黑脛病對大寧曬煙轉(zhuǎn)錄組和代謝組的影響

中圖分類號：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2025）06-0037-11

AbstractDaning sun-cured tobacco is a species of good-quality yelow sun-cured tobacco in Hezhou， Guangxi，and it is the excellent raw material for cigarette production.However，it has extremely low resistance to black shank disease.This study investigated the response mechanism of Daning sun-cured tobacco to black shank disease by comparing the diferentially expressed genes and metabolites between healthy and black shank-infected leaves through transcriptomic and metabolomic analyses.The results showed that a total of 7 194 significantly diferentially expressed genes were identified through transcriptomic analysis，and 198 significantly diffrent metabolites were detected through metabolomic analysis.The combined transcriptomic and metabolomic analysis revealed that ： ① Plant hormone signal transduction and phenylpropanoid biosynthesis pathways played important roles in the defense of Daning sun-cured tobacco against black shank infection. ② 二 was speculated that metabolic pathways such as aminoacyl-tRNA biosynthesis，cyanogenic amino acid metabolism，valine，leucine and isoleucine degradation，cysteine and methionine metabolism，and arginine and proline metabolism were related to the response of Daning sun-cured tobacco to black shank stress.This study elucidated the major gene transcriptional regulatory networks and metabolic pathways of Daning sun-cured tobacco in response to black shank infection，which could provide a theoretical basis for research on improving the resistance of Daning sun-cured tobacco to black shank disease.

KeywordsDaning sun-cured tobacco；Black shank disease；Transcriptome；Metabolome；Plant hormone signal transduction; Phenylpropanoid biosynthesis

曬黃煙在我國有數(shù)百年的栽培歷史，目前已形成多個(gè)具有獨(dú)特香氣特征的品種[1]。優(yōu)質(zhì)的曬黃煙具有吃味純凈、勁頭適中、刺激性小等特點(diǎn)，一些地方性曬黃煙有顯著的香型特點(diǎn)，是卷煙配方中替代香料煙的良好原料[2]。研究表明，將曬黃煙適量添加在低檔卷煙配方中，既能增加填充能力，又能適當(dāng)降低香煙的焦油含量，減少對身體的傷害，同時(shí)還能使卷煙的吃味、香氣濃度和勁頭保持不變[3]。于建軍等4研究顯示，將曬黃煙加入烤煙中，可以彌補(bǔ)由于卷煙降焦減害所致的香氣不足、味道淡的缺點(diǎn)，還能豐富協(xié)調(diào)卷煙產(chǎn)品的香氣質(zhì)，“中式卷煙”的發(fā)展離不開我國特有的曬黃煙資源[5] O

廣西賀州是我國曬黃煙較大的種植區(qū)，以大寧曬煙最為著名。大寧曬煙屬茄科煙草屬紅花煙，是一種優(yōu)質(zhì)特香型曬黃煙，以葉厚膠多、馥郁芳香、煙氣醇和、香味濃郁著稱[6-7]。大寧曬煙種植于新墾坡陡山地，采用傳統(tǒng)種植方式栽培[8]難以擴(kuò)大種植范圍和提高產(chǎn)量，因此異地種植是推廣和發(fā)展大寧曬煙的必然趨勢。目前關(guān)于大寧曬煙異地栽培的研究較多，但在異地栽培過程中發(fā)現(xiàn)其對黑脛病的抗性極低，導(dǎo)致大面積種植時(shí)產(chǎn)量較低。目前對于大寧曬煙響應(yīng)煙草黑腔病的關(guān)鍵基因及差異代謝物尚不清楚，本試驗(yàn)通過對大寧曬煙健康植株與感染黑脛病的植株葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析，解析差異基因的表達(dá)及差異代謝產(chǎn)物調(diào)控機(jī)制，為提高大寧曬煙黑脛病抗性的研究提供理論依據(jù)

