重組膠原蛋白在不同離體皮膚滲透性差異研究

在醫(yī)學(xué)與化妝品領(lǐng)域，皮膚滲透性研究一直占據(jù)著重要地位。在醫(yī)學(xué)上，了解皮膚滲透性對藥物經(jīng)皮吸收效果的影響，有助于開發(fā)更有效的透皮治療方案[1]。而在化妝品領(lǐng)域，皮膚滲透性則關(guān)乎各類功效成分能否安全且有效地作用于皮膚深層[2]。離體皮膚模型被廣泛應(yīng)用于研究皮膚的滲透性[3，4]。

然而，不同種屬來源以及同一種屬不同部位的離體皮膚，其結(jié)構(gòu)和功能存在顯著差異，這些差異會直接導(dǎo)致皮膚滲透性的不同[5，6]。

目前，離體豬皮和離體鼠皮是最為常用的代替人體皮膚的模型。然而，離體豬皮在組織結(jié)構(gòu)上與人體皮膚較為相似。離體鼠皮成本低、易獲取，在初步篩選研究中被廣泛應(yīng)用，二者在結(jié)構(gòu)和功能上存在差異，對化妝品成分的滲透性表現(xiàn)也存在著差別[5，7，8]。

本研究通過Franz擴(kuò)散池研究RHCⅢ在兩種離體皮膚滲透量的差異，并借助二次諧波（secondharmonicgeneration，SHG）結(jié)合雙光子熒光（two-photonexcitedfluorescence，TPEF）成像技術(shù)直觀呈現(xiàn)RHCⅢ在兩種離體皮膚透皮行為的差異，明確這兩種離體皮膚的滲透性差異，對于化妝品的配方優(yōu)化、安全性評估以及功效預(yù)測有著重要意義。本研究旨在深入探討離體豬皮和離體鼠皮的滲透性差異，為化妝品的透皮性能測試方面提供科學(xué)依據(jù)。

Part1

材料和方法

1.1材料、試劑與儀器

RHCⅢ（分子量55kDa，純度≥95%），江蘇江山聚源生物技術(shù)有限公司；BCA試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；iFluor?405succinimidylester，AATBioquest；透析袋（lt;1kDa），南京森貝伽生物科技有限公司。TK-12D透皮擴(kuò)散儀（藥物透皮試驗儀），上海玉研科學(xué)儀器有限公司；SpectraMaxM2e型多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；LSM880NLO雙光子激光共聚焦顯微鏡，卡爾蔡司光學(xué)有限公司；LeciaCM1950冷凍切片機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2離體皮膚采集

離體豬皮由邳州市東方養(yǎng)殖有限公司提供，取自巴馬香豬（合格編號：202360244），離體鼠皮取自6～8周齡SD大鼠。取皮前清洗全身皮膚，電動脫毛器小心剃去背部皮膚的被毛，切斷巴馬香豬前肢動脈使其缺血致死（大鼠斷頸處死），剝離背部皮膚，把皮膚平鋪在干凈的玻璃板上，讓角質(zhì)層向下，用小刀片沾生理鹽水剔除皮下脂肪、組織和毛細(xì)血管，然后用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈、擦干，用鋁箔紙包裏置于儲存袋中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3重組膠原蛋白皮膚透過量分析

1.3.1受試物制備

取RHCⅢ100mg，溶于10mL生理鹽水中，配制為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%溶液，蛋白質(zhì)溶液的濃度為10mg/mL。

1.3.2皮膚暴露與蛋白含量測定

開啟透皮擴(kuò)散儀，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為300r/min，水浴溫度達(dá)到（32±0.5）℃。接收池加入8mL的生理鹽水，將解凍好的兩種離體皮膚從儲存袋中取出，用生理鹽水洗凈后再用吸水紙將皮膚表面的水分沾干，裁剪為2.5cm×2.5cm的正方形。將豬皮和大鼠皮固定于擴(kuò)散池的供給室與接受池之間，角質(zhì)層朝上，排盡接收池內(nèi)的氣泡，擴(kuò)散池組裝好后平衡20min。兩種離體皮膚均設(shè)置生理鹽水對照組和受試物組（RHCⅢ組），對照組供給池加入1mL生理鹽水，受試物組供給池加入1mLRHCⅢ溶液，每組設(shè)三個平行。將擴(kuò)散池放入水箱上部相應(yīng)槽孔內(nèi)，于第1h、2h、4h、6h、8h、12h從接收池中取樣1mL，將樣液置于試管中，然后向接收池補充1mL生理鹽水。

