高劑量鞣花酸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)壽命及生理指標(biāo)的影響

中圖分類(lèi)號(hào)：Q418 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI： 10.19907/j. 0490-6756.250058

Effects of high dose ellagic acid on the lifespan and physiological parametersofCaenorhabditis elegans

YANGHua1，YANXin1，SHIHao1，CHENYi-Ping1，ZHUHan-Sheng， HUANG Chang- Yi^r ，WANGJia1，WANG Song-Tao2，LI Shu2，ZAHO Jian

（1.Key Laboratoryof Microbiological Resources and Biotechnologyof Sichuan Province，CollgeofLife Sciences，

Sichuan University，Chengdu 6loo64，China；2.Luzhou Pinchuang Technology Co.，Ltd./National Engineering Research Center of Solid-State Brewing，Luzhou 646OOO，China）

Abstract： In order to investigate the effects of high-dose ellagic acid （EA） on the lifespan，growth ability，reproductive capacity，pharyngeal pumping frequency，and mobility of Caenorhabditis elegans （C. elegans）， nematodes were randomly assgned to a blank control group or experimental groups treated with varying concentrations （0.025～1mg/mL ）of 24% or 81% purity EA，under standard culture condition at 20^°C .The results showed that both 24% and 81% EA significantly reduced the mean lifespan and reproductive capacity of nematodes in a concentration- and purity-dependent manner，with higher doses and purities exerting stronger inhibitory efects.However，EA treatment had no significant efect on the growth of adult nematodes.In terms of pharyngeal pump and mobility，the 24% EA and 81% EA concentration groups were consistent with the blank control group，showing an age-dependent decline. EA had no significant efect on pharyngeal pumping frequency，but high-dose 81% EA（ 1mg/mL ）can accelerate the decrease of the movement ability of nematodes. The results showed that high dose of ellagic acid could shorten lifespen of nematodes and affect the related physiological parameters of nematodes，highlighting potential risks associated with excessive EA intake.

Keywords： High dose ellagic acid; Caenorhabditis elegans; Lifespan; Physiological parameters

1引言

鞣花酸是一種天然多酚類(lèi)物質(zhì)，不僅存在于石榴和草莓等各種水果中，同時(shí)也存在于核桃和開(kāi)心果等各種堅(jiān)果中[1]，具有很強(qiáng)的抗氧化性[2]、抗炎3、抗病毒感染4和保肝5等生物學(xué)功能.根據(jù)自由基學(xué)說(shuō)[6，鞣花酸可以通過(guò)激活抗氧化相關(guān)途徑來(lái)清除自由基從而可達(dá)到抵抗衰老的作用.然而由于EA的大量攝入，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞存在一定潛在的毒性，王東等研究表明高劑量EA對(duì)HEK-293細(xì)胞存在損傷作用，使得細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高，氧化性損傷標(biāo)志性產(chǎn)物增多，造成細(xì)胞DNA損傷； 15～240μmol/L 的EA對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠B14細(xì)胞的研究也表明對(duì)細(xì)胞具有潛在的毒性作用，甚至在濃度為 15μmol/L 時(shí)也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，而濃度在 60μmol/L 時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷到達(dá)最大，使細(xì)胞存活率降到 50% ；盛夢(mèng)圓9研究高劑量的EA對(duì)HK-2細(xì)胞線(xiàn)粒體功能的影響，結(jié)果表明 50～200 μmol/L 的EA會(huì)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞活性氧升高，從而導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，線(xiàn)粒體膜電位下降，線(xiàn)粒體自噬障礙，以及細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生.在亞慢性毒性研究中發(fā)現(xiàn)，在喂食9Od的EA之后，雄性大鼠無(wú)明顯變化，而在雌性大鼠中觀(guān)察到體重輕微減輕，并呈劑量依賴(lài)性，以上研究都表明高劑量的EA存在一定的毒性作用[10].因此，本研究通過(guò)探究高劑量的EA對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)的影響，為評(píng)估其對(duì)人類(lèi)健康的潛在危害提供一定的理論依據(jù).