材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草品種為大寧曬煙，由廣西壯族自治區(qū)煙草公司提供。煙草黑脛病病原菌由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2023年5月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌校區(qū)進(jìn)行。采用盆栽試驗(yàn)，設(shè)試驗(yàn)組和對照組2個(gè)處理。大寧曬煙煙苗于5月1日移栽到盆內(nèi)（ 49cm×31.5cm ，裝土量為 15kg ），移栽后 45d 試驗(yàn)組煙苗接種疫霉菌，根據(jù)文獻(xiàn)「9并稍作修改，將煙草疫霉菌株接種于 10% V8液體培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中 25^°C 培養(yǎng) 3d 后，將 10% V8培養(yǎng)基更換為無菌水培養(yǎng)，每 12h 更換無菌水；培養(yǎng) ^48h 后制成 1×10⁶cfu/mL 孢子懸浮液，取10mL 懸浮液灌根接種。對照組以等量無菌水代替。接種病原菌5d后采集每株煙苗的第4到第6片葉中部，除去葉脈后混合作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每處理3次重復(fù)，其中對照組記作DN，試驗(yàn)組記作DNi。樣品裝入無菌取樣袋，液氮冷凍后 -80°C 保存，用于轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1葉片RNA提取與測序?qū)颖驹谘b有液氮的研缽中磨碎，使用TRlzol試劑盒提取總RNA，用NanoDrop2000分光光度計(jì)和Agilent2000Bioanalyzer測定RNA純度、濃度并評估RNA完整性。將檢測合格的樣品委托上海歐易生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序分析利用llumina Novaseq6000測序平臺進(jìn)行測序，使用fastp軟件去除低質(zhì)量 reads 獲得Clean reads，使用HTSeq-count 得到基因的Reads計(jì)數(shù)后使用 R（v3.2.0） 對基因計(jì)數(shù)進(jìn)行PCA分析并繪圖。利用DESeq軟件篩選P_adjlt;0.05 且 ∣log₂ （fold change） |gt;1 的基因定義為差異表達(dá)基因（DEGs）?；诔瑤缀畏植妓惴▽EGs注釋到GO、KEGG數(shù)據(jù)庫中對其進(jìn)行GO功能注釋和KEGG代謝通路富集分析。

1.3.3代謝組分析稱取 60mg 樣本并加人 600μL 甲醇-水（ V：V=7：3 進(jìn)行研磨，冰水浴超聲提取30min ， -20^°C 靜置過夜后 離心 10min ，取上清液過濾后進(jìn)行LC-MS分析。采用 Waters ACQUITY UPLCI-Class plus/Thermo QE超高效液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（ACQUITYUPLCHSST3）配備色譜柱（ 100mm× 2.1mm，1.8μm） ）進(jìn)行分析。色譜條件為柱溫：45^°C ；流動相：A為 0.1% 甲酸水溶液，B為乙腈；流速為 0.35mL/min ;進(jìn)樣體積為 4μL 。使用Progenesis QIv3.0 軟件（Nonlinear Dynamics，New-castle，UK）對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用Lipidmaps（v2.3）和METLIN數(shù)據(jù)庫對化合物進(jìn)行鑒定分析。采用無監(jiān)督的主成分分析（PCA）觀察各樣本之間的總體分布和分析過程的穩(wěn)定性。依據(jù)物質(zhì)在不同樣本的表達(dá)量信息，采用層次聚類方法對物質(zhì)和樣本進(jìn)行分類。基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康煙株與感病煙株外觀差異

大寧曬煙感染黑脛病后，葉片萎蔫，下部葉片變黃枯萎，植株根基部或莖部變?yōu)楹谏?，維管束遭到破壞，髓部干縮成褐色碟片狀，碟片之間有白色菌絲（圖1）。維管束的破壞導(dǎo)致煙株不能正常運(yùn)輸生長所需的養(yǎng)分和水分，最終引起煙株整體萎蔫死亡

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評估由表1可知，每個(gè)樣品產(chǎn)生 （46.8～47.3）×10⁶ 條Clean Reads，GC含量為42.13%～42.67% ，且沒有出現(xiàn)AT/GC分離，Q30達(dá)到96% 以上。將CleanReads與煙草基因組比對后發(fā)現(xiàn)平均有 96.7% 的序列與煙草參考基因組序列相匹配，其中平均 87.32% 的序列比對到唯一位置，表明測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和比對效果較好。PCA分析結(jié)果（圖2）顯示，大寧曬煙DN與DNi兩組樣本被明顯區(qū)分開，DN組和DNi組在第一主成分（PC1）存在顯著差異，解釋總變量的 67.65% 。

2.2.2差異表達(dá)基因聚類分析根據(jù)基因的表達(dá)量（FPKM值）進(jìn)一步計(jì)算其在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)，對DN和DNi組RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，共篩選到7194個(gè)DEGs，其中DNi組有3250個(gè)顯著上調(diào)基因，占總DEGs的 45.18% ，有3944個(gè)顯著下調(diào)基因，占總DEGs的 54.82% （圖3）。對所有DEGs進(jìn)行水平聚類分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，大寧曬煙感染黑脛病之后表達(dá)量低的基因在未感病的葉片材料中表達(dá)量升高，而感染黑脛病后表達(dá)量高的基因在健康煙株樣本中表達(dá)量降低

