小麥PHY基因家族鑒定及熱脅迫下表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0864（2025）07-0030-14

Identificationof PHYGene Family in Wheat（TriticumaestivumL.） andTheirExpressionAnalysisUnderHeatStress

HU Yi ^1S ，GONG Jie2， ZHAO Wei2，CHENG Rong2，LIU Zhongyu ^1? GAO Shiqing2*，YANG Yazhen1* （1.CollegeofLifeScience，YangtzeUniversity，HubeiJingzhou4345，China;IstituteofHybridWheat，BeijingAcademyf Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 1Ooo97，China）

Abstract：Phytochrome（PHY）in plants not only receives light signals as a photoreceptor，but also responds to environmental temperature changes as a temperature sensor. To identify PHY genes in wheat， the bioinformatics methods was used，and their physical and chemical properties，phylogenetic evolution，gene structure，protein conserved domain，promoter cis-acting element and gene expression characteristics were comprehensively analyzed.The resultsshowed that 9 TaPHY genes were identified，which randomly distributed on 6 chromosomes of wheat.And the subcellular localization prediction showed that these proteins were located in the nucleus.Phylogenetic analysis showed that these genes were classified into 3 subclasses， the genes of same subclass had high similarity of gene structure and protein conserved domain，which suggested similar function.Cis-element analysis revealed that the promoter of TaPHY genes had a variety of lightand hormone response elements.Inaddition，tissue expressionanalysis identified significant differences in the expression abundance of TaPHY genes.Combined with the screening results of heat tolerant and fluorescencequantitative analysis，the expression levels of TaPHYA1and TaPHYC2 were first down-regulated and then up-regulated under heat stress condition，while other genes showed diferent degres of downregulation，it showed that TaPHY genes inducedby heat stressand participated in theregulationof heat resistance of wheat. Correlation analysis showed that the expression of TaPHYA3 was significantly negatively correlated with H₂O₂ contentin the heat-resistant material 1-2-3，TaPHYC1 was positively correlated with superoxide dismutase （SOD）activity，TaPHYC3 expression was significantly correlated with SOD activity. Above results provided an experimental basis for further understanding the mechanism of TaPHY involved in heat stress response，and also provided important genetic resources for the screening of heat tolerant wheat lines.

Keywords：wheat；PHY gene family；gene identification；heat stress；correlation analysis

光在植物生長發(fā)育與代謝活動(dòng)中起著重要的調(diào)控作用。在漫長的進(jìn)化過程中，植物形成了精密的光受體系統(tǒng)以完成其光形態(tài)建成。目前，植物光受體可分為4類：光敏色素、隱花色素、向光素、UV-B受體。其中，光敏色素存在2種形式：遠(yuǎn)紅吸收型（Pfr）和紅吸收型 （Pr） ，這2種形式可以相互轉(zhuǎn)換，使得植株能夠更好地應(yīng)對(duì)遮蔭和資源競(jìng)爭策略，這一系列變化被稱為SAR（shadeavoidanceresponse）l3]。小麥phyB突變體表現(xiàn)為節(jié)間數(shù)和株高增加的莖尖分生組織（shootapicalmeristem，SAM）特征[4]。PIFs是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，在介導(dǎo)由Pfr/Pr引發(fā)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中具有樞紐作用[5。此外，光敏色素還能通過與下游調(diào)節(jié)因子PIF1和FHY3（far-red elongated hypocotyl3）相互作用，調(diào)節(jié)RVE1（REVEILLE1）和RVE2（REVEILLE2）等下游轉(zhuǎn)錄因子的生物活性，進(jìn)而影響植物體內(nèi)激素水平控制種子萌發(fā)]。PHY結(jié)構(gòu)域的作用是調(diào)節(jié)光敏色素的活性，以及穩(wěn)定具有生物活性形式的Pfr。對(duì)于PHYB來說，羧基端2個(gè)連續(xù)的PAS結(jié)構(gòu)域，是使其在光照條件下從細(xì)胞質(zhì)定位到細(xì)胞核的必要結(jié)構(gòu)，而PHYA則需要借助穿梭蛋白FHY1/FHL進(jìn)入細(xì)胞核；羧基端的另一個(gè)功能是促進(jìn)光敏色素蛋白二聚體的形成。

