌功能[5，6]。鼠李糖乳桿菌可用于發(fā)酵生產(chǎn)乳制品、嬰幼兒食品、果汁等食品，還可用于藥品制備，起到調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉[7]、促進(jìn)腸道健康和免疫力提升等功效[8]。作為一種不利用乳糖的乳酸菌，鼠李糖乳桿菌能夠發(fā)酵產(chǎn)生單糖、蛋白質(zhì)等多種活性物質(zhì)[9，10]，具有優(yōu)異的抗氧化、抗炎活性，為其作為化妝品功效原料開(kāi)發(fā)提供了可能。

為探究鼠李糖乳桿菌的研究現(xiàn)狀及其在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，本研究采用文獻(xiàn)調(diào)研法，檢索了中國(guó)知網(wǎng)和WebofScience數(shù)據(jù)庫(kù)近五年以鼠李糖乳桿菌為主題的相關(guān)文獻(xiàn)，并利用VOSviewer軟件進(jìn)行關(guān)鍵詞聚類分析。調(diào)研結(jié)果顯示，當(dāng)前研究熱點(diǎn)主要集中于鼠李糖乳桿菌的抗氧化、抗炎、抑菌及益生菌特性，以及以胞外多糖為代表的活性物質(zhì)，而對(duì)胞外蛋白的研究較為匱乏。為驗(yàn)證鼠李糖乳桿菌胞外蛋白是否具有與胞外多糖相似的抗氧化和抗炎活性，本研究通過(guò)微生物發(fā)酵法制備鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液，并采用硫酸銨鹽析法提取50%和75%兩個(gè)鹽濃度梯度下的胞外蛋白（ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ）。通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的抗氧化性、抗炎性、細(xì)胞毒性及安全性，以判斷其是否符合化妝品功效原料開(kāi)發(fā)的要求，并探討其在化妝品領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值。

Part1

材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

MRS培養(yǎng)基，鼠李糖乳桿菌，北京和益源生物技術(shù)有限公司；硫酸銨、PBS溶液、脂多糖（LPS）、CCK-8試劑盒，北京百瑞極生物科技有限公司；ABTS試劑盒、FRAP試劑盒、TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒、IL-8試劑盒、IL-1β試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；DPPH，Sigma公司；硫酸亞鐵、水楊酸—乙醇、過(guò)氧化氫，國(guó)藥集團(tuán)；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞），中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；MEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械；恒溫培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；低速大容量離心機(jī)，無(wú)錫市瑞江分析儀器；ME-104E精密天平，梅特勒—托利多儀器；酶標(biāo)儀，ThermoFisher科技公司；WJ-80A-Ⅱ型CO2恒溫培養(yǎng)箱，上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1鼠李糖乳桿菌胞外蛋白的制備

將鼠李糖乳桿菌菌粉以3%接種量接入MRS培養(yǎng)基，在43℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，在12000rpm、4℃下，離心15min，收集上清液，即得鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液。向發(fā)酵液中加入硫酸銨（144g/L菌液），在磁力攪拌器上以200rpm、25℃攪拌均勻后，于4℃冰箱靜置1—2h。在12000rpm、4℃下，離心15min后，收集上清液和蛋白沉淀，用蒸餾水溶解沉淀，制得25%鹽濃度下的蛋白質(zhì)溶液。因25%鹽濃度下蛋白沉淀量極少，故不予收集。向上述上清液中繼續(xù)加入硫酸銨（158g/L菌液、176g/L菌液），分別制備50%和75%鹽濃度的溶液，重復(fù)上述攪拌、靜置和離心步驟，收集蛋白沉淀并用蒸餾水溶解，分別得到50%和75%鹽濃度下的鼠李糖乳桿菌胞外蛋白溶液。

將上述胞外蛋白溶液分別通過(guò)0.22μm水相濾膜過(guò)濾，裝入500Da透析袋中，透析2d，每日換液3—4次。透析完成后，分別獲得50%鹽濃度下鹽析得到的鼠李糖乳桿菌胞外蛋白（記為ECP-Ⅰ）和75%鹽濃度下鹽析得到的鼠李糖乳桿菌胞外蛋白（記為ECP-Ⅱ）。

