基于NF-κB/TLR4/Nrf2信號通路探討鉤藤-天麻藥對治療藥物性肝損傷的作用及機制

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】A 【文章編號】1007-8517（2025）10-0034-06

DOI： 10.3969/j .issn.1007-8517.2025.10. zgmzmjyzz202510007

Effect and Mechanism of Uncaria Rhynchophylla -Gastrodia ElataHerb -Pair on Drug-Induced Liver Injury Based on NF-κB/μLR4/νNrf2 Signaling Pathway

PANG Ting1LI Junxuan2MA Liuhui1WANG Zhihao3HE Huan1QIN Qingxia1* 1.Guangxi Agricultural Vocational University，Nanning 530o07，China；2.Nanning HealthSchol，Nanning 530028，China; 3.Guangxi Baicao Zhenxing Agricultural Science and Technology Co.，Ltd，Yulin 537Ooo，China

Abstract：Objective Toexplore theefectandmolecularmechanismof Uncariarhynchophylla-Gastrodiaelata herb-pair inthe treatment of drug-induced liver injury caused by Tripterygium glycosides tablets through NF-κB/ΩTLR4/ΩNrf2 signaling pathway. MethodsMale SPFBALB/c mice wererandomlydivided intosix groups，including threeUncariarhynchophyll-Gastrodia elata herb - pairgroups （ the doses were 8.12 5g?kg^-1d^-1 and 32.500g?kg^-1?d^-1 ，respectively），the positive control group （silybin 0.480g?kg^-1 ），the blank control group and the model group（Tripterygium glycosides 0.300g?kg^-1 ）. After the last administration for ^24h ，the eyeballs were removed for blood collection，and the activities of ALTand AST were determined.Teliverwas takenandthecontentsof glutathione，superoxidedismutaseandmalondialdehydeweredetermined，andthe contents of TNF-α and lipid peroxide were detected by Elisa.HE staining and Western blot were performed to detect the expression of NF-κB ，TLR4 and Nrf2.Results Compared with the normal group，the levels of ALT，AST，SOD，MDA， GSH-Px ，LPO and TNF- α in model group were significantly increased（ Plt;0.01 ）.The liver tissue structure was severely abnormal，and hepatocytesteatosis，nucleardisappearanceor pyknosis wereobserved.Comparedwiththemodelgroup，theaboveindexes inthehighdose，medium-doseUncariarhynchophylla-Gastrodiaelataherb-pairgroupsandthepositivecontrol groupweresignificantlydecreased （ Plt;0.01 ）.The liver tissue structure was partially normal，the necrosis of liver cells was reduced，the disappearance or fragmentationofucleuswasreducedorevenintact，andterewasnoinflammatorycellinfitrationandfatydegenerationWestern blotresultsshowedthatUncariarhynchophll-Gastrodiaelataherb-paircoulddown－regulate theexpresionofNF-kB，TLR4 andup-regulatetheexpresionofNf2.ConclusionUncariarhynchophylla-Gastrodiaelataherb-paircanpreventandtreat DLIvia NF-κB ，TLR4 and Nrf2 signaling pathways.

Key Words：Drug-InducedLiver Injury； Uncaria Rhynchophyll;；Gastrodia Elata;Liver Protection； Molecular Mechanism

