大豆 ADF 基因家族的全基因組鑒定及生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S565.1：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2025）06-0015-13

AbstractActin depolymerizing factor （ADF）plays a critical role in plant growth，development and stress responses. However， systematic studies on ADF genes in soybean remain limited. In this study，we conducted genome-wide identification of the soybean ADF gene family using bioinformatics tools such as HMMER3.0，MCScanX and MEGA 11，and analyzed their physicochemical properties， gene structures，conserved motifs，chromosomal distribution，evolutionary relationships，and expresion patterns.The results indicated that a total of 18ADF genes were identified in the soybean genome，named GmADF1 to GmADF18. The encoded protein sequences ranged from 117 to 169 amino acids （aa） in length with molecular weight between 13.80 and 19.49kDa and theoretical isoelectric points （pI） spanning from 5.13 to 7.93.All the proteins were hydrophilic proteins and were localized in cytoplasm，exhibiting highly conserved motifs.The genes contained 2 or 3 exons. Chromosomal mapping revealed that these 18ADF genes were distributed across 13 chromosomes with the most （3 genes）located on chromosome 10. Collinearity analysis identified 25 pairs of paralogous ADF genes，whose evolution was primarily driven by purifying selection. Phylogenetic analysis classified the soybean ADF proteins into five subfamilies，and the closest evolutionary relationship was observed between soybean and wild soybean.Promoter analysis uncovered abundant stress-responsive cis-elements and hormone-responsive cis-elements，suggesting their potential involvement in diverse stressresponses.Protein interaction networks indicated that soybean ADF proteins interacted with actin and POZ domain-containing proteins，potentially participating in cytoskeletal dynamics regulation.Tissue-specific expression profiles highlighted high expression of certain genes in organs such as flowers，roots and seeds. Stress expression analysis showed that the expression of GmADF8，GmADF14 and GmADF16 were significantly up-regulated under salt，drought and flooding stresses，while that of GmADF5 was inhibited under low temperature stress.The qRT-PCR analysis further validated the expression patterns of soybean ADF genes under salt and drought stresses， revealing that GmADF2 exhibited up-regulated expression in response to early salt stress，while both GmADF2 and GmADF^′8 showed upregulated expression in response to early drought stressThe results of this study could provide a crucial theoretical foundation for exploring the functional mechanisms of soybean ADF genes in abiotic stress responses.

KeywordsSoybean; ADF gene family; Genome-wide identification; Bioinformatics analysis; Gene expression； Stress response

植物肌動(dòng)蛋白解聚因子（actindepolymerizingfactor，ADF）包含一個(gè)由約150個(gè)氨基酸組成的ADF-H結(jié)構(gòu)域[1]。ADF蛋白與肌動(dòng)蛋白F-actin和G-actin結(jié)合參與細(xì)胞骨架的重塑過程2」，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)[]。目前，已有在多種植物基因組中鑒定到ADF基因家族的報(bào)道，但物種間的ADF基因數(shù)量、功能特征及表達(dá)模式有所不同。例如，擬南芥、水稻和番茄基因組中均具有11個(gè)ADF基因[4-6]，而玉米、小麥和棉花分別有13、25個(gè)和37個(gè)ADF基因[7-9]。擬南芥I亞類肌動(dòng)蛋白解聚因子AtADF1與G-actin和F-actin結(jié)合在擬南芥肌動(dòng)蛋白聚合物的解聚過程中起至關(guān)重要的作用[4]。ZmADF1/2/7/12/13在玉米雄穗、花粉和花藥中特異性表達(dá)，其中ZmADF1/2在花粉肌動(dòng)蛋白重組中起作用[8]，ZmADF1基因負(fù)調(diào)控花粉數(shù)量、活力、萌發(fā)率和結(jié)實(shí)率[10]。AtADF7和 At-ADF10在擬南芥促進(jìn)花粉肌動(dòng)蛋白周轉(zhuǎn)方面發(fā)揮非等效作用[11-12]。OsADFs作為OsTDRs的直接靶標(biāo)基因之一，在水稻絨氈層細(xì)胞發(fā)育和花粉形成中發(fā)揮重要作用[13]