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（Caenorhabditiselegans，C.el-egans）在1974年首次被引入作為分子和發(fā)育生物學(xué)的模式生物[1]，與傳統(tǒng)動(dòng)物模型相比，存在著許多的優(yōu)點(diǎn)，有著超過(guò) 65% 與人類(lèi)疾病相關(guān)的基因[12]，生命周期短、保守的細(xì)胞和分子結(jié)構(gòu)、易于觀(guān)察培養(yǎng)和個(gè)體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，使其成為研究人類(lèi)疾病的理想模式生物，也成為研究衰老的首要模型[13].在衰老相關(guān)的研究中，除了通過(guò)直接比較C.elegans的壽命長(zhǎng)短來(lái)評(píng)估衰老過(guò)程外，還可以通過(guò)觀(guān)察其隨年齡增長(zhǎng)所呈現(xiàn)的多項(xiàng)生理指標(biāo)的變化來(lái)進(jìn)行表征.具體而言，隨著線(xiàn)蟲(chóng)年齡的增大，其活動(dòng)性逐漸減弱，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)頻率降低、身體擺動(dòng)的協(xié)調(diào)性變差，同時(shí)吞咽食物的速度也出現(xiàn)明顯的下降14.如Kim等15研究了微生物群衍生的代謝物3-苯乳酸對(duì)C.elegans中的線(xiàn)粒體功能和壽命的影響；王萌萌等16研究了川續(xù)斷對(duì)阿爾茨海默病C.elegans模型作用機(jī)制；李姝等[17]研究了 β -煙酰胺單核苷酸對(duì)C.elegans生長(zhǎng)的影響及其作用機(jī)制.

基于此，本研究以C.elegans作為動(dòng)物模型，探究高劑量的EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響，旨在為EA的安全劑量設(shè)計(jì)和衰老干預(yù)策略提供理論基礎(chǔ).

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（Caenorhabditiselegans，C.el-egans）野生型N2和大腸桿菌（Escherichiacoli，E.col）尿嘧啶缺陷型OP50由提供．

純度為 24% 和 81% 鞣花酸，由實(shí)驗(yàn)室從石榴皮中提取的；膽固醇，北京索萊寶科技有限公司；LB肉湯、LB瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；5-氟 -2^′ -脫氧尿嘧啶核苷（floxuridine，F(xiàn)UDR），美國(guó)Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑、TBGreen，寶生物工程（大連）有限公司；其余生化試劑（分析純），成都金山化學(xué)試劑有限公司.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1線(xiàn)蟲(chóng)常規(guī)培養(yǎng)將平板上的線(xiàn)蟲(chóng)以 3mL M9緩沖液18洗下，并轉(zhuǎn)移至 15mL 離心管中，2500r/min 離心 2min ，棄去上清，保留管底約150μL 液體，移液槍吹吸混勻后接種于線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基NGM-OP5[18]上至發(fā)育成懷卵線(xiàn)蟲(chóng)為止（直至平板上出現(xiàn)大量的卵即可）[18].

2.2.2線(xiàn)蟲(chóng)同步化將 9cm 平板上已發(fā)育至成蟲(chóng)的懷卵線(xiàn)蟲(chóng)以 3mLM9 緩沖液洗下，并轉(zhuǎn)移至15mL 離心管中，使其最終體積約為 2.8mL ，按順序依次加入次氯酸鈉原液 0.8mL，5mg/mL NaOH溶液 0.4mL ，來(lái)回顛倒混勻數(shù)次后，置于離心機(jī)中 5500r/min 離心 1min ，棄上清.在無(wú)菌條件下，加入 4mL M9緩沖液，混勻后 5500r/min 再次離心 1min ，棄上清.隨后加入 4mL M9緩沖液，吹吸混勻后將含蟲(chóng)卵的液體轉(zhuǎn)移至 3.5cm 的空培養(yǎng)皿中， 20°C 過(guò)夜孵化[18].

2.2.3待測(cè)樣品的制備以 1% DMSO作為溶劑（即空白對(duì)照），配制 2.5mg/mL 的 24% 和 81% 的鞣花酸母液，并按照倍比稀釋法配制成不同濃度的鞣花酸溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品濃度為 1mg/mL 、0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.025mg/mL^[19]

2.2.4線(xiàn)蟲(chóng)壽命實(shí)驗(yàn)取 6cm 平血，每血中加入約 5mLNGM 培養(yǎng)基，室溫放置過(guò)夜備用.所有野生型秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)N2均依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程以大腸桿菌OP50作為食物來(lái)源于 20^°C 下進(jìn)行培養(yǎng)．為了排除待測(cè)樣品對(duì)OP50生長(zhǎng)以及OP50代謝待測(cè)樣品所帶來(lái)的影響，將過(guò)夜生長(zhǎng)的OP50離心后重懸于M9緩沖液中， 65^°C 加熱 30min ，至于一 20^°C 保存?zhèn)溆?

