全分子量透明質(zhì)酸與二羥丙基精氨酸鹽酸鹽之間“分子鉚釘”技術(shù)的機制及應(yīng)用前景探究

隨著人們對皮膚干燥問題的關(guān)注度不斷提高，皮膚保濕已成為肌膚護理的重要熱點之一。皮膚干燥不僅影響皮膚的外觀（潤澤、彈性和緊實度），而且影響皮膚對活性物質(zhì)的吸收[1]。因此，具有高效保濕功能的護膚品是消費者的基本且關(guān)鍵需求之一，而持久的保濕效果則是化妝品配方的核心目標(biāo)[2]。透明質(zhì)酸（HyaluronicAcid，HA）是一種由乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸組成的鏈狀高分子酸性黏多糖。由于HA分子鏈中單糖間的氫鍵作用，即使在低濃度下，HA也能形成獨特的蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而吸附約自身重量1000倍的水分，展現(xiàn)出強大的保濕能力[3]。因此，HA在護膚產(chǎn)品中的應(yīng)用日益廣泛，并逐漸成為核心保濕成分之一[3，5]。研究還證實，HA除保濕外，還具有抗炎舒緩[6]和抗皺緊致等功效[7]，尤其是小分子量的HA[8]。然而，HA的多羥基結(jié)構(gòu)使其高度親水且?guī)ж?fù)電，導(dǎo)致其在皮膚和頭發(fā)上的沉積效率較低，容易被水或汗水沖洗掉，難以實現(xiàn)預(yù)期的保濕和其他功效。單純增加HA用量不僅無法改善沉積效果，還會增加配方成本并影響使用感受[9-11]。傳統(tǒng)HA化妝品應(yīng)用中，為增強其皮膚駐留性往往需要對HA分子進行化學(xué)修飾（如交聯(lián)、酯化或接枝改性），這些方法雖然能提高HA的穩(wěn)定性，但存在工藝復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、成本高昂等問題，且可能影響HA的天然生物活性[12]。研究發(fā)現(xiàn)，含有羥基和氨基的二羥丙基精氨酸鹽酸鹽（DihydroxypropylArgininehydrochloride，AR）能與海藻糖形成強氫鍵網(wǎng)絡(luò)，顯著提升海藻糖保濕效果，同時避免了傳統(tǒng)化學(xué)修飾方法帶來的工藝復(fù)雜性和潛在刺激性[13]。受此啟發(fā)，本研究探索通過HA與AR的分子協(xié)同作用來提升HA的沉積性能和保濕功效。

本研究采用專利的“全分子量透明質(zhì)酸”（HA60和HA20）與AR構(gòu)建新型分子作用體系。AR分子由甘油和精氨酸組成，其中甘油是高效保濕劑，精氨酸作為帶正電荷的氨基酸保濕劑，能與皮膚、頭皮和受損的頭發(fā)表面產(chǎn)生強靜電作用。實驗發(fā)現(xiàn)，特定配比的HA與AR可形成強分子間作用力，這種帶正電荷的復(fù)合物能與帶負(fù)電的皮膚表面產(chǎn)生強烈相互作用，顯著提升HA的抗沖洗性和長效保濕性。我們將這種分子間作用機制命名為“分子鉚釘”效應(yīng)，該機制無需復(fù)雜化學(xué)修飾或生物發(fā)酵工藝，即可顯著改善HA在皮膚和毛發(fā)上的沉積性能、持久保濕效果及使用感受。

Part1

實驗部分

1.1材料、試劑與儀器

重均分子量為600kDa的“全分子量透明質(zhì)酸”（HA60）和重均分子量為200kDa的“全分子量透明質(zhì)酸”（HA20），梅曄生物醫(yī)藥股份有限公司；二羥丙基精氨酸鹽酸鹽水溶液（AR），日本SeiwaKasei公司；去離子水（0.055μS/cm），實驗室超純水機制備；Decon90，英國迪康公司；大豆磷脂酰膽堿（卵磷脂，純度≥98%），上海麥克林生化有限公司；潔面啫喱，梅曄生物醫(yī)藥股份有限公司。

