液體活檢在肝細胞癌診斷及治療中的應用

關鍵詞：肝細胞癌；液體活組織檢查；腫瘤細胞，循環(huán)；循環(huán)腫瘤DNA；細胞外囊泡基金項目：國家“十三五\"科技重大專項（2018ZX10302204-001-003）

Abstract：Hepatocelularcarcinomaisoneof the mostcommoncancers，andduetothelackofobviousspecificsymptoms inits earlystage，patientsareoftenintheadvancedstageatthtimeofdiagnosisandtendtohaveapoorprognosis.Timelydiagnosisand ffective treatmentintheearlystagecanhelptoprolongthesurvivaltimeofpatients.Liquidbiopsyisanoninvasivetechniquethat canobtain theinformationof tumorbydetectingandanalyzingrelatedbiomarkers，including circulating tumorcels，circulating tumorDNA，andextracelularvesicles，therebycontributing toearlydiagnosis，molecularpathologicaltyping，andprognosis prediction.Thisarticlereviews theresearchadvancesin theaplicationofliquid biopsyinthediagnosisandtreatmentof hepatocellular carcinoma.

KeyWords：HepatocellularCarcinoma;；LiquidBopsy；eoplasticCels，irculating；CirculatingTumorDA;ExtracellarVesicles Research funding：National Scienceand Technology Major Projects of the 13^th Five-Year Plan（2018ZX10302204-001-003）

原發(fā)性肝癌是癌癥死亡的第二大常見原因[1]，其中肝細胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型[2]。HCC存在多種風險因素，主要包括HBV、HCV、酒精、代謝紊亂（糖尿病、血脂異常、過度肥胖等）非酒精性脂肪性肝病、黃曲霉素等[3]，通常的發(fā)展順序是肝損傷、慢性炎癥、肝纖維化、肝硬化，繼而演變?yōu)镠CC[4]。目前HCC早期檢測的準確性并不理想，液體活檢作為一種新的檢測方法，有助于幫助解決這一臨床問題，同時對治療效果評估和預后判斷有一定臨床價值。液體活檢是指對體液中（通常是血液）循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumorcell，CTC）循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)microRNA和細胞外囊泡（extracellularvesicles，EV）進行檢測分析，從而獲取患者腫瘤有關信息，用以輔助診斷治療[5]。與傳統(tǒng)手術或穿刺活檢相比，液體活檢有副作用小、操作簡便、方便重復檢測、成本低廉等優(yōu)點。

1CTC、ctDNA、EV的特性及其檢測方法

1.1CTCCTC是從原發(fā)性實體瘤轉移到外周血或淋巴系統(tǒng)，最終在血液、骨髓、淋巴結或其他健康器官中生長的腫瘤細胞，是腫瘤轉移的重要原因，可以被生動地描述為“腫瘤的種子”。CTC至今有多種定義，CellSearch系統(tǒng)的定義被認定為當前的標準：CTC是血液中表達上皮細胞黏附分子（epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM）表達細胞角蛋白（cytokeratin，CK）8、18和/或19、白細胞特異性抗原45陰性且直徑大于 4μm 的細胞。分析血液中CTC的數(shù)量、蛋白表達、基因序列等可以獲取腫瘤的病變信息。CTC檢測主要包括從蛋白、染色體、DNA和RNA水平實現(xiàn)對腫瘤細胞的定性分析。