每次轉(zhuǎn)移線(xiàn)蟲(chóng)之前，取 100μL 備用的OP50（ 8.5×10⁸ CFU/mL）均勻涂布在 6cm 的NGM平板上，室溫放置過(guò)夜.隨后吸取 100μL 不同濃度鞣花酸樣品及空白對(duì)照（ 1% DMSO）均勻涂布在含OP50-NGM的平板上，自然干燥后備用.

采用次氯酸鈉、NaOH溶液使線(xiàn)蟲(chóng)同步化，收集同步化后的L1期線(xiàn)蟲(chóng) 8000r/min 離心 10min 離心管底留液體適量，渦旋后取 5μL 至平板蓋上于體式顯微鏡下計(jì)數(shù)，將過(guò)夜孵化的L1期線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至含有預(yù)先加人不同濃度待測(cè)樣品或 1% DMSO及表面涂布有OP50的NGM平板中.待線(xiàn)蟲(chóng)長(zhǎng)至L4期，按照不同組別及以每 6cm 平皿中30條線(xiàn)蟲(chóng)的比例進(jìn)行隨機(jī)分配轉(zhuǎn)移（每組3個(gè)平行）.將L4期的線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至同時(shí)加有終濃度為 40μmol/L 5^′. -氟脫氧尿苷（FUDR）的NGM中培養(yǎng)2d，以防止生殖.隨后將線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至無(wú)FUDR的NGM平板中．以線(xiàn)蟲(chóng)成年的第1d記為day1，線(xiàn)蟲(chóng)成年后需每天將其轉(zhuǎn)移至新鮮NGM中，成年5d后每2d將其轉(zhuǎn)移至新鮮NGM中（保證線(xiàn)蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)充足且保證實(shí)驗(yàn)中的線(xiàn)蟲(chóng)是同一代，避免由于雌性線(xiàn)蟲(chóng)與雄性線(xiàn)蟲(chóng)交配影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）. 20°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每次轉(zhuǎn)移時(shí)記錄線(xiàn)蟲(chóng)的存活、死亡（無(wú)移動(dòng)或吞咽，輕觸后無(wú)反應(yīng)）及剔除條數(shù)（爬到培養(yǎng)血上干涸而死、蟲(chóng)卵在體內(nèi)孵化、鉆入瓊脂或逃逸），直至所有線(xiàn)蟲(chóng)死亡為止[20].

2.2.5線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置 1% DMSO空自對(duì)照組和鞣花酸實(shí)驗(yàn)組 （0.025mg/mL，0.05mg/ mL.0.1mg/mL.1mg/mL） .與壽命檢測(cè)同步進(jìn)行，于生存天數(shù)的第12d測(cè)1次，每組隨機(jī)挑選至少 7～13 條線(xiàn)蟲(chóng)在顯微鏡下進(jìn)行線(xiàn)蟲(chóng)長(zhǎng)度的測(cè)量[21-22].

2.2.6線(xiàn)蟲(chóng)生殖能力檢測(cè)設(shè)置 1% DMSO空白對(duì)照組和鞣花酸實(shí)驗(yàn)組 （0.025mg/mL，0.05 mg/mL.0.1mg/mL.1mg/mL） .隨機(jī)挑取L4期線(xiàn)蟲(chóng)（前期處理同壽命實(shí)驗(yàn)）轉(zhuǎn)移到新鮮NGM板中（每板10條線(xiàn)蟲(chóng)，每組3個(gè)平行），每隔1d轉(zhuǎn)移1次，直至生殖期結(jié)束.每次產(chǎn)卵后對(duì)蟲(chóng)卵直接計(jì)數(shù)，計(jì)算10條線(xiàn)蟲(chóng)每天及總的產(chǎn)卵量[23].