部分ADF基因參與生物脅迫的功能已被闡明。例如，下調(diào)擬南芥AtADF2的表達(dá)增加了肌動(dòng)蛋白絲的捆綁，導(dǎo)致巨細(xì)胞發(fā)育延遲和線蟲繁殖減少[14]。AtADF3正向調(diào)控PAD4表達(dá)增強(qiáng)能提高擬南芥對(duì)綠色桃蚜侵害的耐受性[15]。擬南芥AtADF4/AtADF6和大麥HuADF3對(duì)其白粉病抗性具有負(fù)調(diào)控作用[16-18]。沉默GhADF6介導(dǎo)棉花根表皮細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的重組，使微絲豐度增加，從而提高植株對(duì)大麗輪枝菌的抗性[9]GmADF2負(fù)調(diào)控大豆對(duì)花葉病毒的抗性[19]。Ta-ADF3負(fù)調(diào)控小麥對(duì)條銹病的抗性[20]，而TaADF4和 TaADF7正調(diào)控其條銹病抗性[21-22] 。

此外，植物ADF基因廣泛參與響應(yīng)多種非生物脅迫。擬南芥AtADF1的表達(dá)受高溫抑制，At-ADF1突變體幼苗比野生型表現(xiàn)出更強(qiáng)的肌動(dòng)蛋白絲穩(wěn)定性和更快的生長(zhǎng)速度[23]。大白菜BrADF1是與AtADF1高度同源的基因，以類似 At. ADF1的方式調(diào)節(jié)F-actin動(dòng)態(tài)，提高植物對(duì)熱脅迫的耐受性[24]。擬南芥AtADF5作為AtCBFs的下游靶基因正向調(diào)控低溫脅迫[25]。異源過表達(dá)小麥TaADF16可以誘導(dǎo)擬南芥耐低溫相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐寒性[7]。擬南芥AtADF1通過促進(jìn)肌動(dòng)蛋白解聚正調(diào)控植物的耐鹽性[26]。互花米草 SaADF2 比水稻OsADF2具有更強(qiáng)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合親和力，SaADF2過表達(dá)時(shí)水稻具有更強(qiáng)的耐旱性和耐鹽性[27]。褪黑素介導(dǎo)CcARP1通過磷酸化CcADF9改變F-actin的動(dòng)力學(xué)，促進(jìn)木豆根的生長(zhǎng)并增強(qiáng)耐鹽性[28]AtADF7-VLN1途徑是滲透脅迫下根毛形成所必需的，對(duì)提高植物的滲透脅迫耐受性具有重要作用[29]。擬南芥AtADF5通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)響應(yīng)ABA和干旱脅迫，促進(jìn)擬南芥葉片氣孔關(guān)閉[30]。異源過表達(dá)OsADF3增強(qiáng)了擬南芥耐旱性[31]。GhADF1表達(dá)下調(diào)提高了棉花的耐旱性并增加了纖維產(chǎn)量[32]。在擬南芥和玉米中過表達(dá)ZmADF5基因都可以降低氣孔開度和失水率，提高活性氧的清除能力，有助于植物在水分虧缺脅迫后保持較高的存活率[33]

綜上，盡管已有多種植物ADF基因響應(yīng)生物和非生物脅迫的報(bào)道，但大豆ADF基因尚無系統(tǒng)鑒定報(bào)道，表達(dá)特性知之甚少，對(duì)大豆ADF基因家族進(jìn)行系統(tǒng)鑒定及表達(dá)模式分析將有助于深入研究其在生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)中的功能。因此，本研究從全基因組水平對(duì)大豆ADF基因家族進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析，以期為深入研究大豆ADF基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.1 大豆ADF基因家族成員的鑒定

大豆及野生大豆基因組數(shù)據(jù)下載于數(shù)據(jù)庫SoyBase（https：//www.soybase.org/），版本號(hào)分別為 Wm82.a2.v1 和Gsoja_W05.v1。擬南芥、玉米、水稻和小麥基因組數(shù)據(jù)下載于數(shù)據(jù)庫EnsemblePlant（http：//plants.ensembl.org/index.html）。利用在線網(wǎng)站 Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫下載ADF蛋白的隱馬爾科夫模型序列（PF00241），利用HMMER3.0程序檢索大豆ADF蛋白。通過在線網(wǎng)站 NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/） 和 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）鑒定候選大豆ADF蛋白結(jié)構(gòu)域。利用在線網(wǎng)站ExPASy（https：//www.ex-pasy.org/）分析大豆ADF蛋白的分子量、等電點(diǎn)和總平均疏水指數(shù)。利用在線網(wǎng)站Cell-PLoc2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/ ）預(yù)測(cè)大豆ADF蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2大豆ADF基因染色體定位和復(fù)制事件