1.3.2ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ分子量的測(cè)定

采用凝膠滲透色譜法（GPC）測(cè)定ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的分子量分布。

1.3.3總抗氧化能力測(cè)定

采用ABTS試劑盒法和FRAP試劑盒法分別測(cè)定ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ溶液的ABTS自由基清除率和FRAP鐵離子還原能力，詳細(xì)操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取8mgDPPH，溶于100mL無(wú)水乙醇，配置成2×10-4mol/L的DPPH溶液，避光保存。將ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ用蒸餾水稀釋成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125和0.015625mg/mL六個(gè)質(zhì)量濃度梯度，取各濃度樣品液與DPPH溶液按1∶1體積比混勻，避光靜置30min后，于517nm測(cè)定吸光度（A1）；以等體積蒸餾水替代樣品溶液，與DPPH溶液按1∶1體積比混勻，避光靜置30min后，于517nm測(cè)定吸光度（A0）；取等體積的ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ樣品溶液，與蒸餾水按1∶1體積比混勻，避光靜置30min后，于517nm測(cè)定吸光度（A2）。按公式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率：

1.3.5羥自由基（·OH）清除實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.223gFeSO4·7H2O溶于100mL蒸餾水，配置成8.0mmol/LFeSO4溶液；準(zhǔn)確稱取0.02g水楊酸溶于50mL無(wú)水乙醇，配置成3.0mmol/L水楊酸溶液；取200μLH2O2，加入9.8mL蒸餾水，配置成0.02mol/LH2O2溶液。將ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ用蒸餾水稀釋，配置成2.0、1.0、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/mL六個(gè)質(zhì)量濃度梯度，備用。

取若干2mLEP管，依次加入0.15mL8.0mmol/LFeSO4溶液、0.5mL3.0mmol/L水楊酸溶液、0.5mL不同濃度ECP-Ⅰ或ECP-Ⅱ樣品溶液、0.225mL蒸餾水和0.125mL0.02mol/LH2O2溶液，混勻后于37℃恒溫箱中孵育1h。在4000rpm下離心10min，取上清液于510nm測(cè)定吸光度（A1）。以0.5mL蒸餾水替代樣品溶液，共加入0.725mL蒸餾水，其他溶液加入量與A1組一致，混勻后于37℃孵育1h，后續(xù)操作與A1組一致，得吸光度（A0）；以0.5mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液替代3.0mmol/L水楊酸溶液換為同體積，其他溶液加入量與A0組一致，混勻后于37℃孵育1h，后續(xù)操作與A1組一致，得吸光度（A2）。按公式（2）計(jì)算羥自由基清除率：

1.3.6細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將HaCaT細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)置空白對(duì)照組，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后，用150μLPBS溶液洗滌2—3次。用MEM培養(yǎng)基將ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ稀釋成1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL五個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別加入96孔板中，記為樣品組。以等體積MEM培養(yǎng)基替代樣品溶液，記為細(xì)胞對(duì)照組，每組設(shè)三孔平行，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后，用150μLPBS溶液洗滌2—3次，后續(xù)操作嚴(yán)格按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用酶標(biāo)儀于450nm測(cè)定吸光值。按公式（3）計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.3.7LPS誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞炎癥模型及細(xì)胞存活率測(cè)定

將HaCaT細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)置空白對(duì)照組，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后，用150μLPBS溶液洗滌2—3次。加入200μg/mLLPS，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后，用150μLPBS溶液洗滌2—3次。用MEM培養(yǎng)基將ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ稀釋至2.0、1.0、0.5、0.25、0.125mg/mL五個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別加入96孔板中，記為樣品組。以等體積MEM培養(yǎng)基替代樣品溶液，記為細(xì)胞對(duì)照組，每組設(shè)三孔平行，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后，用150μLPBS溶液洗滌2—3次，后續(xù)操作嚴(yán)格按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用酶標(biāo)儀于450nm測(cè)定吸光值。按公式（3）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.8炎癥因子含量測(cè)定