2.2.7線(xiàn)蟲(chóng)咽泵頻率檢測(cè)設(shè)置 1% DMSO空白對(duì)照組和鞣花酸實(shí)驗(yàn)組 （0.025mg/mL，0.05 mg/mL.0.1mg/mL.1mg/mL） .與壽命檢測(cè)同步進(jìn)行，每次檢測(cè)隨機(jī)挑選至少5條線(xiàn)蟲(chóng)（每組3個(gè)平行）在顯微鏡下記錄15s內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)吞咽的次數(shù)[23].2.2.8線(xiàn)蟲(chóng)移動(dòng)能力檢測(cè)參照壽命檢測(cè)設(shè)置1% DMSO空白對(duì)照組和鞣花酸實(shí)驗(yàn)組（0.025mg/mL_?0.05mg/mL_?0.1mg/mL_?1mg/mL） .每次檢測(cè)隨機(jī)選取約5條線(xiàn)蟲(chóng)（每組3個(gè)平行）滴入1滴M9緩沖液，在顯微鏡下記錄20s線(xiàn)蟲(chóng)身體來(lái)回?cái)[動(dòng)的次數(shù)[24].

2.2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用GraphPadPrism8.0軟件對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，圖表中各組間的顯著性差異用星號(hào)表示， Plt; 0. 05 表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1高劑量的EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響

為探究高劑量的EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響，采用0.025～1mg/mL 的 24% EA、 81% EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的作用效果進(jìn)行了評(píng)估，由表1和圖1可知，不同濃度的 24%EA，81% EA都可以抑制線(xiàn)蟲(chóng)的壽命，且隨著處理濃度的增加，對(duì)壽命的抑制更加顯著．與空白對(duì)照組相比，處理組線(xiàn)蟲(chóng)的平均壽命及中位生存時(shí)間均低于對(duì)照組，隨著 24%EA，81%

EA各組處理濃度的增加，線(xiàn)蟲(chóng)平均壽命降低的百分比整體呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，且 81% EA各處理組線(xiàn)蟲(chóng)的平均壽命總體上低于 24% EA各處理組線(xiàn)蟲(chóng)的平均壽命（表1）.對(duì)比 24% EA與 81% EA同一濃度各處理組發(fā)現(xiàn)，在低濃度處理時(shí) （0.025mg/）

mL，0.05mg/mL ，兩者差異不顯著，在高濃度處理時(shí) （0.1mg/mL，1mg/mL） ， 81% EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的抑制效果更顯著（圖1）.以上結(jié)果表明，高劑量的EA可顯著抑制線(xiàn)蟲(chóng)壽命，且隨著EA處理濃度和純度的增加，抑制效果越顯著.

3.2高劑量的EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)的影響

體長(zhǎng)是衡量線(xiàn)蟲(chóng)個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育常見(jiàn)的指標(biāo)之二[25].為研究高劑量的EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響，采用 0.025～1mg/mL 的 24%EA，81% EA喂食線(xiàn)蟲(chóng)，在第12d對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的長(zhǎng)度進(jìn)行了測(cè)定.由表2可知，在12d時(shí)，相比于對(duì)照組，同一純度不同濃度或同種濃度不同純度EA處理對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的體長(zhǎng)均無(wú)顯著影響，表明EA并不會(huì)影響線(xiàn)蟲(chóng)的正常生長(zhǎng).

3.3高劑量的EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生殖能力的影響

相關(guān)研究表明，壽命與生殖能力有著一定的變化關(guān)系[26].通過(guò)喂食線(xiàn)蟲(chóng) 0.025～1mg/mL 的24% EA、 81% EA，評(píng)估其對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生殖能力的影響.結(jié)果表明其生殖高峰期與空白對(duì)照組一致，集中在3～5d，以第3d最多，并隨著線(xiàn)蟲(chóng)年齡的增長(zhǎng)，產(chǎn)卵量逐漸降低（圖2）.此外，實(shí)驗(yàn)組中所有劑量EA處理組線(xiàn)蟲(chóng)的日產(chǎn)卵量均低于對(duì)照組， 24% EA實(shí)驗(yàn)組處理后線(xiàn)蟲(chóng)每日產(chǎn)卵量較小，不同濃度差異不明顯， 81% EA實(shí)驗(yàn)組處理后，隨EA處理濃度增加，線(xiàn)蟲(chóng)每日產(chǎn)卵量呈下降趨勢(shì)（圖2）.不同濃度 24% EA、 81% EA處理線(xiàn)蟲(chóng)后，線(xiàn)蟲(chóng)總產(chǎn)卵量雖然均降低，呈正偏態(tài)分布，但產(chǎn)卵量總體較小，實(shí)驗(yàn)組相較于對(duì)照組均無(wú)顯著性差異（圖3）.以上結(jié)果表明，EA可抑制線(xiàn)蟲(chóng)的生殖能力，且隨EA處理濃度增加，抑制效果更明顯．