在擬南芥中，PHYB不僅參與光信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在溫度感知方面也起重要作用。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的應(yīng)用，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了大量參與光介導(dǎo)和植物激素介導(dǎo)通路的熱響應(yīng)基因。在此過程中，植物受體phyB作為分子開關(guān)，在不同光照條件下開啟或關(guān)閉多個(gè)熱應(yīng)激（heatstress，HS）反應(yīng)基因。形態(tài)學(xué)研究表明，phyB能夠增強(qiáng)植物的熱耐受性，在植物的溫度感知和響應(yīng)中起重要作用。擬南芥 phyB 突變體在紅光和白光條件下都表現(xiàn)出不同程度的抗凍性[]。通過追蹤phyB核小體的形成，驗(yàn)證了光敏色素對(duì)光和溫度刺激都有反應(yīng)；通過敲除光敏色素的功能，植物HS反應(yīng)可以在轉(zhuǎn)錄和形態(tài)水平上發(fā)生改變[2]。在作物中光敏色素對(duì)抗逆性也有影響；水稻phyB突變體在低溫和干旱條件下具有更好的耐受性，棉花PHYB過表達(dá)植株對(duì)干旱脅迫的耐受性更強(qiáng)[13]。

綜上所述，光敏色素不僅能夠調(diào)節(jié)作物的生育周期，提高作物抗逆性，還影響作物產(chǎn)量。光敏色素參與植物生長各個(gè)環(huán)節(jié)，并通過修飾植物的光敏色素信號(hào)途徑來改變其生理特性，從而定向調(diào)控植物的生長發(fā)育，以滿足人們的生產(chǎn)需求。迄今為止，在雙子葉模式植物擬南芥中對(duì)光敏色素進(jìn)行了較為深入的研究，但在單子葉植物方面鮮有報(bào)道。禾本科植物中只存在 PHYA，PHYB 和PHYC這3個(gè)亞家族的光敏色素基因[14。小麥作為我國最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量直接關(guān)系到國家糧食安全問題。然而，在熱脅迫條件下TaPHY基因的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)小麥中TaPHY基因及其在熱脅迫條件下的表達(dá)模式進(jìn)行鑒定和分析，為進(jìn)一步揭示光敏色素在小麥耐熱性中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1小麥TaPHY基因鑒定

從Ensembl Plants （https：//plants.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫中獲取擬南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（OryzasativaL.）、高梁（SorghumbicolorL.）、谷子（SetariaitalicaL.）、玉米（ZeamaysL.）和狗尾草（SetariaviridisL.）PHY氨基酸序列及小麥全基因組編碼序列（coding sequence，

CDS）和氨基酸序列，利用HMMER軟件構(gòu)建隱馬爾可夫模型，使用SMART（http：//smart.emblheidelberg）、Pfma（https：//pfam.xfam.org/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

1.2小麥TaPHY基因理化性質(zhì)分析

從EnsemblPlants網(wǎng)站獲取相關(guān)基因ID、物理位置、基因序列、氨基酸序列以及CDS信息。通過在線程序 Expasy（http：//web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)TaPHY蛋白的等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI）、分子量（molecularweight，MW）不穩(wěn)定系數(shù)（instability index，II）以及總平均親水 性（grand average of hydropathicity，GRAVY）等信息。使用Euk-mPLoc2.0server（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用ProtScale網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protscale/）分析TaPHY蛋白的親水性和疏水性。