基于大豆ADF基因的基因組注釋信息，利用TBtools[34]軟件包 Gene Location Visualize 程序繪制染色體定位圖。利用 MCScanX^[35] 軟件包分析大豆ADF基因以及與其他物種間的共線性。利用KaKs_Calculator 3.0^[36] 軟件計(jì)算大豆ADF同源基因?qū)Φ?Ka/Ks 值。

1.3 大豆ADF基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

根據(jù)大豆、野生大豆、擬南芥、水稻、小麥及玉米的ADF家族蛋白序列信息，利用MEGA11[37]軟件采用鄰接法（neighbor-joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)置為1O00 次。利用在線網(wǎng)站 Evolview（http：//www.evolgenius.info/evol-view）對(duì)構(gòu)建后的進(jìn)化樹進(jìn)行美化和分類等。

1.4 大豆ADF基因結(jié)構(gòu)、保守基序和啟動(dòng)子元件分析

利用大豆基因組注釋文件，通過在線網(wǎng)站GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）構(gòu) 建大豆ADF基因結(jié)構(gòu)圖。利用在線網(wǎng)站MEMESuite5.4.1 （https：//meme-suite. org/meme/doc/meme-format.html？ man_type τ=τ web）分析大豆ADF蛋白保守基序。提取大豆ADF基因家族成員的啟動(dòng)子序列，利用在線網(wǎng)站PlantCARE（http：//bioin-formatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析其啟動(dòng)子元件。

1.5 大豆ADF家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用在線網(wǎng)站 STRING11.5（https：//cn.string-db.org/）構(gòu)建大豆ADF蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)

1.6 大豆ADF基因表達(dá)模式分析

通過Soybean Expression Atlas（http：//www.ve-nanciogroup.uenf.br/cgi-bin/gmax_atlas/index.cgi）數(shù)據(jù)庫獲取大豆ADF基因的組織表達(dá)數(shù)據(jù)。通過數(shù)據(jù) 庫 PlantExp （https：//biotec.njau. edu. cn/plant-Exp/）獲取大豆ADF基因在鹽（PRJNA432861）、低溫（PRJNA482945）、干旱和淹水（PRJNA574626）脅迫處理下的表達(dá)數(shù)據(jù)。利用 TBtools[34]軟件包中的HeatMap程序繪制基因表達(dá)熱圖。

1.7 大豆幼苗的鹽脅迫和干旱脅迫處理

本研究所用大豆品種為Williams82，種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。首先將大豆種子浸泡于 1% 次氯酸鈉溶液中消毒 10min ，隨后用去離子水沖洗，去除殘留溶液，然后將滅菌后的種子置于濕潤(rùn)濾紙上 25^°C 黑暗培養(yǎng) 3d ；選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的幼苗，轉(zhuǎn)至 1/2 改良型霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中，在 光照 ^′8h 黑暗條件下進(jìn)行水培；當(dāng)植株生長(zhǎng)至第一片三出復(fù)葉完全展開時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至含150 mmol/L NaCl或 20% PEG6000的1/2改良型霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行鹽脅迫或干旱脅迫處理，分別在處理0、1、3、6、12、24h 采集根組織，每個(gè)樣品為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的混合樣；采集后的樣品立即用液氮速凍，隨后轉(zhuǎn)移至 -80°C 冰箱保存，用于RNA提取

1.8 大豆ADF基因qRT-PCR表達(dá)分析

使用Invitrogen公司TRIZOL試劑提取大豆根 RNA，使用日本 TaKaRa 公司PrimeScriptTM RT試劑盒合成 。通過PrimerPremier5軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物。采用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)定量分析基因表達(dá)水平。反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10μL ，正、反向引物各 1μL ，cD-NA模板 1.5μL ， ddH₂O 補(bǔ)至 20μL 。反應(yīng)程序：95U5Hmin;95U15s，60U15s，72U1min，30 個(gè)循環(huán)。以大豆GmActin作為內(nèi)參基因，使用