NANOITC等溫滴定量熱儀，美國TA公司；KSVZ-500石英晶體微天平，KSVInstrument公司；NanoWizard4XP原子力顯微鏡，美國Bruker公司；氧化硅石英晶體（QSX303，ATcut，4.95MHz），BiolinScientificAB公司。

1.2實驗方法

1.2.1分子間作用力分析

通過等溫滴定量熱法，使用NANOITC等溫滴定量熱儀獲得AR與HA化合物間相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)，并對其進行分析。樣品配置為：用去離子水配置5mg/mL的AR水溶液和2mg/mL的HA20與HA60水溶液。滴定程序設(shè)置為：2.5μL每滴，共20滴；轉(zhuǎn)速250rpm，溫度25℃；儀器基線穩(wěn)定時間3600s。實驗步驟為：樣品經(jīng)過脫氣處理10min。先用300mL10%Decon90和1L去離子水沖洗滴定池。滴定針吸取52μLAR溶液樣品，進樣針取350μLHA20或者HA60溶液樣品。滴定針裝載完畢后點擊開始平衡基線。最后用NanoAnalysis分析處理結(jié)果。

1.2.2協(xié)同表面沉積評估

采用石英晶體微天平與耗散監(jiān)測（QuartzCrystalMicrobalancewithDissipationmonitoring，QCM-D）與原子力顯微鏡（AtomicForceMicroscopy，AFM）相結(jié)合，可以定性和定量地量化沖洗過程中樣品的協(xié)同表面沉積。

1.2.2.1QCM-D沉積質(zhì)量曲線測定

實驗樣品制備：所有實驗樣品均由去離子水混合，在室溫下磁力攪拌直到完全溶解，配置的溶液組合如下表1所示。

SiO2表面制備：在測量前，使用2%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液沖洗氧化硅石英晶體（QSX303，ATcut，4.95MHz），然后用去離子水徹底沖洗干凈，使用氮氣吹至干燥。將去離子水以100μL/min的流量注入流池30min，以獲得穩(wěn)定振蕩頻率（△F）和能量耗散（△D）變化信號的基線。此時，不同頻率的曲線高度重合，并穩(wěn)定在0Hz。穩(wěn)定后，重新開始測量，信號穩(wěn)定至少需要5min。

卵磷脂表面制備方法：將卵磷脂按照70mg/mL的濃度，緩慢地溶解在乙醇中。等待所有頻率和耗散都穩(wěn)定后，將70mg/mL卵磷脂—乙醇溶液注入二氧化硅晶體，吸附時間為10min。將吸收后的卵磷脂進一步用去離子水洗滌約10min，直到基線變得穩(wěn)定。以上步驟使得在晶體表面獲得一個緊湊的脂質(zhì)雙分子層來模擬肌膚表面，模擬圖如圖1所示。

樣品吸附—沖洗曲線：分別加入表1中的測試樣品，在37°C的二氧化硅脂質(zhì)雙層表面下吸附2min。再次用去離子水清洗樣品，直到頻率曲線穩(wěn)定（大約需要5min）。每次測量后都要仔細(xì)清洗晶體傳感器。

數(shù)據(jù)處理過程：在實驗過程中，連續(xù)實時監(jiān)測△F和△D值，并記錄F3-F13的奇數(shù)諧波的頻率和耗散變化。使用QSenseDFind軟件（BiolinScientificAB）對吸附數(shù)據(jù)進行分析，并使用SmartFit模型（用于Dgt;106）和索爾布雷模型（用于Dlt;106）對數(shù)據(jù)進行擬合，最終得到吸附質(zhì)量。

1.2.2.2AFM沉積顯微結(jié)構(gòu)

實驗樣品制備：將活性物添加到成品洗面奶和成品護膚面霜中充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆颍渲玫臉悠方M合如表2所示。測試所用的洗面奶具體配方如表3所示，護膚面霜具體配方如表4所示。

AFM樣品制樣：使用清潔過的玻璃蓋玻片來模擬親水表面。玻璃蓋玻片用乙醇和去離子水徹底清洗，實驗前用真空干燥。用自來水沖洗30s，用1∶10稀釋的清潔液浸泡30s，最后用自來水沖洗20s。準(zhǔn)備完成后，所有的表面在測量前都保存在無灰塵的培養(yǎng)皿中。