1.3小麥TaPHY蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用在線網(wǎng)站 SOMPA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page L= npsa_sopma.html）和Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）通過TaPHY基因的氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.4小麥TaPHY基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用EnsemblPlants網(wǎng)站搜索候選基因的同源序列，然后用Pfam網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/）對(duì)同源基因的編碼序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，保留包含PHY、PAS結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。用MEGA11.0的ClustalW程序?qū)π←淭aPHY與擬南芥AtPHYA＼～AtPHYE、水稻OsPHYA＼～OsPHYAC、玉米ZmPHYA1＼～ZmPHYC2、谷子SiPHY1＼～SiPHY4、高粱SbPHYA＼～SbPHYC、狗尾草SvPHYA＼～SvPHYC共7個(gè)物種的全長氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，用最大似然法（maximumlikelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Jones Taylor Thornton模型，Bootstrap值設(shè)為 1000 用Evolview2.0網(wǎng)站（http：//www.omicsclass.com/article/671）進(jìn)行可視化。

1.5小麥TaPHY基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析

使用在線網(wǎng)站MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）預(yù)測(cè)小麥TaPHY蛋白的保守基序（motif），數(shù)目設(shè)置為8，然后利用TBtools繪制小麥TaPHY基因的結(jié)構(gòu)和保守基序圖。

1.6小麥TaPHY基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

從EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫中獲取小麥TaPHY基因起始密碼子上游 2 000bp 序列，使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)順式作用元件，利用TBtools軟件中GeneStructureView程序進(jìn)行可視化。

1.7小麥TaPHY基因組織表達(dá)和非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

查找并下 載WheatOmics1.0 （http：//wheatomics.sdau.edu.cn/）和 Wheat ExpressionBrowser（wheat-expression.com）小麥表達(dá)數(shù)據(jù)庫中中國春TaPHY基因在不同組織、不同發(fā)育時(shí)期及各種非生物脅迫處理后的表達(dá)量數(shù)據(jù)，分析它們的表達(dá)，使用TBtools軟件中的HeatMap程序繪制表達(dá)模式熱圖。

1.8TaPHY基因在不同耐熱性材料中的表達(dá)量測(cè)定

1.8.1材料的耐熱性鑒定選用創(chuàng)制的40個(gè)高代重組自交系材料，在溫室通過耐熱篩盒試驗(yàn)對(duì)其耐熱性進(jìn)行鑒定。將大小均一、成熟且飽滿的小麥種子播種在等量土壤、大小相同的塑料盆中，設(shè)對(duì)照組和處理組。待小麥生長至2葉1心時(shí)，對(duì)照處理（CK）在 正常培養(yǎng)，熱脅迫處理（HT）在 42^°C 培養(yǎng)，記錄熱脅迫后的存活率。分別在處理0、1、5、10和 20h 共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取幼苗葉片，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，用于測(cè)定葉片的過氧化氫 （H₂0₂） 含量和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性。 H₂O₂ 含量和SOD活性生理指標(biāo)測(cè)定方法見參考文獻(xiàn)[15]。

1.8.2TaPHY基因在不同耐熱性材料中的表達(dá)模式分析采用RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取耐熱材料1-2-3和不耐熱材料1-3-4熱脅迫處理（HT）和對(duì)照處理（CK）小麥幼苗的總RNA。然后使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為20.0μL ，包括 Hieff UNICON@Universal BlueqPCRSYBRGreenMasterMix[翌圣生物科技（上海）股份有限公司] 10.0μL 上下游引物0 10.0μmol?L^-1） 各 0.4μL， cDNA模板 2.0μL （ 100.0ng） ， ddH₂O7.2μL 。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95^°C 預(yù)變性 3min 95^°C 變性 3s，60^°C 退火

20s，40個(gè)循環(huán)后增加熔解曲線環(huán)節(jié)， 95^°C 變性5s， 60°C 退火 30s，95^°C 變性 15s ，擴(kuò)增曲線和熔解曲線鑒定引物特異性。內(nèi)參為18SrRNA基因，利用公式 2^-ΔΔCT[16] 計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。PCR引物如表1所示。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2010和SPSS16.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1TaPHY基因家族鑒定及序列分析

從EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫中共鑒定出9個(gè)小麥TaPHY基因，基因長度 3355～4630bp ，氨基酸數(shù)量885＼～1166，相對(duì)分子量97690.63＼～128636.61Da，等電點(diǎn)5.51＼～5.79；不穩(wěn)定指數(shù)48.81＼～52.47，即均為不穩(wěn)定蛋白；蛋白中的親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，為親水蛋白，GRAVY均為負(fù)數(shù)，表明均屬于酸性親水性蛋白；亞細(xì)胞定位表明，TaPHY蛋白均存在于細(xì)胞核中；9個(gè)TaPHY分布在小麥6條染色體上，其中，4A、4B和4D染色體上均含有2個(gè)，其他3條染色體上各有1個(gè)（表2）。