2^-ΔΔCt 法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。所用引物序列詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1大豆ADF基因鑒定及編碼蛋白理化性質(zhì)分析

由表2可知，從大豆基因組中共鑒定出18個(gè)ADF 基因（GmADF1—GmADF18），其編碼蛋白序列長(zhǎng)度介于 117～169 aa，其中GmADF5蛋白序列最短，GmADF3蛋白序列最長(zhǎng)。大豆ADF蛋白分子量介于 13.80～19.49kDa ，理論等電點(diǎn)變化范圍為 5.13～7.93 ，總平均疏水指數(shù)均小于零，均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，這18個(gè)大豆ADF蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)

2.2 大豆ADF基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序

由圖1A可見，大豆ADF基因外顯子數(shù)為2個(gè)或3個(gè)，其中GmADF5、GmADF6、GmADF8和GmADF12均具有2個(gè)外顯子，且最后1個(gè)外顯子長(zhǎng)度均為 151bp ，外顯子相位均為0、1的特征；其余14個(gè)GmADFs基因均具有3個(gè)外顯子，均呈現(xiàn)出第1個(gè)外顯子序列長(zhǎng)度極短，分別是3bp（7個(gè)） ?21bp （2個(gè)） 、24bp （2個(gè)） ，30bp （2個(gè)）和99bp（1個(gè)），第2個(gè)外顯子序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)，為 260bp （7個(gè)）或 266bp （7個(gè)），第3個(gè)外顯子序列長(zhǎng)度較短，長(zhǎng)度均為151bp（14個(gè)），外顯子相位均為0.0、1的特征。

由圖1B可見，GmADF5、GmADF6、GmADF12蛋白只含3個(gè)基序，分別是基序1、基序2和基序

4，GmADF9、GmADF18同時(shí)含有基序1、基序2、基序3、基序4、基序5，其余13個(gè)GmADFs同時(shí)含有基序1、基序2、基序3、基序4?；?的序列長(zhǎng)度最長(zhǎng)，基序4和基序5的序列長(zhǎng)度最短。

2.3大豆ADF基因的染色體定位和復(fù)制事件

由圖2A可見，18個(gè)大豆ADF基因不均勻地分布于13條染色體上，其中1、3、5、8、9、12、13、15號(hào)和19號(hào)染色體上各分布1個(gè)，6、11號(hào)和20號(hào)染色體上各分布2個(gè)，10號(hào)染色體上分布3個(gè)。除GmADF14位于靠近染色體中心粒附近外，其余17個(gè)大豆ADF基因分布在遠(yuǎn)離染色體中心粒的一端。

大豆ADF基因基因組內(nèi)部共線性結(jié)果（圖2B）顯示，在大豆基因組中共檢測(cè)到25個(gè)ADF旁系同源基因?qū)?，均為全基因組復(fù)制或片段復(fù)制大豆ADF旁系同源基因?qū)Φ腒a值范圍為 0～ 0.1449，平均值為0.0728，Ka/Ks值范圍為 0～

A

0.0856，平均值為0.1011，表明大豆ADF基因主要受純化選擇壓力的影響。

2.4大豆與其他物種ADF基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及共線性分析

大豆、野生大豆、擬南芥、小麥、水稻和玉米6個(gè)物種ADF蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖 3A 。可以看出，ADF家族可以分為I～V共5個(gè)亞族，各亞族分別由33、13、16、15、23個(gè)成員組成。其中，第I亞族含有6個(gè)物種ADF家族的部分成員，以小麥ADF蛋白數(shù)量最多（9個(gè)），水稻ADF蛋白最少（3個(gè)）；第Ⅱ亞族僅含有小麥、玉米和水稻ADF家族的部分成員，以小麥ADF蛋白數(shù)量最多，為8個(gè)；

第Ⅲ亞族包含除小麥以外其余5個(gè)物種ADF家族的部分成員，以擬南芥ADF蛋白數(shù)量最多（5個(gè)）；第IV亞族含有6個(gè)物種ADF家族的部分成員，以野生大豆ADF蛋白的數(shù)量最多（4個(gè)）；第V亞族含有6個(gè)物種ADF家族的部分成員，各物種的數(shù)量分布為1＼～5個(gè)，大豆、野生大豆、小麥ADF蛋白的數(shù)量均為5個(gè)。綜上，大豆ADF家族成員分布在I、I、IV和V亞族，數(shù)量分別為6、4、3、5個(gè)。