3.4高劑量的EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)咽泵頻率的影響

除生殖能力之外，線(xiàn)蟲(chóng)的咽泵頻率也被認(rèn)為是衰老的重要標(biāo)志[27].觀(guān)察 0.025～1mg/mL 的24%EA，81% EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)咽泵頻率的影響.由圖4可知，隨著線(xiàn)蟲(chóng)年齡的增長(zhǎng)，空白對(duì)照組、 24% EA、 81% EA各濃度處理組線(xiàn)蟲(chóng)的咽泵頻率總體上均逐步降低；對(duì)比相同時(shí)間內(nèi)，各濃度EA處理組的咽泵頻率相較于對(duì)照組均無(wú)顯著性差異，在第13d與第31d，不同處理組下線(xiàn)蟲(chóng)咽泵頻率無(wú)明顯變化規(guī)律；在第28d時(shí)， 81% EA處理組線(xiàn)蟲(chóng)咽泵頻率低于 24% EA處理組，但各組之間差異不顯著，表明不同純度EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)咽泵頻率影響較小.

Thereisa significantdifference between different experimental groups，with *** Plt;0.001

3.5高劑量的EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)移動(dòng)能力的影響

線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力與機(jī)體肌肉群息息相關(guān)，直觀(guān)反映了其生長(zhǎng)的健康狀態(tài)，所以通過(guò)加入 0.025～ 1mg/mL 的 24%EA，81% EA在第1、4、7、13、28和31d觀(guān)察對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)移動(dòng)能力的影響．如圖5所示，空白對(duì)照組、 24%EA，81% EA各濃度處理組線(xiàn)蟲(chóng)的移動(dòng)能力隨著線(xiàn)蟲(chóng)年齡的增長(zhǎng)總體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；其中，第7d時(shí)，EA各濃度處理組線(xiàn)蟲(chóng)的移動(dòng)能力均低于空白對(duì)照組，隨著EA處理濃度的增加，對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)移動(dòng)能力的抑制更明顯.而在第13d開(kāi)始，由于線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力下降明顯，各實(shí)驗(yàn)組相較于對(duì)照組均無(wú)顯著性差異（圖5）.以上結(jié)果表明，高劑量的EA在一定程度上可抑制線(xiàn)蟲(chóng)的移動(dòng)能力，且隨EA處理濃度增加，抑制效果更明顯.

24% EA 0.1mg/mL 組因線(xiàn)蟲(chóng)移動(dòng)能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)染菌情況導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)異常，因而不計(jì)入結(jié)果與討論中，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異， ^*Plt;0.05 **Plt;0.01

The 24% EA 0.1mg/mL group showed abnormal results due to bacterial contamination during the nematode mobility detection experiment，andthereforewasnotincludedintheresultsanddiscusion.Comparedwiththeblankcontrolgroup，therewasasignifi cant difference， ^*Plt;0.05 . **Plt;0.01

4討論

本研究以秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)為模型，主要研究了不同純度（ 24% 與 81% EA）以及濃度 （0.025～1 mg/mL ）對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的壽命及生理指標(biāo)的影響，揭示了鞣花酸在一定濃度下會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)蟲(chóng)壽命縮短，并導(dǎo)致生殖能力下降和移動(dòng)能力降低，而對(duì)體長(zhǎng)和咽泵無(wú)影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果中EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的體長(zhǎng)和咽泵無(wú)影響，與李金澤在EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的抗衰老作用及其機(jī)制的研究結(jié)果相似，表明EA并不會(huì)影響線(xiàn)蟲(chóng)的正常生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)食物的攝取量28；但在本研究中，EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的抑制作用，并伴隨生理指標(biāo)（運(yùn)動(dòng)能力和生殖能力）的下降，與以往研究中EA作為天然抗氧化劑通常表現(xiàn)出有益效應(yīng)的結(jié)果存在差異[29]，分析可能由于鞣花酸濃度過(guò)高、暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和物種代謝差異導(dǎo)致的.