進(jìn)一步分析TaPHY蛋白的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，9個(gè)TaPHY蛋白中共存在7種結(jié)構(gòu)域（圖1），分別為GAF、PAS_2、PHY、PAS、PAC、HisKA 和HATPase_c，其中，9個(gè)TaPHY蛋白中均含有GAF、PAS_2、PHY和2個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域。TaPHYA1、TaPHYA2和TaPHYA3屬于PHYA亞族，但TaPHYA3的C端多了1個(gè)PAC結(jié)構(gòu)域;TaPHYB1、TaPHYB2、TaPHYB3屬于PHYB亞族，這3個(gè)成員均比較保守。TaPHYC1、TaPHYC2、TaPHYC3屬于PHYC亞族，其N端比較保守，在C端TaPHYC2較TaPHYC1、TaPHYC3缺少HATPase_c結(jié)構(gòu)域。

2.2TaPHY蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將小麥TaPHY蛋白與擬南芥、水稻、玉米、谷子、高粱、狗尾草以及小麥中的類PHY蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖2）顯示，9個(gè)TaPHY蛋白分別屬于PHYA、PHYB和PHYC3個(gè)亞家族，其中，TaPHYA1、TaPHYA2和TaPHYA3屬于PHYA亞家族，TaPHYB1、TaPHYB2和TaPHYB3屬于PHYB亞家族，TaPHYC1、TaPHYC2和TaPHYC3屬于PHYC亞家族。PHYA和PHYC各為1支;PHYB與PHYD、PHYE聚為1支。TaPHYB1、TaPHYB2、TaPHYB3與OsPHYB聚在同一分支上，表明它們可能具有相似的功能。與擬南芥相比，小麥TaPHY蛋白與谷子、狗尾草、高粱、玉米、水稻的PHY蛋白親緣關(guān)系較近，因?yàn)樾←?、谷子、狗尾草、水稻、高梁、玉米同屬于單子葉禾本科植物，而擬南芥屬于雙子葉植物，推測(cè)植物在進(jìn)化過程中PHY基因發(fā)生了生物學(xué)功能分化。

2.3 小麥TaPHY蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

進(jìn)一步對(duì)TaPHY蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果（表3）表明，9個(gè)TaPHY蛋白均由 ∝ 螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)組成，其中 ∝ 螺旋和無規(guī)則卷曲的占比較高，延伸鏈次之，β-轉(zhuǎn)角最少；且不同TaPHY蛋白間各類占比相似。對(duì)

TaPHY蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖3）表明，TaPHYC1、TaPHYC2和TaPHYC3的三級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似;TaPHYA3、TaPHYB2和TaPHYB3的三級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似；TaPHYA1和TaPHYB1的三級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似；TaPHYA2的三級(jí)結(jié)構(gòu)與其他TaPHY蛋白的結(jié)構(gòu)差異較大。

2.4TaPHY基因的結(jié)構(gòu)特性分析

對(duì)小麥TaPHY基因的保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）表明，TaPHY基因的外顯子數(shù)量在2＼～5個(gè)，其中，TaPHYA2含有2個(gè)外顯子；TaPHYA1、TaPHYB1、TaPHYB2和TaPHYB3基因含有4個(gè)外顯子；TaPHYA3、TaPHYC1、TaPHYC2和TaPHYC3基因含有5個(gè)外顯子。除TaPHYA3和TaPHYC2外，其他TaPHY基因都含有3'UTR和5'UTR。TaPHYA2、TaPHYB1、TaPHYB2和TaPHYB3中均存在一段較長的內(nèi)含子區(qū)域。對(duì)小麥TaPHY的保守基序進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，共鑒定了8個(gè)含有50個(gè)氨基酸殘基的motif，9個(gè)TaPHY均包含這8個(gè)motif，且motif的排順相同、位置相近，這表明小麥TaPHY基因的保守性較高。