基因組間共線性分析結(jié)果（圖3B、C）顯示，大豆與擬南芥間共檢測(cè)到21對(duì)ADF直系同源基因，大豆與野生大豆間檢測(cè)到51對(duì)ADF直系同源基因。系統(tǒng)進(jìn)化樹和物種間共線性分析結(jié)果表明，大豆與野生大豆ADF基因間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近。

2.5 大豆ADF基因的啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

大豆ADF基因的啟動(dòng)子區(qū)具有多種類型的順勢(shì)調(diào)控元件，包括光響應(yīng)元件、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件、激素類響應(yīng)元件、防御和壓力脅迫響應(yīng)元件以及功能未知元件等（圖4）。18個(gè)大豆ADF基因均含有光響應(yīng)元件，其中GmADF13具有最多的光響應(yīng)元件（27個(gè)）；11個(gè)大豆ADF基因含有脫落酸響應(yīng)元件，其中GmADF8含有的最多，為5個(gè)；7個(gè)大豆ADF基因含有赤霉素響應(yīng)元件；9個(gè)大豆ADF基因含有茉莉酸響應(yīng)元件;6個(gè)大豆

ADF 基因含有水楊酸響應(yīng)元件；14個(gè)大豆ADF基因含有乙烯響應(yīng)元件；5個(gè)大豆 ADF 基因含有生長(zhǎng)素響應(yīng)元件；18個(gè)大豆ADF基因均含有防御和脅迫響應(yīng)元件，數(shù)量為7＼～22個(gè)，其中GmADF8的最多；除GmADF13外，17個(gè)大豆ADF基因含有生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件；18個(gè)大豆ADF基因均含有功能未知元件，其中GmADF11和GmADF15的數(shù)量較多，分別為32個(gè)和29個(gè)。

2.6 大豆ADF蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用STRING在線網(wǎng)站分析并構(gòu)建了大豆ADF蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，由圖5可知，18個(gè)大豆ADF蛋白與5個(gè)不同蛋白存在一定直接互作關(guān)系。這5個(gè)蛋白中，SAC1（Actin-1）Glyma. 19g095900 、Glyma.16g053400 和 Glyma. 19g000900 均為肌動(dòng)蛋白（Actin），肌動(dòng)蛋白是一類高度保守的蛋白，參與各種類型的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，在所有真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)，同時(shí)它們還是細(xì)胞骨架的重要組成部分，在細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)、細(xì)胞形狀決定、細(xì)胞分裂、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)和延伸生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，UniProt數(shù)據(jù)庫注釋它們定位于細(xì)胞骨架和細(xì)胞質(zhì)；而Glyma05g243900 經(jīng)SMART數(shù)據(jù)庫鑒定含有11個(gè)WD40功能域，其在UniProt數(shù)據(jù)庫被注釋為含BTB/POZ功能域蛋白，預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核，WD重復(fù)蛋白是存在于所有真核生物中的一個(gè)大家族，參與從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)到細(xì)胞周期控制和細(xì)胞凋亡等多種功能

2.7 大豆ADF基因表達(dá)的組織特異性分析

從大豆ADF基因在不同組織（根、莖、葉、花、 莢和種子等）中的表達(dá)熱圖（圖6）可知，GmADF2、 GmADF16、GmADF12、GmADF13、GmADF8、GmADF14、 GmADF7、GmADF15、GmADF4、GmADF18、GmADF5、 GmADF9主要在大豆下胚軸中表達(dá)；GmADF3、 GmADF11、GmADF10、GmADF1、GmADF6、GmADF7主要 在大豆花中表達(dá)。此外，GmADF7在大豆根中高 表達(dá)；GmADF13在大豆種子中高表達(dá);GmADF8、 GmADF14在大豆豆莢amp;種子中高表達(dá);GmADF2、 GmADF18、GmADF9在大豆子葉中高表達(dá)

2.8基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的大豆ADF基因在鹽、干旱、低溫、淹水脅迫下的表達(dá)分析

