基于諾如病毒樣顆粒和 SpyCatcher/SpyTag系統(tǒng)的IL-10遞送平臺(tái)構(gòu)建

中圖分類號(hào)：Q819 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19907/j.0490-6756.250019

Construction of an IL-10 delivery platform based on Norovirus-like particles and the SpyCatcher/SpyTag system

BAI Jing，MA Yan-Bing （Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences/Beijing Union Medical Colge， Kunming ，China）

Abstract： IL-1O was an immunomodulatory cytokine with dual functions that plays a crucial role in tumor immunity. In this study，a delivery platform for IL-1O based on norovirus-like particles（NoV-VLP） and SpyCatcher/SpyTag system was developmented，and its anti-tumor eficacy was evaluated.The results showed that VLP-IL1O significantly suppressed tumor growth and enhanced IFN- γ response in a mouse tumor model，showing superior antitumor activity compared with free IL-1O.In vio imaging further confirmed that VLP-IL10O had enhanced lymph nodes targeting and retention capabilities relative to free IL-1O.Through the analysis of dendritic cells in lymph nodes，it was found that VLP-IL1O could better activate the maturation of dendriticcells compared with free IL-1O，and betterachieve theactivationof effector Tcells，thereby facilitating tumors immunotherapy.To address the technical bottleneck of the low expression eficiency of the SpytagIL10 fusion protein，a Trigger Factor（TF） tag was introduced，which markedly improved IL-1O expression level. Overall，the stabilityand targeting of IL-1O delivery was improved by this platform，demonstrating the potential application of virus-like particle-based IL-1O delivery in tumor immunotherapy. Keywords： IL-1O; VLP; SpyCatcher/SpyTag; Tumor immunotherapy; Cytokine delivery

1引言

IL-10是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，其在腫瘤免疫中的作用具有雙重性[1].一方面，IL-10通過抑制促炎因子的產(chǎn)生和抗原提呈細(xì)胞的功能，導(dǎo)致免疫抑制狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸和生長(zhǎng)2.另一方面，IL-1O也顯示出免疫刺激作用，能夠增強(qiáng) CD8+T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性，促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)[24].近年來，研究人員嘗試?yán)肐L-1O的免疫調(diào)節(jié)特性開發(fā)新的腫瘤治療策略.例如，通過基因工程改造，設(shè)計(jì)表達(dá)IL-1O的嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞），以增強(qiáng)其在腫瘤微環(huán)境中的功能.這些IL-1O表達(dá)的CAR-T細(xì)胞在多種腫瘤模型中顯示出增強(qiáng)的抗腫瘤活性，提供持久的抗腫瘤免疫力5.同時(shí)在某些情況下，低水平的IL-10有助于維持免疫穩(wěn)態(tài)，防止過度炎癥對(duì)機(jī)體的損傷.更值得關(guān)注的是，IL-10的免疫調(diào)節(jié)特性已成為腫瘤免疫治療的新切入點(diǎn)[6.通過基因工程改造，科學(xué)家成功開發(fā)出具有免疫激活功能的IL-10突變體[47]，這些突變體能夠增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，展現(xiàn)出作為腫瘤治療手段的潛力.但是由于單獨(dú)的IL-10分子在體內(nèi)半衰期短，沒有良好的靶向性，探索一個(gè)良好的IL-10細(xì)胞因子的遞送平臺(tái)具有一定的意義.

牛津大學(xué)的MarkHowarth團(tuán)隊(duì)在2012年的PNAS上發(fā)表了一種新型的體外共價(jià)鍵組裝方法，被稱為SpyCatcher/SpyTag系統(tǒng)[8].SpyCatcher和SpyTag之間通過側(cè)鏈氨基形成共價(jià)異肽鍵，從而實(shí)現(xiàn)分子間的穩(wěn)定連接．研究表明，SpyCatcher/SpyTag系統(tǒng)是一種經(jīng)過驗(yàn)證的高效平臺(tái)，利用分子間共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)抗原或靶向分子的遞送[8-10].病毒樣顆粒（VLP）因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的安全性，已被證明是癌癥疫苗開發(fā)的理想平臺(tái).在癌癥疫苗設(shè)計(jì)中，高效呈遞腫瘤相關(guān)抗原至關(guān)重要，而VLP憑借其高靶向性和穩(wěn)定性，在抗原遞送方面展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)[11-13].VLP這種結(jié)構(gòu)不僅保留了與傳染性病毒相似的抗原特性，還因不含病毒核酸而完全無傳染性[14]，目前諾如病毒樣顆粒結(jié)合SpyCatcher/SpyTag系統(tǒng)呈遞細(xì)胞因子的研究還暫未有人報(bào)道.