原子力顯微結(jié)構(gòu)成像：AFM圖像采用BrukerDimensionIconAFM系統(tǒng)采集。在使用OTESPA-R3探針，頻率為300kHz，彈簧常數(shù)為26N/m的環(huán)境下，采用標(biāo)準(zhǔn)輕敲模式。圖像的掃描速率為1Hz，每幀掃描密度為512行。采用納米鏡分析軟件進行原子力顯微鏡圖像分析。

1.2.3消費者使用測試

受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：招募30名志愿者（女性25名，男性5名），年齡范圍為18—45歲，平均年齡29.9±6.6歲。受試者經(jīng)篩選問卷評估，83.3%為中度敏感肌膚，16.7%為輕度敏感肌膚，且無嚴(yán)重過敏史或近期藥物使用史。

測試方法：本研究采用消費者使用測試法，試驗周期為28天。受試者每日使用樣品潔面啫喱兩次（早晚潔面），使用方法為取適量產(chǎn)品加水揉搓起泡后清潔面部，清水洗凈。試驗流程包括：于試驗前（W0）和試驗后第4周（W4）分別進行問卷調(diào)查，評估產(chǎn)品功效及安全性。采用描述性統(tǒng)計方法，計算各評價指標(biāo)的同意率（評分≥3分視為有效）。安全性評估依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）的皮膚不良反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)，記錄并分析不良事件。

Part2

結(jié)果與討論

2.1HA-AR分子相互作用分析

采用ITC技術(shù)對HA與AR的相互作用進行表征，通過NanoAnalyze軟件處理數(shù)據(jù)并擬合得到AR與HA20和HA60相互作用的滴定曲線（如圖2所示），獲得分子相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)，包括解離常數(shù)（Kd）、結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點數(shù)（n）、摩爾結(jié)合焓（ΔH）、摩爾結(jié)合熵（ΔS）、吉布斯自由能（ΔG）、摩爾恒壓熱容（ΔCp）和動力學(xué)參數(shù)。數(shù)據(jù)分析表明，AR與HA20和HA60的相互作用均表現(xiàn)出顯著的熱量變化，且擬合曲線呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，證實了HA與AR之間存在特異性分子間作用力。

2.2復(fù)合物在模擬皮膚表面的沉積動力學(xué)研究

通過QCM-D技術(shù)研究了AR與HA在卵磷脂雙層修飾表面（模擬皮膚表面）的吸附—漂洗曲線，如圖3所示。實驗結(jié)果顯示，單組分0.1%HA對卵磷脂雙層修飾表面的吸附量有限且易被沖洗。AR因其陽離子特性表現(xiàn)出良好的初始吸附性和耐沖洗性。在HA20體系中，相較于單一0.1%HA20，0.1%HA20+0.5%AR在整個吸附和漂洗過程中對卵磷脂雙層表面的吸附質(zhì)量均有提高。0.1%HA20+0.5%AR復(fù)合物的吸附質(zhì)量在180s時達到最大值30.08±3.29ng/cm2，與同一時間點的0.1%HA20相比，提升了51.85±5.55ng/cm2。在HA60體系中，0.05%HA60+0.5%AR復(fù)合物在整個吸附和漂洗過程中對卵磷脂雙層表面的吸附質(zhì)量均有高于0.05%HA60的吸附質(zhì)量，在80s后沉積量較單一HA60提高40±3.91ng/cm2。這些結(jié)果證實了HA-AR復(fù)合物具有顯著的協(xié)同沉積效應(yīng)，HA和AR之間的分子協(xié)同作用確實可以幫助HA在模型表面上有更好的沉積效果，有著更加耐沖洗的效果。

2.3復(fù)合物在化妝品基質(zhì)中的微觀形貌特征

采用AFM技術(shù)對洗去型和駐留型產(chǎn)品中HA在吸附—沖洗后的拓?fù)涮卣鬟M行研究。洗面奶體系測試結(jié)果顯示（圖4），含0.05%HA20的洗面奶在清洗后的表面主要呈現(xiàn)出均勻的紋理，僅有稀疏的幾納米大小的顆粒結(jié)構(gòu)。相比之下，含有0.05%HA20+0.5%AR的洗面奶在清洗后，玻璃片上可觀察到一層相當(dāng)均勻的沉積斑點。通過計數(shù)單位面積沉積斑點的定量分析，相比于單獨添加0.05%HA20的洗面奶（平均沉積斑點數(shù)為10±2個/μm2），添加0.05%HA20+0.5%AR的洗面奶（平均沉積斑點數(shù)為360±42個/μm2）在模型表面的吸附沉積效果提高了36倍。