腫瘤細胞轉移到外周血發(fā)生在腫瘤發(fā)展的每個階段。因此，CTC可以作為疾病早期診斷和監(jiān)測復發(fā)的重要標志物。由于CTC在血液中的含量非常低（每毫升幾百個）并且存在的半衰期較短 （1～2.4h） ，長期以來研究一直受到阻礙。近年來，隨著技術的提高，CTC的分離和濃縮技術取得了巨大進步。根據(jù)CTC的物理性質和生物性質可將富集方法分為兩種類型?；谖锢硇再|的方法包括設計特定尺寸的過濾器件、Ficoll離心法、雙向電泳技術等[7]。基于生物學特性的技術依賴于抗原-抗體結合反應，可以分為免疫磁珠法和利用微流控芯片的免疫吸附法，免疫磁珠法又可分為陽性富集法和陰性富集法。EpCAM是CTC純化分離最常用、最重要的抗原，它在血細胞中不存在，但在上皮來源的非血細胞中廣泛存在?；贓pCAM的CellSearch系統(tǒng)（使用抗EpCAM涂層的磁珠，從血液中提取CTC，固定、染色和手動計數(shù)）是基于免疫磁珠法的CTC陽性富集系統(tǒng)，是第一個通過美國食品藥品監(jiān)督管理局臨床驗證的CTC捕獲方法，但是這種方法會錯過很多潛在腫瘤細胞，尤其在肝癌中，只有一小部分患者 （20%）EpCAM 呈陽性[8]。對于HCC，EpCAM和波形蛋白聯(lián)合GPC3（磷脂酰肌醇蛋白聚糖3）蛋白的分離方案可用于更徹底的CTC分離，該組合方案具有毒性低、特異性強（ 96.94% ）、靈敏度高1 98.12% ）、檢出率高（ 98.64% ）等優(yōu)點，能夠特異、準確、高效地富集血液中的 CTC^[9] 。使用免疫磁珠的陰性富集法通過去除背景血細胞來富集CTC。通過上述富集方法處理外周血可以降低血細胞水平，從而檢測和分析剩余細胞群。目前CTC的檢測方法主要包括免疫熒光標記、RNA原位雜交、熒光定量PCR、流式細胞術等[10]。

1.2ctDNA血漿游離DNA（cellfreeDNA，cfDNA）是血漿中游離存在的DNA，有的來自正常細胞，有的來自異常細胞（如腫瘤細胞），還有部分來自外部（如病毒DNA）]。ctDNA指的是由腫瘤細胞釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中的DNA。來自壞死腫瘤細胞、CTC和腫瘤細胞分泌的外泌體，它包含著腫瘤細胞特異性突變的基因信息。

ctDNA只占cfDNA的一小部分 （0.01%～1%） ，并且總是被大量非癌細胞來源的DNA稀釋，目前無法通過捕獲技術特異性分離ctDNA，因此檢測腫瘤特異性突變是檢測ctDNA的最有效方法。由于細胞損傷，癌癥患者的cfDNA水平遠高于健康個體，這在化療或放療后尤為明顯;cfDNA的半衰期很短，只有不到 2h^[12] ，這些因素使ctDNA的檢測更加困難。只有檢測cfDNA上的腫瘤特異性相關特征才能有效地證明ctDNA的存在，例如單核苷酸突變、甲基化變化和癌癥相關的病毒序列。最近有研究表明一種基于琥珀酰磷乙醇胺的脂質體可以在體外抑制單核吞噬細胞系統(tǒng)，從而短暫地增加血液中cfDNA的回收率；或者使用單克隆抗體與cfDNA結合，從而減慢其被核酸酶降解的速度。上述兩種調節(jié)體內cfDNA清除效率的方法已在小鼠中得到證實，有希望在臨床應用中提高液體活檢的靈敏度和實用性[13]。

血漿中ctDNA的變化分為定量和定性，前者指ctDNA總濃度，或者指DNA突變。近年來已經開發(fā)了許多具有高靈敏度和特異度的方法，包括數(shù)字PCR和二代測序（NGS）用于檢測DNA畸變的先進技術。BEAMing技術是一種相對靈敏且廉價的已知突變篩查方法，把PCR和流式細胞術結合，可以檢測低至 0.01% 頻率水平的突變[14]。雖然基于PCR的技術有著很高的靈敏度，但該技術只能檢測有限數(shù)量的突變。為了克服這一問題，NGS測序技術用于獲得更完整的基因組圖譜，涉及深度測序的方法包括 Safe-SeqS、Capp-Seq、Tam-Seq 和Ampli-Seq等。通過這些技術檢測出的癌癥基因圖譜可為患者提供個性化治療[15]

1.3EVEV是指正常細胞和腫瘤細胞釋放的納米顆粒的總稱。根據(jù)形成過程EV可以大致分為3類：外泌體、微囊泡和凋亡小體[16]。EV的直徑為 40～160nm ，通常被脂質雙分子層包裹，內含有DNA、RNA、蛋白質、代謝產物和脂質等生物分子。鑒于EV同樣在早期就存在于血液中，分析腫瘤來源的EV可以作為一種診斷早期癌癥的方法。