2.2.3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析DNvsDNi的差異表達(dá)基因GO富集分析共注釋到3123個(gè)條目，首先篩選出GO三大分類中DEGs數(shù)目大于5的條目，然后按照 P 值從小到大進(jìn)行排序?；虍a(chǎn)物功能描述分為3個(gè)層面：生物過程（biological process）、細(xì)胞組成（cellular compo-nent）和分子功能（molecularfunction）。根據(jù)DEGs數(shù)目和 P 值篩選出每個(gè)分類下TOP10的條目（圖5）。其中，在生物學(xué)過程中，DEGs主要參與光合作用（photosynthesis）和還原性戊糖-磷酸循環(huán)（reductive pentose-phosphate cycle）;在細(xì)胞組分方面，DEGs主要涉及葉綠體類囊體膜（chlo-roplast thylakoid membrane）和類囊體（thylakoid）;在分子功能方面，DEGs主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（DNA-binding transcription factor activity）。

KEGG通路富集分析結(jié)果（圖6）顯示，DEGs （Plant hormone signal transduction）、MAPK 信號通主要富集的信號通路為：植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 路（MAPK signalingpathway-plant）、光合作用（Photosynthesis）、光合固碳（Carbonfixationinphotosyntheticorganisms）、亞油酸代謝（Linoleicacidmetabolism）、Phenylalaninemetabolism（苯丙氨酸代謝）、磷酸戊糖途徑（Pentosephosphatepathway）、 α- 亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacidmetabolism）及纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine degradation）等。

2.2.4植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)差異表達(dá)基因植物防御反應(yīng)通過復(fù)雜的植物激素介導(dǎo)的信號網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控，這些激素通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用，共同調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。在本研究中，與健康煙株相比，感病煙株中茉莉酸（JA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的酰氨基合成酶基因JARI（Nitab4.5_0000305g0060 ）、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子基因JAZ（Nit- Nit-4 . 5 -0 0 0 0 0 7 3 g 0 2 7 0 ） 和轉(zhuǎn)錄因子基因MYC2（Nit-ab4.5_000804g0160）均顯著上調(diào)；有4個(gè)DEGs參與水楊酸（SA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中轉(zhuǎn)錄因子基因TGA（ Nitab4.5 _ 0001472g0070、Nitab4.5_0000672g0160）、PR－1蛋白基因（Nitab4.5_ 均顯著上調(diào)；在脫落酸（ABA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，蛋白磷酸酶基因PP2C（Nitab4.5_0005537g0010、Nitab4.5_0005632g0010、Nitab4.5_000714g0020、Nitab4.5_0008967g0020、Nitab4.5_0000153g0190、Nitab4.5_0000647g0160、Nitab4.5_0001231g0090、Nitab4.5_0000463g0070、Nitab4.5_0005987g0010）均顯著上調(diào)，PP2C去磷酸化后絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因SnRK2有 5 個(gè) DEGs（Nitab4.5_0001684g0050、Nitab4.5_0002604g0060、Nitab4.5_0025725g0010、Nitab4.5_0008722g0010、Nitab4.5_0000786g0150）

顯著上調(diào)，而有2個(gè) DEGs （Nitab4.5_0000905g0170、Nit-"a b"4 . 5_ 0 0 0 6 4 8 4 "g "0 0 1 0 ）"顯著下調(diào)；ABA反應(yīng)元件結(jié)合因子基因！ ABF（Nitab4.50002760g0050） 、Nitab4.5_0007480g0030、Nitab4.5_0002543g0050、Nitab4 . 5 _ 0 0 0 3 0 8 0 g0 0 8 、 N i t a b "4 . 5 _ 0 0 0 2 8 7 g 0 2 4 0 ） 均顯著上調(diào)（圖7A）。