選取1.0mg/mLECP-Ⅰ和0.5mg/mLECP-Ⅱ樣品溶液作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1β試劑盒，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)樣品對(duì)LPS誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1β四種炎癥因子含量的影響，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.9紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)

將兔血于離心機(jī)1500×g離心10min，棄上清，保留沉淀。將沉淀與PBS溶液按2∶5體積比混勻，再次以1500×g離心10min，棄上清，重復(fù)洗滌2—3次，完成洗血步驟。取最后一次離心沉淀，用PBS溶液按1∶49體積比稀釋，制備紅細(xì)胞懸液（RBC）。取0.5mLRBC溶液與4.5mL蒸餾水混勻，于541nm測(cè)定吸光度，吸光度在0.5±0.025范圍內(nèi)即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ用PBS溶液稀釋至2.0、1.0、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/mL六個(gè)質(zhì)量濃度梯度。取各濃度樣品溶液與RBC溶液按1∶3體積比混勻，于室溫?fù)u床孵育60min后，以10000×g離心1min終止孵育，取上清液于560nm測(cè)定吸光度（A1）；以等體積PBS溶液替代樣品溶液，與RBC溶液按1∶3體積比混勻，按上述條件孵育和離心，作為陰性對(duì)照，于560nm測(cè)定吸光度（A0）。以等體積蒸餾水替代樣品溶液，與RBC溶液按1∶3體積比混勻，按上述條件孵育和離心，作為陽(yáng)性對(duì)照，于560nm測(cè)定吸光度（A2），按公式（4）計(jì)算紅細(xì)胞溶血率：

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及計(jì)算采用MicrosoftExcel2021處理，用GraphPadPrism10軟件進(jìn)行作圖。使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用T檢驗(yàn)驗(yàn)證組間差異顯著性（nsPgt;0.05，#，*Plt;0.05，##，**Plt;0.01，###，***Plt;0.001）。當(dāng)Plt;0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Part2

結(jié)果與討論

2.1ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的分子量分布

ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的分子量（Mw）及峰面積分布如表1和圖1所示。ECP-Ⅰ的平均分子量為9.4958×104Da，主峰（峰3）占比92.92%；ECP-Ⅱ的平均分子量為6.0361×104Da，主峰（峰5）占比92.77%。隨鹽濃度梯度增加，分子量減小，可能是由于高鹽濃度通過(guò)影響電荷間的相互作用改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而表現(xiàn)為較小的分子量[11，12]。ECP-Ⅰ的多分散系數(shù)（Mw/Mn）為8.34，ECP-Ⅱ?yàn)?.17，表明ECP-Ⅰ的分子組成更復(fù)雜。

2.2體外抗氧化活性研究

ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)[13]、FRAP還原能力實(shí)驗(yàn)[14]、DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)[15]是評(píng)估樣品總抗氧化能力的常用方法?！H是氧化性最強(qiáng)的自由基之一，可對(duì)人體產(chǎn)生多種氧化損失[16，17]。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)評(píng)估ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的抗氧化活性。

如圖2a所示，在4.0mg/mL的測(cè)定濃度下，ECP-Ⅰ的ABTS自由基清除率和FRAP還原能力分別相當(dāng)于0.37mmol/LTrolox、1.15mmol/LTrolox，而ECP-Ⅱ分別相當(dāng)于0.05mmol/LTrolox、0.30mmol/LTrolox，初步表明ECP-Ⅰ的總抗氧化能力高于ECP-Ⅱ。經(jīng)過(guò)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，ECP-Ⅰ的ABTS自由基清除能力（Plt;0.05）和FRAP還原能力（Plt;0.01）顯著優(yōu)于ECP-Ⅱ，顯示出更強(qiáng)的抗氧化活性。