藥物性的肝損傷（drug-induced liver injury，DILI），是一種在使用治療劑量藥物時，肝臟受到藥物或藥物代謝過程中所產生的代謝產物導致的毒性損傷或發(fā)生過敏反應所導致的肝臟損傷性疾病[1-2]。中藥具有副作用小，多成分、多靶點的優(yōu)點，是補充和替代醫(yī)學的重要組成部分，也越來越受到國內外人們的重視。根據(jù)經典平肝方“天麻鉤藤湯”（《小兒衛(wèi)生總微論方》卷五）可知，君藥鉤藤、天麻均入肝經，具有平肝清熱之功效，且對肝損傷導致的氧化應激、免疫應答及炎癥反應有抑制作用。鉤藤［Uncariarhynchophylla（Miq.）Miq.exHavil.]，為茜草科鉤藤屬帶鉤干燥莖枝，為廣西道地藥材之一，具有清熱平肝、息風定驚功效。研究3表明，鉤藤堿、槲皮素和山奈酚是鉤藤的有效組分之一，其中槲皮素具有抗炎、抗氧化、清除自由基的作用，為酪氨酸蛋白激酶抑制劑，是最常見的黃酮化合物之一。在氧自由基造成的肝損傷中，槲皮素具有顯著的治療與保護作用[4]。天麻（Gastrodia elataBl.），蘭科天麻屬根莖，可用于治療頭暈目眩、肢體麻木、小兒驚風等。天麻中的天麻素（Gastrodin），具有增加動脈血管順應性、降低外周血管阻力、改善心腦血管血流量、保護神經細胞、促進心肌細胞能量代謝的功能，同時具有護肝、清除自由基、增強免疫等作用[5]。而 NF-κB 、TLR4 和 Nrf2蛋白均為經典的調控肝損傷作用的蛋白，因此，鉤藤天麻藥對在治療DILI時是否可以通過該通路發(fā)揮作用具有一定的研究意義，同時研究也為鉤藤天麻藥對在治療DILI時的功效組分是否為槲皮素、山奈酚、天麻素以及后期代謝組學等奠定基礎。

雷公藤多苷是一種提取于衛(wèi)矛科植物雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook.f.）根部的含有萜內酯的脂溶性物質，具有抗炎及免疫抑制作用，同時其治療窗口較窄，具有較強的肝毒性。研究[6-7表明，溶血磷脂酰膽堿作為肝損傷的標志物，超劑量的雷公藤多昔可通過調節(jié)溶血磷脂酰膽堿的表達，從而促進炎癥反應、改變細胞膜通透性、影響?zhàn)じ揭蜃拥茸饔枚a生藥物性肝損傷。本實驗預以小鼠為研究對象，以中成藥雷公藤多昔片為造模劑，通過血清及肝組織進行抗氧化和抗炎作用驗證，并進行HE染色驗證其療效，Westernblot驗證 NF-κB/TLR4/Nrf2 信號通路對鉤藤天麻藥對治療DILI的分子機制，為藥物性肝損傷的臨床治療奠定了理論基礎。

1材料

1.1實驗動物雄性 SPF級BALB/c小鼠60只，鼠齡 53～56d ，購于三峽大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（鄂）2017-0012，動物飼養(yǎng)一周適應環(huán)境。

1.2藥物與試劑鉤藤（產地：廣西；批號：20042901），天麻（產地：貴州；批號：21012901），均購于廣西南寧市賓陽縣萬潤本草有限責任公司中藥飲片廠。按鉤藤：天麻 ε=2：1 的比例，加總質量10倍量水，回流提取 ^1h ，過濾后再加10倍量水進行二次提取，過濾并合并提取液，水浴濃縮，得浸膏備用。雷公藤多苷片（遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，批號：20201001），水飛薊賓膠囊（利加隆有限公司，德國，批號：B1903202）。丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、谷胱甘肽過氧化酶（ GSH-Px） 、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化脂質的含量（LPO）及 TNF-α 試劑盒，均購自南京建成生物科技有限公司。TLR4抗體（Affinity，AF7017）， NF-κB 抗體（Servicebio，GB11142），Nrf2 抗體（Abclonal，AO674），GAPDH，（abcam，ab8245），HRP抗體（KPL，074-1506）等。1.3儀器酶標檢測儀（廠家：USCNK，型號：SMR60047）；離心機（廠家：常州崢蝶儀器有限公司；型號：80-2）；恒溫水浴鍋（廠家：金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；型號： HH-420 ）；電泳儀（廠家：CA-VOY；型號：PP-1105）；冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，TGL-16）；掃描儀（廠家：EPSON；型號：L4158）；暗匣（廠家：廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司；型號：AX-II）； 0.45μm PVDF膜（廠家：Millipore；型號：IPVH00010）。