2.5 TaPHY基因順式作用元件

對(duì)9個(gè)TaPHY基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件進(jìn)行分析，共篩選鑒定到12種順式作用元件，主要與光響應(yīng)、激素響應(yīng)和植物發(fā)育有關(guān)（圖5）。其中，光響應(yīng)元件有40個(gè)，在9個(gè)TaPHY基因啟動(dòng)子中均有分布；光反應(yīng)相關(guān)元件有33個(gè)，除TaPHYA2外均有分布；激素響應(yīng)相關(guān)元件有80個(gè)，包括脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯、生長素和赤霉素等激素響應(yīng)元件。植物發(fā)育相關(guān)元件有13個(gè)，包括種子特異性調(diào)控、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)以及晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等作用元件。9個(gè)TaPHY基因中，TaPHYB2基因含有6種響應(yīng)元件，TaPHYA2基因含有3種響應(yīng)元件，推測(cè)TaPHYB2基因在小麥生長發(fā)育過程中可能起重要作用。

2.6基于網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫的TaPHY表達(dá)分析

利用WheatOmics1.0網(wǎng)站的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，繪制9個(gè)TaPHY基因的組織表達(dá)熱圖，結(jié)果（圖6A＼～C）顯示，不同TaPHY基因的表達(dá)量存在顯著差異，且同一TaPHY基因在不同組織、不同時(shí)期的表達(dá)量也存在差異。利用WheatExpression

Browser數(shù)據(jù)庫繪制9個(gè)TaPHY基因在3個(gè)發(fā)育時(shí)期、不同器官的表達(dá)熱圖，結(jié)果（圖6D＼～F）顯示，9個(gè)TaPHY基因在幼苗期、營養(yǎng)生長期和生殖生長期的表達(dá)量存在差異，總體來看，3個(gè)亞族表現(xiàn)為TaPHYCgt;TaPHYBgt;TaPHYA。在干旱、冷和鹽等非生物脅迫條件下，不同TaPHY基因的表達(dá)量存在明顯差異。TaPHYB和TaPHYC對(duì)溫度變化更加敏感，在熱脅迫1和6h，3個(gè)TaPHYC基因的表達(dá)量較其他基因的表達(dá)量更高，其中TaPHYC1的表達(dá)量最高，而3個(gè)TaPHYB基因在熱脅迫1h的表達(dá)量明顯降低，在脅迫6h時(shí)得到了部分恢復(fù)，推測(cè)小麥在遭遇熱脅迫時(shí)，TaPHYB和TaPHYC基因可能發(fā)揮重要作用。

2.7 耐熱材料的篩選

從40份高代材料中篩選得到耐熱材料1-2-3和不耐熱材料1-3-4（圖7）。在熱脅迫 20h ，1-2-3的存活率仍高達(dá) 90% ，而1-3-4的存活率僅11.11% 。進(jìn)一步對(duì)這2份材料的 H₂O₂ 含量和SOD活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，熱脅迫處理后2份材料的 H₂O₂ 含量均顯著或極顯著高于CK；隨著熱脅迫時(shí)間的延長，1-2-3的 H₂O₂ 含量增速較緩，而1-3-4的 H₂O₂ 含量快速升高；2份材料均在熱脅迫5h 時(shí)， H₂O₂ 含量最高，隨后逐步降低，在熱脅迫20h 時(shí)，1-2-3的 H₂O₂ 含量低于1-3-4。在熱脅迫1h，1-2-3的SOD活性顯著降低，而1-3-4與初始值差異不顯著；熱脅迫處理 5h 后，2份材料的SOD活性均趨于穩(wěn)定，但1-2-3的SOD活性（1602.07U?g^-1） 高于 1-3-4（1510.05U?g^-1） 。綜上所述，基于存活率和生理指標(biāo)，1-2-3較1-3-4耐熱性更強(qiáng)。