面霜體系測試結(jié)果如圖5所示。只涂抹含有0.05%HA20面霜的玻璃片上出現(xiàn)非常不均勻的大塊沉積斑點，存在明顯聚集現(xiàn)象。而涂抹含有0.05%HA20+0.5%AR面霜的玻璃片上可觀察到一層相當(dāng)均勻的沉積斑點，無明顯聚集。通過計數(shù)單位面積沉積斑點的數(shù)量可以得出，相比于單獨添加0.05%HA20的面霜（平均沉積斑點數(shù)為3個/μm2），添加0.05%HA20+0.5%AR的面霜（平均沉積斑點數(shù)為36個/μm2）在模型表面的吸附沉積均勻效果提高了12倍。以上實驗結(jié)果也印證了HA和AR之間存在分子間的作用力，并且能顯著提高HA的吸附沉積效果和均勻度。

2.4復(fù)合物產(chǎn)品的功效與安全性評價

經(jīng)過28天消費者使用測試，100%受試者認(rèn)為產(chǎn)品使用過程中未出現(xiàn)過敏、刺痛、發(fā)癢或丘疹，96.7%未出現(xiàn)肌膚緊繃感；93.3%受試者認(rèn)可產(chǎn)品使用后皮膚立感水潤，90.0%認(rèn)為保濕效果持續(xù)6小時以上，96.7%對整體保濕效果滿意；100%受試者認(rèn)可產(chǎn)品泡沫豐富且能卸除基礎(chǔ)彩妝，96.7%對整體清潔效果滿意，90.0%認(rèn)為無殘留需二次清潔。所有受試者在試驗期間均未出現(xiàn)紅斑、丘疹、水皰等皮膚不良反應(yīng)（分級均為0級），表明樣品在試驗條件下無刺激性。測試結(jié)果說明測試用潔面產(chǎn)品具有顯著的溫和性及保濕功效，且適用于敏感肌膚，安全無不良反應(yīng)。

Part3

結(jié)論

本研究通過等溫滴定量熱法證實HA與AR之間存在分子間相互作用力（主要為氫鍵作用），且該作用力與HA分子量無關(guān)。QCM-D測試顯示，HA-AR復(fù)合物在模擬皮膚磷脂雙分子層表面的沉積量顯著高于單一HA（HA20提升51.85ng/cm2，HA60提升40ng/cm2）。AFM分析表明，該復(fù)合物可使洗面奶產(chǎn)品的沉積效果提升36倍，面霜產(chǎn)品的涂抹均勻性提高12倍。消費者測試證實含HA-AR復(fù)合物的潔面產(chǎn)品具有良好的溫和性和保濕功效，適用于敏感肌膚且安全性優(yōu)異。需要指出的是，本研究尚未系統(tǒng)評估長期使用對皮膚屏障功能的影響，也未探究極端條件下復(fù)合物的穩(wěn)定性變化。后續(xù)研究計劃通過紅外光譜和核磁共振等方法進一步驗證分子間作用機制，并通過長期使用試驗評估該技術(shù)在駐留型產(chǎn)品中的應(yīng)用效果及其對皮膚屏障功能的影響。同時將開展不同氣候條件下的產(chǎn)品穩(wěn)定性研究，為產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供更全面的數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，實驗結(jié)果表明，全分子量HA（HA20、HA60）與AR通過氫鍵等相互作用形成了預(yù)期的“分子鉚釘”機制。該機制能顯著提升HA在皮膚表面的沉積質(zhì)量和均勻性，實現(xiàn)長效保濕效果，同時改善產(chǎn)品的使用感受和安全性。該方法工藝簡便，無需復(fù)雜生化處理，具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。本研究為拓展HA在化妝品中的應(yīng)用提供了新思路，特別是在長效保濕和抗衰老功效方面具有重要價值。