如圖2b、c所示，隨著質(zhì)量濃度的增加，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的DPPH自由基清除率和·OH清除率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且ECP-Ⅰ抗氧化能力優(yōu)于ECP-Ⅱ。在低質(zhì)量濃度下，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的DPPH自由基清除率和·OH清除率差異均較小；但隨著質(zhì)量濃度升高，二者清除率差距均逐漸增大。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5mg/mL時(shí)，ECP-Ⅰ的DPPH自由基的清除率為90.94%，而ECP-Ⅱ?yàn)?5.19%；當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0mg/mL時(shí)，ECP-Ⅰ的·OH清除率為48.71%，而ECP-Ⅱ?yàn)?1.17%。IC50值越低，表明抗氧化劑的自由基清除能力越強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)分析表明，ECP-Ⅰ清除DPPH自由基和清除·OH的IC50分別為0.0425mg/mL和3.0625mg/mL，而ECP-Ⅱ分別為0.3760mg/mL和10.8390mg/mL。結(jié)合圖2和IC50可以看出，ECP-Ⅰ的IC50值低于ECP-Ⅱ，表明ECP-Ⅰ清除DPPH自由基（Plt;0.05）和清除·OH能力（Plt;0.05）顯著優(yōu)于ECP-Ⅱ。綜上所述，ECP-Ⅰ抗氧化能力均高于ECP-Ⅱ，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。

2.3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

CCK-8法通過(guò)測(cè)定吸光值間接反映細(xì)胞代謝活性及存活率，是評(píng)估細(xì)胞毒性和增殖能力的常用方法[18]。如圖3所示，ECP-Ⅰ在各質(zhì)量濃度下對(duì)HaCaT細(xì)胞幾乎無(wú)細(xì)胞毒性，且表現(xiàn)出一定的促增殖作用，在0.5mg/mL時(shí)細(xì)胞存活率達(dá)157.56%，促增殖效果最強(qiáng)。ECP-Ⅱ在質(zhì)量濃度低于0.5mg/mL時(shí)無(wú)明顯細(xì)胞毒性，且具有促增殖作用，在0.125mg/mL時(shí)細(xì)胞存活率達(dá)116.92%，促增殖效果最佳。統(tǒng)計(jì)分析表明，在質(zhì)量濃度≤0.25mg/mL時(shí)，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ均無(wú)細(xì)胞毒性，且ECP-Ⅰ的促增殖能力顯著優(yōu)于ECP-Ⅱ（Plt;0.05）。

2.4LPS誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞炎癥模型的存活率測(cè)定

LPS可通過(guò)與細(xì)胞表面Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活NF-κB等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[19]，誘導(dǎo)細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)[20]。為篩選后續(xù)抗炎實(shí)驗(yàn)的安全濃度，本研究采用LPS刺激HaCaT細(xì)胞建立炎癥模型，并測(cè)定不同質(zhì)量濃度下ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的細(xì)胞存活率。如圖4所示，HaCaT細(xì)胞存活率隨樣品質(zhì)量濃度升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。ECP-Ⅰ在1.0mg/mL時(shí)存活率最高，達(dá)112.07%，其他濃度均低于100.00%；ECP-Ⅱ在0.5mg/mL時(shí)存活率最高，達(dá)110.62%，低于0.25mg/mL或高于1.0mg/mL時(shí)存活率低于100.00%。因此，選取1.0mg/mL的ECP-Ⅰ和0.5mg/mL的ECP-Ⅱ作為安全濃度，用于后續(xù)抗炎實(shí)驗(yàn)。

2.5ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ?qū)ρ装Y因子含量的影響

IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1β是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，四種炎癥因子表達(dá)水平會(huì)迅速上升，導(dǎo)致皮膚紅腫、瘙癢和組織損傷[21，22，23]。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，通過(guò)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和真皮成纖維細(xì)胞中膠原蛋白生成，改變皮膚結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致紅腫，在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮核心作用[21]。TNF-α是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵介質(zhì)，可誘導(dǎo)IL-6、IL-8及自身正反饋表達(dá)，形成炎癥因子風(fēng)暴，導(dǎo)致皮膚紅腫和瘙癢[23]。IL-8是一種趨化因子，通過(guò)吸引中性粒細(xì)胞到炎癥部位，促進(jìn)其遷移和激活，導(dǎo)致皮膚紅腫和組織損傷[23，24]。IL-1β是一種促炎因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及組織損傷，加重皮膚炎癥[25]。