2方法

2.1分組與給藥SPF級雄性BALB/c小鼠60只，隨機分為6組，每組10只。3組為鉤藤天麻藥對組以及陽性對照組，空白對照組和模型組，采用不同劑量中藥（分別為 8.125g?kg^-1 、16.250g?kg^-1?d^-1 ！ 32.500g?kg^-1?d^-1? ，陽性對照藥（水飛薊賓 0.480g?kg^-1 ），空白對照組及模型組給予生理鹽水。灌胃 ^7d ，末次灌胃 ^2h 后，除空白對照組外，各組小鼠均單次給予20倍臨床劑量雷公藤多苷 0.300g?kg^-1 ，灌胃給藥（建立藥物性肝損傷模型）。

2.2血清測定ALT和AST活性灌胃造模 24h 后，摘眼球取血（ 1mL ，靜置 ^1h ， 4% 低溫離心15min ，取上層血清），按照試劑盒說明書溶解試劑，測試前室溫下平衡至少 30min 并根據(jù)試劑盒說明在 510nm 波長處進行ALT和AST的OD值測定。以絕對OD值（測定孔OD值減去對照孔OD值），查標準曲線，求相應的ALT/GPT或AST/GPT活力單位。

2.3肝組織測定MDA、SOD及 GSH-Px 含量取血后處死小鼠、取肝臟，加入生理鹽水研磨，按BCA法進行試劑溶解并離心取上清液，根據(jù)試劑盒說明分別測定MDA、SOD及 GSH-Px 的OD值。

2.4肝組織Elisa 測定LPO及 TNF-α 含量取肝組織，加人一定量的PBS，PH7.4，用勻漿器將標本勻漿充分。離心 20min 左右（ 2000～3000rpm， 取上清。按試劑盒說明以空白孔調零，在加終止液后 15min 以內于 450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

2.5肝組織切片并進行HE染色取各組小鼠肝臟，經甲醛固定、石蠟包埋、切片后，采用蘇木精和伊紅（HE）進行染色，觀察各組動物肝組織的形態(tài)變化。

2.6Westernblot法測定 NF-κB ，TLR4和Nrf2蛋白表達取各小鼠肝組織，加入RIPA裂解液（含苯甲基磺酰氟）勻漿，用BCA試劑盒測定并調整各組勻漿蛋白濃度。對蛋白質進行電泳，并通過10% 與 5% 的SDS-PAGE分離，后轉膜至PVDF膜上。將轉好的膜加入封閉液室溫封閉 ^1h ，除去封閉液，加入已稀釋好的一抗 4% 過夜；回收已稀釋的 NF-κB 、TLR4、Nrf2及GAPDH一抗，用TBST洗三次，每次 5min ；加入稀釋好的HRP-GoatantiRabbit二抗，室溫孵育 30min ，用TBST在室溫下?lián)u床上洗4次，每次 5min 。滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)?，暗室中曝光；根?jù)不同的光強度調整曝光條件，顯影、定影，最后將膠片進行掃描存檔，ImageJ軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的灰度值。

2.7數(shù)據(jù)分析實驗結果以均數(shù)加減標準差（ ±s ）表示，采用GraphPadPrismV9.O軟件進行計算、處理，統(tǒng)計學方法采用單因素方差分析及 檢驗， Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3結果

3.1血清中ALT、AST的活性與空白對照組比較，模型組中的ALT、AST水平均顯著升高（ Plt; 0.01），表明本次復制藥物性肝損傷模型成功。與模型組比較，鉤藤天麻藥對高、中劑量組及陽性對照組的ALT、AST水平均顯著降低（ Plt;0.01 ），鉤藤天麻藥對低劑量組的AST水平有差異（ Plt;0.05 ）。與陽性對照組比較，鉤藤天麻藥對高劑量組的ALT、AST含量也顯著降低（ Plt;0.05） ，表明高劑量的鉤藤天麻藥對的護肝作用優(yōu)于陽性藥組。