與CTC和ctDNA相比，EV在數(shù)量上有巨大優(yōu)勢，每毫升血液中有 10⁹ 數(shù)量級，更容易獲得[17]。目前至少有6種不同類型的分離方法，包括：超速離心、過濾法、體積排阻色譜法、沉淀法、免疫親和捕獲法和微流控法，這些方法各有特點和優(yōu)劣，可以單獨或組合使用，以達到臨床應用所需要的回收率和純度[18]。通過分析EV所包含的miRNA、IncRNA、mRNA、蛋白等分子標志物，可以獲取更有特異性的癌癥信息，輔助診斷和治療。例如研究人員通過對EV中RNA測序的方法區(qū)分早期HCC與高危肝硬化人群，受試者操作特征曲線下面積（AUC）達0.93[19]

CTC、ctRNA、EV源自癌細胞或癌細胞裂解后產物（圖1）。CTC攜帶一整套腫瘤細胞的遺傳信息（包括DNA、RNA、蛋白質等），并且與腫瘤的發(fā)生和傳播有密切聯(lián)系，在臨床中有許多潛在應用，包括疾病診斷、預后評估、個體化治療等。然而由于CTC在外周血濃度低且離體培養(yǎng)困難，對CTC生物學信息理解尚處起步階段。ctDNA和EV可以攜帶有關腫瘤的片段化信息，其中EV在體液中有明顯的數(shù)量優(yōu)勢，不過異質性限制了其應用。由于無法對人類藥物進行高通量篩選，ctDNA和EV作為藥物療效的標志物未得到充分利用[20]

注：CTC從原始或轉移性腫瘤自然脫落后在血液中循環(huán)，是腫瘤的“種子”，可以導致新的致命轉移；ctDNA來源于凋亡和壞死的腫瘤細胞，這些細胞將其片段化的DNA釋放到循環(huán)中；EV由腫瘤細胞分泌釋放，內含有DNA、RNA、蛋白質等生物分子。

2液體活檢在HCC中的臨床應用

2.1CTC在HCC中的預后價值研究表明EpCAM陽性CTC與高AFP水平相關，并且與血管浸潤相關，表明EpCAM陽性CTC有潛力成為評估HCC患者預后的生物學指標。CTC的陽性臨界值尚未形成統(tǒng)一定論，一些研究者將CTC陽性定義為“每 7.5mL 外周血中 CTC?1 或≥2”，一些研究者認為“每 7.5mL 外周血中 CTC?5^′ 的癌細胞活動性較強。毫無疑問的是，CTC陽性的HCC患者總生存期和無病生存期顯著縮短，并且檢測到的CTC越多，患者的預后越差[21]。

目前EpCAM陽性的CTC已經在HCC中深入研究，但是與其他幾乎普遍表達EpCAM的上皮細胞腫瘤不同，EpCAM不在成熟肝細胞中表達，僅在少部分HCC腫瘤中表達。因此，可能有EpCAM陰性的HCC細胞存在于血液中，并且使用EpCAM富集方法無法檢測到，這可能是無法在某些HCC患者中檢測出CTC的原因。非EpCAM陽性富集方法，例如唾液酸糖蛋白或廣譜角蛋白表達，或根據(jù)細胞大小富集檢測出的CTC陽性率高于EpCAM檢測法，但是相關研究數(shù)據(jù)較少，不具有可比性。HCC的最佳CTC富集方法可能需要幾種生物標志物聯(lián)合使用[22]。在一項涉及270例HCC 患者的研究中，把DAPI⁺/CD45^-/CK⁺ 細胞定義為CTC陽性，并在術前外周血中計數(shù)。對比術前腫瘤大?。栃远x為 gt;5cm ）、AFP水平（陽性定義為 gt;20ng/mL 和BCLC分期（陽性定義為gt;A期），CTC數(shù)量與HCC腫瘤負荷密切相關并且可以更好地預測HCC復發(fā)（AUC=0.95）[23]