EA在低濃度 （100μmol/L） 下可以通過(guò)胰島素/IGF-1信號(hào)通路激活抗衰老機(jī)制，上調(diào)了daf-16、hlh-30、skn-1、hsf-1等長(zhǎng)壽調(diào)控相關(guān)基因的活性，并且進(jìn)一步誘導(dǎo)下游的抗氧化應(yīng)激基因和解毒基因sod-3、gst-4、hsp-16.2的表達(dá)水平的上調(diào)[30]，從而增強(qiáng)了線(xiàn)蟲(chóng)的氧化損傷修復(fù)能力，最終延長(zhǎng)了線(xiàn)蟲(chóng)的壽命，并降低衰老相關(guān)功能障礙的發(fā)生率.EA可通過(guò)不同的分子機(jī)制來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞毒性自噬的激活等方式發(fā)揮抗腫瘤作用，效果顯著[31].然而在高濃度下可能引發(fā)過(guò)多的活性氧積累，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、DNA損傷、衰老標(biāo)志物的上調(diào)以及細(xì)胞線(xiàn)粒體活性氧產(chǎn)生增多，線(xiàn)粒體自噬發(fā)生障礙[9].而線(xiàn)粒體發(fā)生功能障礙會(huì)進(jìn)一步引發(fā)許多不良后果，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、酶體降解以及神經(jīng)元功能障礙[32.在線(xiàn)蟲(chóng)移動(dòng)能力檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)在第7d時(shí)用 81% 0.05mg/mLEA（134μmol/L） 以及更高劑量的EA處理時(shí)，線(xiàn)蟲(chóng)的移動(dòng)能力下降明顯，而長(zhǎng)期暴露可能加重這種效應(yīng)9，在線(xiàn)蟲(chóng)壽命檢測(cè)中，可能導(dǎo)致所有劑量的EA都縮短了線(xiàn)蟲(chóng)的壽命.同樣研究表明 EA^[8] 對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞（B14）具有遺傳毒性和細(xì)胞毒性特性，用15～240μmol/LEA處理Bl4后，結(jié)果顯示所有濃度都會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，細(xì)胞活力下降，但是不形成濃度依賴(lài)作用，而本研究中所有劑量（ （19.9～2680 μmol/L 線(xiàn)蟲(chóng)生殖能力下降可能與此類(lèi)遺傳毒性相關(guān)，線(xiàn)蟲(chóng)生殖腺細(xì)胞對(duì)DNA損傷高度敏感，高劑量的EA可能通過(guò)激活ced-3和ced-4來(lái)誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡導(dǎo)致生殖力衰退[33].此外，運(yùn)動(dòng)能力下降與神經(jīng)肌肉系統(tǒng)受損有關(guān)，可能涉及多巴胺能神經(jīng)元退化或肌肉細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)[34].

綜合線(xiàn)蟲(chóng)的壽命及生理指標(biāo)分析可知，高劑量的EA存在潛在的毒性，可抑制線(xiàn)蟲(chóng)的壽命并在一定程度上影響線(xiàn)蟲(chóng)的相關(guān)生理指標(biāo).EA由于對(duì)致癌和誘變的化學(xué)預(yù)防活性，被稱(chēng)為天然的抗氧化劑[35]，然而也存在一些潛在的毒性作用.本研究主要集中在高劑量EA對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命及生理指標(biāo)的影響，但并未深入探討EA的具體分子機(jī)制.因此，未來(lái)的研究需結(jié)合RNA-seq篩選EA毒性相關(guān)通路，明確EA作用靶點(diǎn)；此外，需通過(guò)LC-MS定量分析線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)EA及其代謝物濃度，比較不同純度組的生物轉(zhuǎn)化差異，并評(píng)估尿石素類(lèi)代謝產(chǎn)物的貢獻(xiàn).研究抗氧化劑最佳的作用濃度具有重要價(jià)值，旨在利用EA的有益特性，將其應(yīng)用于治療中.

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