采用BCA法分析接收液中的蛋白質(zhì)含量。接收液按下列公式計算各時間點的單位面積累積透皮滲透量（Qn，mg/cm2）。式中，Qn為單位面積累積透皮量，Cn為第n次取樣時蛋白質(zhì)濃度，V為接收池體積（8mL），Ci為第i次取樣時蛋白質(zhì)濃度，Vi為第i次取樣時取樣體積，A為有效接觸面積（2.2cm2）。

1.3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Origin21軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用獨立樣本Student'st-test檢驗，plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4重組蛋白熒光成像

1.4.1熒光標(biāo)記

取RHCⅢ100mg溶于10mL1M磷酸鹽緩沖液（pH8.5–9.0）制備RHCⅢ的10mL蛋白標(biāo)記儲備液。向iFluor405（1mg）中加入無水DMSO1mL得到熒光染液。然后，將1mL的熒光染液加入蛋白標(biāo)記儲備液中并充分搖動。將反應(yīng)混合物在4℃下旋轉(zhuǎn)12h。將反應(yīng)混合物裝入透析袋（lt;1kDa）中并在黑暗中置于含有超純水的大燒杯中。每2h更換一次水，直到在超純水中沒有檢測到熒光，透析袋內(nèi)溶液熒光強度不再變化，說明游離的未被標(biāo)記的熒光染料已全部被析出，將反應(yīng)混合物取出得到iFluor-RHCⅢ。

將1mL的熒光染液加入10mL1M磷酸鹽緩沖液（pH8.5–9.0）的小瓶中并充分搖動，作為對照溶液。

1.4.2皮膚暴露

組裝擴(kuò)散池，分別取iFluor-RHCⅢ溶液及iFluor405對照溶液1mL置于供給室上方，用錫箔紙覆蓋供體蓋。將擴(kuò)散池放入水箱上部相應(yīng)槽孔內(nèi)，每組設(shè)三個平行。

加入iFluor-RHCⅢ的時刻為起始時間，12h后，吸出擴(kuò)散池中供給室上殘留的樣品，用生理鹽水清洗皮膚表面3—5次后，將擴(kuò)散池中皮膚取出，立刻進(jìn)行熒光圖像采集與皮膚切片。

1.4.3皮膚組織的SHG-TPEF成像

通過雙光子激光共聚焦顯微鏡從真皮獲得圖像。使用950nm的激發(fā)波長和465—485nm的發(fā)射濾光片來隔離SHG信號，使用405nm的激發(fā)波長和420—450nm的發(fā)射濾光片獲取TPEF信號圖像。將所得圖像進(jìn)行ZEISSZEN3.10圖像渲染處理。

1.4.4皮膚切片的SHG-TPEF成像

通過冷凍切片采集皮膚縱切面，切片厚度10μm。重復(fù)上述掃描過程以觀察兩種iFluor-RHC及iFluor405對照溶液的透皮吸收情況。激光條件設(shè)置與用于上述SHG-TPEF皮膚成像的激光條件設(shè)置一致。

Part2

結(jié)果與討論

2.1重組膠原蛋白皮膚透過量

擴(kuò)散池法測試RHCⅢ在兩種皮膚的經(jīng)皮吸收結(jié)果見表1，結(jié)果顯示在豬皮組、受試物組和對照組接收液中累計蛋白滲透量并無明顯差異（pgt;0.05），表明豬皮組接收池中的蛋白均來自離體皮膚中的蛋白滲透，而非受試物，RHCⅢ并未穿過皮膚進(jìn)入接收池中。而在鼠皮組，受試物組的累計蛋白滲透量顯著高于對照組（plt;0.05），表明RHCⅢ已透過皮膚進(jìn)入接收池中，并且隨著透皮時間的延長，RHCⅢ的透皮量顯著增加（圖1）。

2.2皮膚組織的SHG及雙光子熒光成像

在加入iFluor-RHCⅢ溶液12h后，首先掃描SHG信號確定皮膚真皮層，進(jìn)一步掃描TPEF信號。結(jié)果如圖2所示，紅色為SHG信號即真皮層中的膠原蛋白，藍(lán)色為熒光標(biāo)記的RHCⅢ與iFluor405的TPEF信號。在豬皮真皮層中可檢測到iFluor405的TPEF信號，表明iFluor405滲透角質(zhì)層并到達(dá)真皮層，而未檢測到iFluor-RHCⅢ，表明RHCⅢ未透過皮膚表層進(jìn)入真皮層中。在大鼠皮膚真皮層中均可檢測到iFluor405和iFluor-RHCⅢ，表明iFluor405和iFluor-RHCⅢ均可透過皮膚角質(zhì)層屏障，到達(dá)皮膚真皮層。