3.2肝組織中SOD、MDA、 GSH-Px 與空白對照組比較，模型組、鉤藤天麻藥對組及陽性對照組中的SOD、 ΔMDA 、 GSH-Px 水平均顯著升高（ P lt;0.01 ）；與模型組比較，鉤藤天麻藥對高、中劑量組及陽性對照組的 sop 、MDA、 GSH-Px 水平均顯著降低（ Plt;0.01. ，鉤藤天麻藥對低劑量組的MDA水平有差異（ Plt;0.05 ）；與陽性對照組比較，鉤藤天麻藥對高劑量組的MDA含量也顯著降低（ Plt;0.05， ，表明高劑量的鉤藤天麻藥對的抗氧化作用優(yōu)于陽性藥組。

3.3肝組織進行Elisa測定LPO及 TNF-α 含量與空白對照組和模型組比較，鉤藤天麻藥對低、中劑量組及陽性對照組的LPO、 TNF-α 含量均顯著升高（ Plt;0.01 ）；高劑量組與空白對照組比較，鉤藤天麻藥對高劑量組的LPO、 TNF-α 含量有差異（ Plt;0.05 ）；與陽性對照組比較，鉤藤天麻藥對高劑量組的TNF- ∝ 含量也顯著降低（ Plt; 0.05），表明造模成功且護肝方高劑量組的治療作用優(yōu)于其他劑量組。

3.4HE染色結果HE染色的結果表明，空白對照組小鼠的肝組織結構基本正常，肝小葉結構清晰，肝細胞結構完整，胞核清晰，胞質豐富，未見壞死和變性，如圖1（A）所示。模型組小鼠的肝組織結構重度異常，如圖1（B）所示，部分肝細胞脂肪變性，可見大小不一的脂滴，如箭頭所指；胞核消失或固縮深染，如橢圓圈出部位。低劑量組小鼠的肝組織結構中度異常，如圖1（C）所示，部分肝細胞壞死，胞核消失或碎裂，如橢圓圈出部位；未見炎癥細胞浸潤和脂肪變性。中劑量組小鼠的肝組織結構中度異常，如圖1（D）所示，部分肝細胞脂肪變性，可見大小不一的脂滴，如箭頭所指；部分肝細胞壞死，如橢圓圈出部位。高劑量組小鼠的肝組織結構輕度異常，如圖1（E）所示，個別肝細胞壞死，胞核消失或碎裂，如箭頭所指；肝實質內未見明顯炎癥細胞浸潤；肝竇未見擴張。陽性對照組小鼠的肝組織結構輕度異常，如圖1（F）所示，部分肝細胞壞死，胞核消失或碎裂，如箭頭所指；未見明顯炎癥細胞浸潤。

3.5Westernblot分析 NF-κB ，TLR4和Nrf2蛋白表達結果通過Westernblot檢測鉤藤天麻藥對對雷公藤多苷片所致DILI各組小鼠肝組織中NF-κB ，TLR4和Nrf2蛋白的影響，結果如圖2所示。結果顯示，與空白對照組比較，模型組的 NF-κB 和TLR4蛋白表達顯著上升，Nrf2蛋白表達明顯下降。與模型組比較，中劑量組、高劑量組以及陽性對照組的 NF-κκB 和TLR4蛋白表達顯著下調，Nrf2蛋白表達則明顯上升。表明，中劑量及高劑量的鉤藤天麻藥對可以通過抑制 NF-κB 信號通路，減少炎癥因子的產生而起到抗炎作用，同時抑制TLR4信號通路而激活機體免疫應答，誘導Nrf2通路來增強機體抗氧化應激反應。

注：與空白對照組比較， 0.01lt;Ω^*Plt;0.05 ；與空白對照組比較， ^**Plt;0.01 ；與模型組比較， 0.01lt;^#Plt;0 .05；與模型組比較， ^##Plt;0.01 。