2.2.5苯丙烷類生物合成相關(guān)差異表達(dá)基因苯丙烷類生物合成途徑產(chǎn)生的次級代謝物在植物的生長發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境中均發(fā)揮重要作用。本研究中苯丙氨酸解氨酶基因PAL（Nitab4.5_0005320g0020 、Nitab4.5_0000101g0270）顯著上調(diào)，4-香豆酸輔酶a連接酶基因4CL（Nitab4.5_ 、肉桂醇脫氫酶基因CAD/SAD（Nitab4.5_0005392g0080、Nitab4.5_0003027g0020、Nitab4.5_0002815g0020）等關(guān)鍵基因在感染黑脛病的植株中強(qiáng)烈表達(dá)。查耳酮合成酶基因CHS（Nitab4.5_0002920g0060）、查耳酮-黃酮異構(gòu)酶基因CHI（Nitab4.5_ 、黃酮醇合成酶基因 ）、類黃酮 3^′- 單加氧酶基因 F3^′H （Nitab4.5_ 也在感染黑脛病的植株中上調(diào)表達(dá)（圖7B）。

2.3 代謝組分析

2.3.1 樣本主成分分析 利用主成分分析法（principlecomponentanalysis）對代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，以盡可能多地反映原有的變量信息。PCA分析結(jié)果（圖8）顯示，兩個(gè)處理組組內(nèi)3個(gè)樣本之間較為聚集，表明試驗(yàn)結(jié)果較為穩(wěn)定、重復(fù)性較好，兩組間數(shù)據(jù)在第一主成分PC1上存在顯著差異，解釋總變量的 91.1% 。

2.3.2差異代謝物分析DNvsDNi之間共檢測到3665個(gè)代謝物，以 ΔVIPgt;1 且 Plt;0.05 作為差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)，共有198個(gè)差異代謝物，其中有117個(gè)顯著上調(diào)，81個(gè)顯著下調(diào)，顯著上調(diào)差異代謝物較多（圖9）。

2.3.3 差異代謝物KEGG富集及關(guān)鍵代謝物分

析如圖10所示，大寧曬煙健康植株煙葉和感病植株煙葉差異代謝物的TOP20條代謝途徑中，其主要富集通路為氨?；?tRNA生物合成（Amino-acyl-tRNA biosynthesis）、氰基氨基酸代謝（Cyano-aminoacidmetabolism）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABCtransporters）、芥子油苷生物合成（Glucosinolatebi-osynthesis）、苯丙烷類生物合成（Phenylpropanoidbiosynthesis）等。

在198個(gè)差異代謝物中，有11個(gè)在KEGG數(shù)據(jù)庫中得到注釋（圖11A），其中L-脯氨酸（L-Proline）、L-纈氨酸（L-Valine）、L-組氨酸（L-Histidine）L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）、山奈酚（Kaempferol）、17-羥基亞麻酸（17-Hydroxylino-lenicAcid）、2S-氨基-3S-甲基戊酸（2s-Amino-3s-Methylpentanoic Acid）9s-hpotre、5-羥基-L-色氨酸（5-Hydroxy-L-Tryptophan）在感病煙葉中顯著積累，而亞精胺（Spermidine）和L-天冬氨酸（L-AsparticAcid）則顯著減少。

共檢測出9種苯丙烷類生物合成途徑產(chǎn)生的次級代謝物（圖11B），苯丙氨酸（L-Phenylala-nine）、3，4-Dihydro-2h-1-Benzopyran-2-One、Oleandolide、山奈酚（Kaempferol） ，2^′，7 -Dihydroxy -4^′- Methoxy-8-Prenylflavan 2^′ ，7-Diglucoside、Querce-tin 7-Methyl Ether 3-Alpha-L-Arabinopyranosyl-（1-gt;3） -Galactoside、蕓香苷（MarmesinRutino- 均顯著積累。side）、15，16-DihydrosacrolideA等在感病煙株中

2.4轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析

為解析煙草黑脛病的致病機(jī)制，對DNvsDNi的轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，KEGG顯著富集的通路途徑主要包括氰基氨基酸代謝（Cyanoaminoacidmetabolism），芥子油苷生物合成（Glucosinolatebiosynthesis），氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine deg-radation）， ∝- 亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacid me-tabolism），精氨酸和脯氨酸代謝（Arginineand pro-linemetabolism），見圖12。由KGML網(wǎng)絡(luò)圖（圖13）可以看出大寧曬煙在疫霉侵染下功能蛋白和代謝物的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，差異表達(dá)基因和差異代謝物主要富集在光合生物中的碳固定（Carbon_fixation_in_photosynthetic_organisms）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（Cysteine_and_methionine_metabolism）、苯丙素生物合成（Phenylpropanoid_biosynthesis）等代謝途徑中。