CTC除了用于評估患者預后之外，還為疾病的演變提供動態(tài)指標，也可以為耐藥性等提供線索。NGS技術可以揭示單個腫瘤內或原發(fā)腫瘤與其轉移腫瘤之間的異質性。CTC提供了一種新型的非侵入性腫瘤DNA獲得手段，可更方便地用于NGS測序和分子分析。

2.2ctDNA在HCC中的診斷價值ctDNA在HCC中表現(xiàn)出重要的診斷價值。近年來，ctDNA的“甲基化修飾”一直是研究熱點。因為ctDNA的甲基化表達發(fā)生在腫瘤早期，所以檢測甲基化表達可能為早期癌癥診斷提供幫助。每一種細胞的甲基化修飾都是獨一無二的，并且在生理或者病理條件下高度穩(wěn)定。因此，識別不同的甲基化修飾可能成為新的HCC診斷工具。例如RAS相關家族1A基因中啟動子的高甲基化可在 92.5%HCC 患者中檢測到，并可以區(qū)分健康對照組和單純慢性HCV感染群體，總體預測率分別為 77.5% 和 72.5%^[24] 。因此ctDNA中異常啟動子甲基化可以作為HCC患者的篩查工具，尤其是早期高危人群的篩查。此外，幾個熱點甲基化基因位點的組合使用可以進一步提高靈敏度和特異度?？傊?，啟動子區(qū)域的高甲基化被公認為是癌癥發(fā)生的早期表現(xiàn)，不同腫瘤相關基因的甲基化在正常組織DNA中存在非常低或不存在，檢測這些甲基化對HCC診斷具有特異性。

cfDNA的定量分析也有一定的臨床價值。cfDNA水平可以區(qū)分HCC和HCV攜帶者，最佳臨界值為 73.0ng/mL 靈敏度為 69.2% ，特異度為 93.3%^[25] 。如果cfDNA 和 AFP或 α -L-巖藻糖苷酶（ ∝ -L-fucosidase，AFU）聯(lián)合檢測，可以進一步提高靈敏度。cfDNA、AFP和AFU在HCC的檢測中無顯著相關性。cfDNA聯(lián)合AFP或AFU、cfDNA與AFP和

AFU三者聯(lián)合的靈敏度分別為 71.8%.87.2% 和 89.7% ，而單獨使用cfDNA、AFP和AFU的靈敏度分別為 56.4% 、53.8%和66.7%[26]

2.3ctDNA在HCC中的預后價值除了早期診斷外，ctDNA在HCC預后中也發(fā)揮重要作用。非靶向ctDNA、cfDNA的水平始終與總生存期和無病生存期呈負相關，有望成為評估HCC復發(fā)或轉移風險的新指標[27]。在一項包括41例HCC患者的研究中，根治性肝臟手術前ctDNA陽性率為 63.4% ，手術后ctDNA陽性率下降至 46% ，41例患者中有9例觀察到疾病進展伴早期復發(fā)，中位隨訪時間為17.7個月，非復發(fā)組術前ctDNA陽性率顯著低于復發(fā)組，術后是否復發(fā)與ctDNA檢測結果之間存在顯著相關性[28]

靶向ctDNA檢測可以反映腫瘤的異質性，并且可以評估預后。TP53、CTNNB1和TERT等關注度較高的突變位點是檢測ctDNA突變的首選目標。一項研究使用MiSeq系統(tǒng)檢測相關突變，發(fā)現(xiàn)在血管浸潤的患者中更容易檢測到存在突變的ctDNA，并且預期無病生存期更短[29]。需要注意的是，并非所有檢測到的突變均來自腫瘤細胞，在cfDNA中的突變也會被檢測并且有可能干擾結果，因此有必要篩選相應的樣本以確定突變來源。