2.8.1在鹽脅迫下的表達(dá)分析由圖7可知，鹽脅迫下，GmADF2和GmADF16在大豆根和葉中的表達(dá)量均先升高后降低，且均在處理 ^2h 時(shí)達(dá)到峰值。在根中， GmADFI4?GmADFI5?GmADF7 和GmADF8在鹽脅迫下的表達(dá)量也表現(xiàn)為先升高后降低，但前兩個(gè)基因在處理 時(shí)的表達(dá)量達(dá)到峰值，而后兩個(gè)基因在處理 24h 時(shí)的表達(dá)量達(dá)到峰值。在葉中，GmADF7、GmADF15、GmADF8、GmADF10在鹽脅迫下的表達(dá)量也呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，其中前兩個(gè)基因在鹽脅迫處理 ^4h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，而后兩個(gè)基因在處理 24h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值; GmADF4，GmADF5，GmADF9， GmADF13和GmADF18在鹽脅迫下的表達(dá)量呈現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢(shì)，在處理 48h 達(dá)到峰值。綜合分析，大豆根和葉中 ADF 基因在鹽脅迫下具有不同的表達(dá)趨勢(shì)，暗示著它們的功能具有多樣性，可能在鹽脅迫下發(fā)揮著不同的生物學(xué)作用。

2.8.2在干旱、淹水和低溫脅迫下的表達(dá)分析由圖8A可知，在干旱脅迫下，GmADF3、GmADF8、GmADF9、GmADF14、GmADF16、GmADF17和GmADF18受干旱脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)量持續(xù)升高，在干旱6d時(shí)達(dá)到峰值；GmADF2、GmADF4、

GmADF7、GmADF11、GmADF12、GmADF13和 GmADF15表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)；而 GmADF5在干旱脅迫下表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì)

由圖8B可見，GmADF4、GmADF7和GmADF15在淹水脅迫下表達(dá)量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；GmADF3、

GmADF9、GmADF12、GmADF14、GmADF16和GmADF18在淹水脅迫下表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在淹水2d達(dá)到峰值;GmADF11在淹水1d表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量降低。而GmADF13在淹水脅迫下表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì)，在淹水3d時(shí)達(dá)到峰值。

由圖8C可知，GmADF5受低溫脅迫 24h 內(nèi)表達(dá) 量持續(xù)降低； GmADF9，GmADFI5 和GmADF16受低溫 脅迫表達(dá)量先升高后降低，脅迫 ¹h 時(shí)達(dá)峰值; GmADF2、GmADF8、GmADF13和GmADF14在低 溫脅迫 24h 內(nèi)表達(dá)量持續(xù)升高

2.9 大豆ADF基因在鹽和干旱處理下表達(dá)情況的qRT-PCR驗(yàn)證分析

本研究選取鹽脅迫和干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄水平顯著變化的4個(gè)大豆ADF基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證分析，結(jié)果（圖9）顯示，鹽脅迫下，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)分析結(jié)果基本一致。其中，GmADF2在鹽脅迫早期表達(dá)水平顯著升高，隨后表達(dá)量逐漸降低； GmADF5 在鹽脅迫后 ³h 表達(dá)量最低，在 6h 后表達(dá)量逐漸升高；GmADF7僅在鹽脅迫處理 12h 時(shí)被誘導(dǎo)顯著升高表達(dá)；GmADF8在鹽脅迫 6～24h 均被誘導(dǎo)顯著升高表達(dá)。干旱脅迫下，GmADF2和GmADF8在 ¹h 顯著上調(diào)表達(dá)，隨后表達(dá)量下降；GmADF5和GmADF7均在干旱脅迫早期呈上調(diào)表達(dá)，在 6h 表達(dá)量受到顯著抑制，但之后逐漸升高，在 24h 時(shí)表達(dá)量升高顯著。這些基因表達(dá)的差異性揭示了其在大豆非生物脅迫響應(yīng)中的潛在功能差異性