3討論

3.1 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組分析

近年來，高通量技術(shù)的迅速發(fā)展為了解不同生物體分子調(diào)控機(jī)制和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了技術(shù)支撐。轉(zhuǎn)錄組是某些特定組織或細(xì)胞在某種狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA之和，轉(zhuǎn)錄組測序能夠在整體水平上研究差異基因的表達(dá)、種類和數(shù)量[10]，有助于深人了解大寧曬煙感病煙株與健康煙株在分子水平的差異。在逆境下，植物激素會在植物體內(nèi)重新分布，通過運(yùn)輸?shù)竭_(dá)需要的位置，調(diào)節(jié)植物的生理過程。Caarls等[1]研究表明JA在植物抵御動物攝食和病原菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用。本研究中，與健康煙株相比，感病煙株中JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的酰氨基合成酶基因JARI、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子基因 JAZ 和轉(zhuǎn)錄因子基因MYC2均上調(diào)表達(dá)。越來越多的研究表明SA是一類重要的抗逆因子，在植物抗逆中發(fā)揮著重要作用。SAR是植物獲得抗性的重要內(nèi)源信號分子?；羧鸬萚12]研究表明，通過激發(fā)子誘導(dǎo)煙草葉片后，SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子NPR1和EDS1均上調(diào)表達(dá)。本研究中有4個(gè)DEGs參與SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中轉(zhuǎn)錄因子基因TGA、PR-1蛋白基因均上調(diào)表達(dá)；在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，蛋白磷酸酶基因PP2C均上調(diào)表達(dá)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因SnRK2有5個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)而有兩個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)，ABA反應(yīng)元件結(jié)合因子基因ABF均上調(diào)表達(dá)。大寧曬煙感病葉片中ABA的積累，促進(jìn)了葉片的氣孔關(guān)閉，防止過多的水分散失，促進(jìn)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)物的積累，從而降低滲透勢以維持水分獲取。Lackman 等[13]對JA誘導(dǎo)的ABA受體PYL4的鑒定證明，ABA和JA信號途徑存在一定的聯(lián)系。據(jù)Long等[14|研究表明ABA-JA的相互作用在植物抗病和抗逆性反應(yīng)過程中都有重要的作用，發(fā)現(xiàn)ABA可能通過調(diào)節(jié)易感柑橘中JA的合成，促進(jìn)晚錦橙對潰瘍病菌的易感性。此外，敲除擬南芥中的MYC2后，發(fā)現(xiàn)突變體中JA應(yīng)答基因和ABA響應(yīng)基因的表達(dá)均受到抑制，降低了突變體對干旱的耐受能力，說明JA-ABA在非生物脅迫反應(yīng)和耐受中存在相互作用[15]。本研究證明大寧曬煙響應(yīng)煙草疫霉侵染過程中激活了JA、SA和ABA信號途徑，這與孫嘉曼等[16的研究結(jié)果一致。

3.2 轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析

氨?；?tRNA是蛋白質(zhì)合成的重要中間體，能夠?qū)被醾鬟f到核糖體上合成蛋白質(zhì)，是一種與對應(yīng)氨基酸相結(jié)合的 tRNA[17]。在植物受到非生物脅迫時(shí)，氨?；?tRNA的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)對于植物的應(yīng)激反應(yīng)和適應(yīng)能力至關(guān)重要。氰基氨基酸代謝主要包括氮類與氰基氨基酸的合成、氰基氨基酸的水解轉(zhuǎn)化以及產(chǎn)物的吸收與分布[18] O孫濤等[19]研究表明，枸杞接種尖孢鐮刀菌后產(chǎn)生的顯著差異代謝物主要富集在氨?；?tRNA生物合成和氰基氨基酸代謝通路中。Yang等[20]研究證明，芥菜在鎘脅迫環(huán)境下，會通過調(diào)節(jié)氨酰基-tRNA生物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和氰基氨基酸代謝等通路來抵抗逆境脅迫。本研究中差異代謝物KEGG富集分析結(jié)果顯示，大寧曬煙感染黑腔病與健康煙株的顯著差異代謝物主要富集在氨?；?tRNA生物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氰基氨基酸代謝等通路中，這與上述研究結(jié)果一致。