2.3皮膚切片的SHG及雙光子熒光成像

為了測試結(jié)果是否存在假陽性，通過皮膚切片進(jìn)行垂直平面觀察。結(jié)果顯示，離體豬皮中iFluor405已進(jìn)入皮膚深層，而iFluor-RHCⅢ僅停留在豬皮表層，未通過皮膚角質(zhì)層。離體鼠皮中iFluor-RHCⅢ和iFluor405均可通過皮膚角質(zhì)層，到達(dá)皮膚真皮層，這與真皮層的SHG-TPEF成像的結(jié)果一致（圖3）。

2.4討論

本研究結(jié)果顯示，離體鼠皮的皮膚滲透性明顯高于離體豬皮，這一結(jié)果與兩種離體皮膚的結(jié)構(gòu)和功能差異密切相關(guān)。

從結(jié)構(gòu)上看，豬皮表皮層厚度為12～15μm，角質(zhì)層神經(jīng)酰胺與膽固醇的比例較高，接近人類皮膚的屏障特性；而大鼠表皮層較薄，角質(zhì)層的神經(jīng)酰胺與膽固醇比例低于豬皮，導(dǎo)致屏障功能較弱[9-11]。在細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）與真皮結(jié)構(gòu)方面，豬皮的ECM成分（如膠原蛋白、糖蛋白）與人類高度相似，膠原纖維排列更均勻有序，真皮層較厚；大鼠皮膚ECM組成與人類差異較大，真皮層較薄[12]。此外，豬皮毛囊形態(tài)和密度與人類相似，大鼠毛囊較小且結(jié)構(gòu)不同并且密度較高，從而為物質(zhì)的滲透提供了更多的通道[11，13]。

在功能方面，雖然兩者都具備皮膚的基本屏障功能，但由于進(jìn)化和生理特性的差異，它們對不同物質(zhì)的親和性和轉(zhuǎn)運能力有所不同。豬皮滲透性特征與人類皮膚接近，尤其對親脂性物質(zhì)的屏障作用更優(yōu)。大鼠皮對親水性藥物滲透性較高，使得離體鼠皮對某些化妝品成分的吸收和擴(kuò)散更為高效，進(jìn)而高估人類皮膚的吸收率[14，15]。

除此之外，蛋白酶活性的差異影響了重組膠原穩(wěn)定性與滲透，豬皮因天然膠原切割位點豐富，易競爭性抑制重組膠原降解穩(wěn)定性；而大鼠高酯酶活性加速載體分解，降低滲透效率。酶分布上，大鼠酯酶集中于表皮易致淺層降解，豬蛋白酶則在真皮層起作用[16，17]；分子層面，豬皮高密度GFOGER位點競爭整合素結(jié)合，HSP47結(jié)合位點N端聚集可能削弱重組膠原局部滯留，共同影響其靶向與降解過程[18，19]。

選用離體豬皮和離體鼠皮代替人體皮膚進(jìn)行研究，具有重要意義。一方面，人體皮膚獲取難度大且涉及倫理問題，而離體豬皮和離體鼠皮來源相對廣泛[8]。另一方面，離體豬皮在組織結(jié)構(gòu)上與人體皮膚高度相似，能較好模擬人體皮膚對化妝品的反應(yīng)；離體鼠皮成本低、易獲取，便于進(jìn)行大規(guī)模的初步篩選實驗[8]。綜上所述，并結(jié)合本研究結(jié)果，可以明確在評價化妝品的透皮吸收性能進(jìn)行離體皮膚測試時更適宜選擇離體豬皮而非離體鼠皮。

Part3

結(jié)論

本研究借助重組人源Ⅲ型膠原蛋白在不同離體皮膚的透皮吸收實驗，成功揭示了不同離體皮膚滲透性的差異。實驗運用Franz擴(kuò)散池和雙光子熒光成像技術(shù)，獲取了較為可靠的數(shù)據(jù)。最終結(jié)果表明，離體鼠皮的皮膚滲透性顯著高于離體豬皮。這一結(jié)論不僅豐富了皮膚滲透領(lǐng)域的理論知識，還為藥物研發(fā)、皮膚護(hù)理、產(chǎn)品的優(yōu)化提供了重要參考，有助于開發(fā)更具針對性、效果更優(yōu)的相關(guān)產(chǎn)品。通過對這兩種常用離體皮膚模型的深入研究，能夠為化妝品的研發(fā)、質(zhì)量控制和安全性評估提供更為可靠的依據(jù)，有利于推動化妝品行業(yè)的科學(xué)發(fā)展。