3討論與結(jié)論

ADF基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)脅迫的過程中具有重要作用。ADF基因家族成員的功能研究在擬南芥、小麥、水稻、玉米、番茄和棉花等植物中已有報(bào)道[5-9]，相關(guān)研究表明其在植物的花粉發(fā)育、氣孔調(diào)節(jié)、耐鹽性和抗病性中發(fā)揮重要作用[11-12，20，25.30]。本研究通過生物信息學(xué)方法從大豆基因組中鑒定到18個(gè)ADF基因，并依據(jù)染色體位置將其命名為GmADF1—GmADF18。理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)大豆ADF蛋白具有親水性且均定位于細(xì)胞質(zhì)，這與前人研究擬南芥、小麥和玉米等ADF蛋白理化性質(zhì)的結(jié)果相似[6-8]。大豆ADF基因結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，外顯子2＼～3個(gè)，均呈現(xiàn)出第2個(gè)外顯子序列較長(zhǎng)（ 260bp 或 266bp ）、第3個(gè)外顯子序列較短（ 151bp ）的特征；系統(tǒng)進(jìn)化樹中聚在同一亞組的 ADF 基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)，如GmADF7*、**分別代表0.05、0.01水平顯著性差異。

與GmADF15。大豆GmADF9和GmADF18均具有5個(gè)不同的基序，進(jìn)化樹末端相鄰分支的ADF蛋白間具有相似的保守基序，如GmADF1與GmADF11。

18個(gè)大豆ADF分布在13條染色體上，共線性分析檢測(cè)到25對(duì)ADF旁系同源基因，均為全基因組復(fù)制或片段復(fù)制，且 Ka/Ks 值均小于1，表明大豆ADF基因進(jìn)化過程更容易受到純化選擇壓力的影響，相似的研究結(jié)果也出現(xiàn)在小麥、玉米和番茄等作物上[5，7-8]。基因復(fù)制事件可能影響了大豆ADF基因在染色體上的分布。物種間共線性分析結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，大豆與野生大豆間存在最多的ADF直系同源基因?qū)?，同源基因分布在進(jìn)化樹的末端相鄰分支，表明它們的進(jìn)化關(guān)系最近，而大豆與擬南芥、水稻、小麥和玉米ADF基因的進(jìn)化關(guān)系稍遠(yuǎn)

大豆ADF基因啟動(dòng)子區(qū)具有大量脫落酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、乙烯響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件以及防御和脅迫響應(yīng)元件等，暗示大豆ADF基因可能參與多種激素響應(yīng)的生物學(xué)過程。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示大豆ADF蛋白主要與Actin家族蛋白和含POZ功能域蛋白互作，可能參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期控制和細(xì)胞凋亡等多種功能。

本研究組織表達(dá)模式分析表明，GmADF3、GmADFII，GmADFIO，GmADFI，GmADF6，GmADF7 在花中高表達(dá)，相似的結(jié)果也出現(xiàn)在前人有關(guān)擬南芥AtADF7/IO^[11] 、水稻 OsADFs^[31] 和玉米ZmADF1/2/7/12/I3^[8，10] 在花中特異性表達(dá)的研究結(jié)論中。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，鹽脅迫下，GmADF2和GmADF16在大豆根和葉中的表達(dá)均呈先升后降趨勢(shì)，并在處理早期 （2h） 達(dá)到峰值。根中GmADF7、GmADF8在處理中后期（ 24h） 達(dá)到峰值。葉中GmADF4、GmADF5、GmADF9、GmADF13、GmADF18在處理后期（ ⁺48h， 表達(dá)量達(dá)到峰值。而

GmADF8、GmADF14和GmADF16受干旱、淹水和鹽脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)量均升高。在干旱脅迫下，9個(gè)大豆ADF基因上調(diào)表達(dá)，而GmADF5表達(dá)量持續(xù)降低。GmADF11在淹水早期（1d）表達(dá)量最高，而GmADF13在淹水后期（3d）表達(dá)量最高。GmADF9、GmADF15和GmADF16主要參與低溫脅迫早期（1h）響應(yīng)。前人研究也表明，陸地棉大部分GhADFs在低溫、NaCl以及PEG處理下都有不同程度的響應(yīng)[38]。qRT－PCR 檢測(cè)的GmADF2、GmADF5、GmADF7、GmADF8基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)分析結(jié)果基本一致，它們?cè)邴}脅迫下的表達(dá)趨勢(shì)不同暗示大豆ADF基因家族成員的功能具有多樣性，可能在鹽脅迫下發(fā)揮著不同的生物學(xué)作用。本研究結(jié)果可為今后研究大豆ADF基因不同類型功能提供參考。

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