4討論

藥物性肝損傷是一種與給藥劑量或給藥種類相關的肝臟毒性臨床反應，比如抗結核藥、抗生素或抗風濕藥等。由于其與治療作用并行及不可預測性，備受醫(yī)生和患者關注。根據(jù)血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、游離和結合膽汁酸及甘油磷脂的變化，臨床常將DILI分為肝細胞型、膽汁淤積型和混合型[8]。與常見西藥相比，中藥具有毒副作用小等作用，但同時，在中藥復方治療藥物性肝損傷方面，也因為中藥復方的組分復雜，不可控因素多，研究與應用一直十分受限，臨床中應用較多的有復方益肝靈膠囊和茵梔黃注射液。研究表明，復方益肝靈膠囊可以降低轉氨酶、穩(wěn)定肝細胞膜、抑制肝細胞壞死，增進肝細胞再生，減弱脂肪變性，從而達到保護肝臟及解毒作用。而茵梔黃注射液則可用于急性、慢性肝炎，遷延性重癥肝炎，能明顯抑制肝細胞炎性病變，調節(jié)肝內微循環(huán)，對藥物性肝損傷具有保護作用[1]。但是這些中藥復方的分子機制尚未明確，仍需要進一步驗證。

槲皮素作為鉤藤的有效組分之一，均具有抗炎、抗氧化、清除自由基的作用，在對乙酰氨基酚所致的藥物性肝損傷中，槲皮素通過下調轉錄因子 NF-κB 及抑制促炎因子 TNF-α 、IL-6和IL-1β ，上調氧化應激轉錄因子Nrf2從而達到抗炎、保肝作用及抗氧化作用[11]。在炎性反應中，山奈酚可以通過TLR4、 NF-κB 和STAT信號通路下調 TNF-α 、 IL-1β 、Ⅱ-6等因子，從而抑制炎癥的發(fā)生[12]。天麻素是一種酚類葡萄糖苷，是天麻的有效組分之一，可以通過抑制TLR4/ASK1信號通路，降低炎癥因子 IL-1β 、IL-6及TNF-α 水平，減少粒細胞浸潤，減輕炎性損傷[13]。而NF-κB （nuclear factor - κB ）是一種炎癥基因的核轉錄因子，在肝組織中參與調控炎性反應、氧化應激、肝細胞凋亡和發(fā)展作用[14]。Toll樣受體（TLR4）能識別病原相關分子模式和損傷相關分子模式，激活 NF-κB ，影響炎癥因子活性，增加炎性反應。核因子E2相關因子2（nuclearfactorNF-E2-relatedfactor2，Nrf2）具有抗氧化、抗炎、抗纖維化及抗細胞凋亡能力等作用。

本結果顯示，與模型組比較，鉤藤天麻藥對治療組的ALT、AST、SOD、MDA、GSH-PX、LPO 及 TNF- ∝ 水平均顯著降低，表明，鉤藤天麻藥對可以通過下調 NF-κB 、上調Nrf2而對雷公藤多苷片所致的炎癥反應、氧化應激反應具有顯著的抑制作用，同時，通過激活TLR4信號通路來發(fā)揮免疫應答作用來達到預防和治療藥物性肝損傷作用。本實驗前期采用昆明小鼠進行試驗，發(fā)現(xiàn)其耐受力差，故更換為BALB/c小鼠。在造模條件探究階段，采用雷公藤多苷片臨床劑量的20倍量一次性灌胃給藥，小鼠出現(xiàn)精神萎靡甚至死亡現(xiàn)象，為胃部溶脹過度原因，故改用間隔6h分兩次給藥，ALT、AST及HE染色結果顯示造模成功。而治療劑量的硫普羅寧陽性對照藥，治療作用不顯著，故改為水飛薊賓根據(jù)臨床劑量換算為 0.480g?kg^-1 。綜上所述，由鉤藤、天麻藥對可通過調控 NF-κB/TLR4/Nrf2 信號通路來誘導抗炎、抗氧化及免疫應答反應，具有顯著的預防和治療藥物性肝損傷作用，為中藥復方治療藥物性肝損傷及鉤藤-天麻藥對代謝組學研究提供科學依據(jù)。

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