2.8熱脅迫下TaPHY基因表達(dá)分析

進(jìn)一步分析TaPHY基因在耐熱材料1-2-3和不耐熱材料1-3-4中的表達(dá)模式，結(jié)果如圖8所示。在耐熱材料1-2-3中，在正常條件下，TaPHYA2基因隨時(shí)間的變化表達(dá)量上調(diào)，且在20h 時(shí)的表達(dá)量為 ^0h 的1.7倍，而TaPHYA1、TaPHYA3、TaPHYB1、TaPHYB2、TaPHYB3和TaPHYC3基因隨時(shí)間的變化表達(dá)量總體呈下調(diào)趨勢(shì)，TaPHYC1在1和5h時(shí)的表達(dá)量顯著低于初始值，在10和 20h 時(shí)的表達(dá)量與初始差異不顯著，TaPHYC2基因在 ^10h 的表達(dá)量與初始差異不顯著，在其他時(shí)間的表達(dá)量顯著低于初始值；在熱脅迫下，TaPHYA2基因的表達(dá)量變化較小，而TaPHYA1、TaPHYA3和TaPHYC2基因均下調(diào)表達(dá)，但在 20h 的表達(dá)量顯著提高，與初始值差異不顯著。在不耐熱材料1-3-4中，TaPHYA2在熱處理1h時(shí)的表達(dá)量是 ^0h 的3倍，而其他基因均呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。

2.9 H₂O₂ 含量、SOD活性與TaPHYs基因表達(dá)的相關(guān)性分析

由圖9可知，TaPHYA3在熱處理1-2-3中的表達(dá)量與 H₂O₂ 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)該基因可能參與 H₂O₂ 代謝過程；TaPHYC3在熱脅迫下的表達(dá)量與SOD活性呈顯著正相關(guān)；TaPHYC1在熱處理1-2-3和1-3-4中的表達(dá)與S0D活性呈顯著或極顯著正相關(guān)。由此可見，無論是在耐熱材料1-2-3還是在不耐熱材料1-3-4中，TaPHYC1與SOD活性均表現(xiàn)出顯著正相關(guān)性，這可能與TaPHYC1基因參與調(diào)節(jié)SOD活性有關(guān)。

3討論

光敏色素由多基因編碼，且其編碼基因?qū)儆谛』蚣易?，不同植物體內(nèi)的家族成員數(shù)量和拷貝數(shù)不同。擬南芥存在PHYA、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE共5種光敏色素，而在禾本科植物水稻、玉米和小麥中只存在PHYA、PHYB和PHYC共3種光敏色素，但它們的拷貝數(shù)存在差異，水稻中是單拷貝，玉米中為雙拷貝，小麥中為3個(gè)拷貝。擬南芥PHYD蛋白亞族的結(jié)構(gòu)與PHYB蛋白亞族相近，且二者均可響應(yīng)避光調(diào)節(jié)，表明植物中天然存在PHYD-1突變現(xiàn)象[18]。在不同光下，PHYD基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)較穩(wěn)定，但其對(duì)擬南芥幼苗光形態(tài)建成的調(diào)控作用較微弱。研究表明，在自然條件下，許多植物的PHYD基因可能為非必需基因[19]。本研究通過生物信息學(xué)的方法從小麥中共鑒定出9個(gè)TaPHY基因，分布在4A（2個(gè)）4B（2個(gè)）4D（2個(gè)）和5A（1個(gè)）5B（1個(gè)）5D（1個(gè)）染色體上?；蚓幋a的結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能單元，參與植物基因轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程，而光對(duì)植物的生長發(fā)育及化學(xué)成分調(diào)節(jié)是通過特異基因的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TaPHYA1、TaPHYA2、TaPHYA3、TaPHYB1、TaPHYB2、TaPHYB3、TaPHYC1、TaPHYC2和TaPHYC3的N端均具有光敏色素典型的PAS和GAF結(jié)構(gòu)域，除TaPHYA2和TaPHYC2外C端均具有HisKA和HATPase_c結(jié)構(gòu)域。3個(gè)TaPHYA由于存在結(jié)構(gòu)域差異，可能導(dǎo)致基因表達(dá)模式不同。TaPHYC1、TaPHYC2、TaPHYC3的N端結(jié)構(gòu)域高度相似，但在C端上TaPHYC2缺少了1個(gè)HATPase_c結(jié)構(gòu)域?？傮w上，小麥、擬南芥、水稻PHY蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，表明光敏色素在進(jìn)化過程中具有保守性。光敏色素蛋白是植物自身合成的水溶性蛋白，在植物體內(nèi)通常以二聚體活性形式存在和發(fā)揮功能。每個(gè)光敏色素單體分為2個(gè)結(jié)構(gòu)域，N端和C端結(jié)構(gòu)域，其中N端的光感受結(jié)構(gòu)域可共價(jià)結(jié)合生色團(tuán)，與光敏色素的光化學(xué)特性相關(guān)；而C端的光調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域主要參與光敏色素二聚體的形成及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程2]。在擬南芥中，PHYC蛋白需要借助PHYB蛋白維持自身穩(wěn)定，PHYC蛋白只能與家族內(nèi)的其他光敏色素形成異源二聚體發(fā)揮功能[22]。在小麥中，PHYC蛋白不僅能形成同源二聚體發(fā)揮功能，在長日照及黑暗條件下PHYC的表達(dá)量高于PHYB[23]。小麥PHYB和PHYC均能促進(jìn)開花，缺失突變體均表現(xiàn)出不同程度的晚花表型，但在擬南芥中PHYB及PHYC均抑制開花[24]。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中光敏色素介導(dǎo)的光信號(hào)與脫落酸代謝途徑相互作用，光敏色素作用因子PIFs參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[25]。本研究對(duì)小麥TaPHY基因啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析，共鑒定出17類順式作用元件，其中，光響應(yīng)元件和激素類響應(yīng)元件數(shù)量最多，推測(cè)小麥TaPHY基因可能受光和激素的調(diào)節(jié)。