如圖5所示，空白組的IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1β含量分別為31.04、19.77、384.28和6.91pg/mL；模型組對(duì)四種炎性因子含量顯著上調(diào)，分別為67.99、55.77、527.05和11.18pg/mL。經(jīng)ECP-Ⅰ處理后，四種炎癥因子含量分別降至34.17、29.57、400.47和8.24pg/mL；經(jīng)ECP-Ⅱ處理后，含量分別降至40.21、34.28、440.66和9.56pg/mL。結(jié)果表明，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ均可有效抑制IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1β的分泌（Plt;0.05）。單因素方差分析顯示，兩種蛋白處理組與模型組間相比均具有顯著性差異（Plt;0.05），且ECP-Ⅰ在所有炎癥因子上的抑制效率均顯著高于ECP-Ⅱ（Plt;0.05），此差異可能與其蛋白組分濃度梯度及結(jié)構(gòu)特性相關(guān)，推測(cè)ECP-Ⅰ含有更多抗炎活性位點(diǎn)[26]。結(jié)果表明，ECP-Ⅰ抑制細(xì)胞內(nèi)炎癥因子釋放的作用更強(qiáng)，具有更高的抗炎活性。

2.6樣品的安全性評(píng)價(jià)

原料的安全性是化妝品產(chǎn)品安全的前提條件，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出安全溫和的原料，能夠避免因原料刺激引發(fā)的皮膚問(wèn)題，從而為產(chǎn)品功效提供可靠保障。紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)基于紅細(xì)胞在溶血條件下釋放血紅蛋白的特性，通過(guò)評(píng)估受試物誘導(dǎo)紅細(xì)胞膜破裂并釋放血紅蛋白的程度，用于檢測(cè)物質(zhì)的潛在刺激性和安全性。

結(jié)果如圖6所示，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的紅細(xì)胞溶血率均隨質(zhì)量濃度增加而升高，但均低于5%，未出現(xiàn)明顯溶血現(xiàn)象。當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0mg/mL時(shí)，ECP-Ⅰ的紅細(xì)胞溶血率為4.68%，ECP-Ⅱ?yàn)?.58%，統(tǒng)計(jì)分析顯示，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的溶血率無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0.0625—2.0mg/mL時(shí)，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ均具有低刺激性和高安全性。

Part3

結(jié)論

鼠李糖乳桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性益生菌，其作為一種不利用乳糖的乳酸菌，能夠發(fā)酵產(chǎn)生單糖、蛋白質(zhì)等多種活性物質(zhì)，具有優(yōu)異的抗氧化、抗炎活性。近年來(lái)，關(guān)于鼠李糖乳桿菌的研究較為豐富，但研究熱點(diǎn)主要集中于以胞外多糖為代表的活性物質(zhì)，對(duì)胞外蛋白的研究較為匱乏。本文以鼠李糖乳桿菌胞外蛋白為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)比ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的分子量特性、對(duì)不同自由基的清除能力、抗炎能力以及安全性等，顯示ECP-Ⅰ具有更復(fù)雜的分子特性以及更強(qiáng)的抗氧化和抗炎功效，為開(kāi)發(fā)其為化妝品功效原料提供了初步的研究基礎(chǔ)。顯然，對(duì)于鼠李糖乳桿菌胞外蛋白的研究不應(yīng)局限于此，未來(lái)還需要做更多的深入研究，例如ECP-Ⅰ的理化性質(zhì)、功效機(jī)理、人體功效等。更進(jìn)一步的是，本文只對(duì)鼠李糖乳桿菌胞外蛋白進(jìn)行研究，未來(lái)還可以對(duì)鼠李糖乳桿菌的胞內(nèi)產(chǎn)物等進(jìn)行研究，為鼠李糖乳桿菌在化妝品功效原料領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)提供更多的研究基礎(chǔ)。