2.4EV在HCC中的診斷價值研究表明，EV參與慢性肝病進展、調節(jié)HCC增殖及HCC血管生成、促進肝癌轉換、免疫逃逸和復發(fā)等過程。 Sun 等[30]報道一種基于HCCEV表面蛋白測定的方法用于檢測早期HCC，該方法通過評估3個HCCEV亞群（EpCAMCD63、CD147CD63和GPC3CD63）建立評分，區(qū)分早期HCC和肝硬化的AUC為0.95，敏感度為 91% ，特異度為 90% ，靈敏度和特異度顯著優(yōu)于血清AFP，有望幫助識別可治愈階段的HCC并改善患者長期預后。盡管遵循《國際肝癌協(xié)會肝細胞癌生物標志物開發(fā)白皮書》，但該研究隊列樣本量較少，很難進行精細的亞組分析，在生物標志物對照研究中可能存在潛在偏倚，需要后期更大規(guī)模更深入的研究驗證其在臨床中的作用。

2.5治療評估目前對實體腫瘤治療反應的評估主要取決于影像學測量的腫瘤直徑的動態(tài)變化。但是影像學監(jiān)測效果不夠敏感，限制了其在治療早期階段的應用。液體活檢可以用于評估手術切除效果，有望在腫瘤直徑明顯變化前幾周預測腫瘤反應[31]。ctDNA的甲基化水平和CTC的數(shù)量在治療后均有降低，可以用于評估手術切除效果，尤其是在腫瘤血源性播散和癌細胞轉移方面。

CTC亞型可能與治療反應相關，或可作為肝癌細胞分子亞型的補充。不同亞型的癌細胞對不同化療藥物的敏感度不同，例如 pERK⁺/pAkt^- CTC對索拉非尼更敏感[32]。CTC的個體分析可能具有不同的臨床意義，這將有助于選擇更加個性化的治療方法并預測治療結果。ctDNA中檢測到的突變也可為治療方案選擇提供參考，這種非侵入性檢測方法獲得的腫瘤DNA可以提供癌細胞基因組圖譜，并在某些方面指導治療。

CTC、ctDNA、EV的產生機制與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，并且攜帶大量相關信息，液體活檢可通過無創(chuàng)方式提供大量基因組和轉錄組信息，提示腫瘤間的異質性。這和傳統(tǒng)活檢方法相比操作難度低，患者接受度高，更有可能普及并且實現(xiàn)對疾病的長期監(jiān)測?，F(xiàn)階段研究尚未成熟，與傳統(tǒng)AFP、影像學等檢查結果相結合，可以進一步提高靈敏度和特異度。隨著腫瘤基因組學和分子標志物進一步發(fā)展，液體活檢技術有望發(fā)揮更大的作用。

3小結與展望

總之，液體活檢是一種在癌癥領域非常有應用前景的技術，首先，它可以在腫瘤發(fā)生早期無創(chuàng)性地獲取相關細胞或生物分子，通過對生物標志物檢測而對HCC高危人群進行疾病篩查，結合影像學和傳統(tǒng)生化指標，對疾病進行早期鑒別診斷，進一步提高生存預期。其次，對于接受靶向治療的患者，對腫瘤有關分子標志物檢測可以進一步獲得腫瘤細胞異質性信息，為患者差異化個性化治療方案的選擇提供依據(jù)，從而提高治療效果并減少副作用。最后，在接受手術切除治療的HCC患者中，術后CTC、ctDNA的檢測可以在治療效果、預后判斷和監(jiān)測復發(fā)方面發(fā)揮關鍵作用。

值得注意的是，液體活檢技術從實驗研究到臨床應用仍面臨巨大挑戰(zhàn)。第一，由于CTC、ctDNA以及EV在外周血中的含量較低且半衰期較短，相關的分離、富集、捕獲技術尚未成熟，相關技術有待進一步提高效率。第二，大多數(shù)液體活檢研究缺乏有效性和實用性的有力證據(jù)，對檢測的靈敏度和特異度存疑，未來各種多中心臨床研究可能會解決這一問題。第三，目前許多研究或是對單一分子標志物進行對比，或是對幾項參數(shù)進行綜合評定，缺乏簡單的評分標準，通過人工智能進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，有望獲取多項指標中的內在聯(lián)系，從而制訂客觀可應用的評分標準。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：李玉龍負責資料分析，撰寫論文和最終定稿；張欣欣負責課題設計，擬定寫作思路，指導修改論文。

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收稿日期：2024-08-13：錄用日期：2024-12-10本文編輯：劉曉紅

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