新陳代謝是一個(gè)由復(fù)雜的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)組成的生理過程，涉及許多細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的反應(yīng)。植物代謝分為初級代謝和次級代謝：初級代謝是將簡單有機(jī)分子轉(zhuǎn)化為復(fù)雜有機(jī)化合物的過程，是植物生長發(fā)育的必需，參與基本生命功能；次級代謝則是植物產(chǎn)生適應(yīng)環(huán)境的特殊有機(jī)化合物的過程，具有生物活性，在植物生長發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境方面發(fā)揮重要作用[21-22]。藜麥在受到逆境脅迫時(shí)產(chǎn)生苯丙氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和脯氨酸等氨基酸，是藜麥抗逆境脅迫的關(guān)鍵代謝物質(zhì)[23]。張莫凡等[24]研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿在淹水脅迫下，差異代謝物主要富集在氨基酸代謝途徑。沈秉娜等[25]研究指出，植物在遭遇逆境脅迫時(shí)，其防御系統(tǒng)會通過對氨基酸的合成和降解來減輕脅迫帶來的傷害。本研究轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析顯示，KEGG通路富集在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝等氨基酸代謝途徑，推測氨基酸代謝可能與大寧曬煙抵抗黑脛病脅迫有關(guān)。

植物在遇到生物與非生物逆境時(shí)會激活自身的防御系統(tǒng)，包括相關(guān)防御基因的活化、細(xì)胞壁加固以及合成植保素和其他抗菌物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物的多方面協(xié)同作用[26]。Huang等[27]研究表明，苯丙烷類生物合成途徑在植物抗病過程中起重要的調(diào)控作用。Beyer等[28]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥響應(yīng)大豆銹病菌侵染時(shí)可激活苯丙烷類生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)，表明該途徑在植物抵御病原菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用[29]。本研究中苯丙氨酸解氨酶基因PAL上調(diào)表達(dá)，4-香豆酸輔酶a連接酶基因4CL、肉桂醇脫氫酶基因 CAD/SAD 等苯丙烷類生物合成途徑的關(guān)鍵基因在感染黑脛病的植株中強(qiáng)烈表達(dá)，這些基因參與木質(zhì)素聚合物合成，在抗性反應(yīng)激活過程中可加固植物的細(xì)胞壁，從而起到抵御病原菌侵染的作用。參與類黃酮合成途徑的查耳酮合成酶基因CHS、查耳酮-黃酮異構(gòu)酶基因 CHI， 黃酮醇合成酶基因FLS、類黃酮3'-單加氧酶基因 F3^′H 也在感染黑脛病的植株中顯著上調(diào)表達(dá)，在植物應(yīng)對逆境脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。苯丙烷類生物合成途徑產(chǎn)生的苯丙氨酸等9種次級代謝物在感病煙株中顯著積累。Zhang等[30]在抗黑脛病煙草品種和感病品種根系分泌物的研究中發(fā)現(xiàn)，苯丙烷以及水楊酸、脂肪酸、茉莉酸等物質(zhì)在不同品種根系分泌物中有著顯著差異，表明這些物質(zhì)可能參與了煙草防御反應(yīng)。Jadhav等[31]研究表明，苯丙烷合成通路在植物抗病過程中具有重要地位，其中酚類、植物抗毒素、木質(zhì)素以及類黃酮等主要的防御性化合物均需通過該通路合成。上述結(jié)果表明，在大寧曬煙應(yīng)對煙草疫霉侵染的過程中，苯丙烷類生物合成途徑是植物防御機(jī)制的重要組成部分。

4結(jié)論

本研究對大寧曬煙健康煙株與感染黑腔病煙株的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出7194個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中有3250個(gè)顯著上調(diào)和3944個(gè)顯著下調(diào)；代謝組學(xué)共檢測到3665個(gè)代謝物，共有198個(gè)差異代謝物（ VIP?1 且 Plt;0.05， ，有117種顯著上調(diào)，81種顯著下調(diào)，其中有9種苯丙烷類生物合成途徑的次級代謝物。通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，氨?；?tRNA生物合成，氰基氨基酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝等代謝途徑可能與大寧曬煙抵抗黑脛病脅迫相關(guān)。通過分析植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷類生物合成途徑中差異基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)調(diào)控茉莉酸、水楊酸、脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及木質(zhì)素、類黃酮等苯丙烷類生物合成的基因顯著上調(diào)表達(dá)。代謝組分析發(fā)現(xiàn)苯丙烷類生物合成產(chǎn)生的次級代謝物顯著富集，證明植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷類生物合成在大寧曬煙響應(yīng)疫霉侵染的過程中發(fā)揮著重要作用。

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