光敏色素B不僅起著光受體的作用，還起著溫度受體的作用。遠(yuǎn)紅光和適度高溫會(huì)使光敏色素B失活2，而擬南芥PhyB突變體的耐熱性增強(qiáng)[3]，這表明PHYB基因在植物適應(yīng)高溫環(huán)境過程中起重要作用。光敏色素是一種由多基因編碼的光溫二受體，植物對(duì)光照和溫度的響應(yīng)存在耦聯(lián)關(guān)系，光信號(hào)和溫度信號(hào)通路間的復(fù)雜串?dāng)_是植物在自然環(huán)境中生長和發(fā)育的基礎(chǔ)；植物PHY基因作為重要的光信號(hào)受體蛋白編碼基因，對(duì)于植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、次生代謝及抗逆性起重要作用。PHYB蛋白不僅作為光受體感受光信號(hào)，還作為傳感器感知外界溫度的變化[]。高溫下PHYB促進(jìn)PIF4蛋白的積累，從而調(diào)控與熱響應(yīng)有關(guān)基因的表達(dá)[2；在高溫和高紅光或遠(yuǎn)紅光時(shí)，PIF4和PIF7上調(diào)表達(dá)，但它們都受cryl和PHYB的抑制28]。本研究對(duì)TaPHY熱脅迫侯選基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)TaPHYs基因均受熱脅迫誘導(dǎo)，在2個(gè)不同耐性材料中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。在耐熱材料1-2-3中，TaPHYA1和TaPHYC2在熱脅迫后呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的表達(dá)模式；在不耐熱材料1-3-4中，TaPHYA2、TaPHYB2和TaPHYAC2受熱脅迫后均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；但TaPHYC2受熱脅迫后在耐熱和不耐熱材料中表達(dá)量均上調(diào)。結(jié)合WheatOmics 1.O 網(wǎng)站和WheatExpression Browser數(shù)據(jù)庫中熱脅迫下的表達(dá)數(shù)據(jù)，9個(gè)TaPHYs基因在熱脅迫短期內(nèi)，表達(dá)量均呈現(xiàn)下調(diào)，推測(cè)這可能是由于在不同材料中不同基因受熱脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)程度不同。

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