本研究利用諾如病毒樣顆粒（NoV-VLP）作為細(xì)胞因子的遞送平臺(tái)，結(jié)合SpyCatcher/SpyTag系統(tǒng)，探究IL-1O的高效、穩(wěn)定遞送.該研究將為細(xì)胞因子療法提供新思路，展現(xiàn)IL-10在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用潛力.

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1質(zhì)粒pThioHisA質(zhì)粒，購(gòu)買于Invitrogen公司；pColdTMTF質(zhì)粒，購(gòu)買于Takara公司；pThioHisA-4S-Spycatcher 質(zhì) 粒：簡(jiǎn)稱Nov-S-catcher，由本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建，是將諾如病毒的S蛋白融合SpyCatcher以NdeI和EcoRI雙酶切插入pThioHisA表達(dá)載體.

2.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)6～8wk的雌性C57BL/6小鼠（北京斯貝福），動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）K2024-0001.實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)過醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所（IMBCAMS）動(dòng)物使用和倫理委員會(huì)授權(quán)，倫理備案號(hào)為（DWSP202107010）.

2.1.3細(xì)胞小鼠TC-1細(xì)胞，保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)．

2.1.4主要試劑質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)于北京天根生華科技有限公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；感受態(tài)、PCR引物、序列合成及測(cè)序均由上海生工生物工程股份有限公司合成測(cè)定；胎牛血清（FBS）1640培養(yǎng)基、胰酶均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；IL-1O一抗購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；二抗購(gòu)于成都正能公司；小鼠IFN- ?γ 的ELISPOT檢測(cè)試劑盒購(gòu)于瑞典Mabtech公司．

2.2方法

2.2.1 重組IL-1O質(zhì)粒的構(gòu)建 合成IL-1O蛋白、連接臂及SpyTag的編碼基因.本研究選用的連接臂（Linker）氨基酸序列為：GGGGS或GSGSG.G（Gly）為甘氨酸，S為（Ser）絲氨酸.為了進(jìn)行鎳柱純化，在末端添加6個(gè)組氨酸（HHHHHH）標(biāo)簽.設(shè)計(jì)引物用PCR從載體上克隆出目的片段基因和載體，通過同源重組將自的片段與載體進(jìn)行重組.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化.2.2.2誘導(dǎo)表達(dá)及純化目的蛋白將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，接種于含氨芐青霉素的LB平板上，篩選單克隆.將測(cè)序正確的單克隆菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在 37°C.220r/min 條件下培養(yǎng).當(dāng) OD₆₀₀ 達(dá)到 0.5～0.6 時(shí)，加入適量的異丙基 β -D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），并在恒溫?fù)u床上于特定溫度下過夜誘導(dǎo)蛋白表達(dá).誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，收集菌液，并在 4000r/min 下離心 10min ，收集細(xì)菌沉淀.用冰冷的PBS重懸細(xì)菌沉淀，然后進(jìn)行超聲破碎.收集上清液，并用 0.45μm 濾器過濾得到純凈的蛋白上清液.使用NiSepharose6FastFlow填料對(duì)蛋白上清液進(jìn)行鎳親和層析純化，并通過梯度洗脫（使用 0.01mmol/L PBS， 500mmol/L 氯化鈉， 500mmol/L 咪唑， pH6.8 的洗脫緩沖液）洗脫目標(biāo)蛋白.通過鎳柱純化后的目標(biāo)蛋白，使用PBS進(jìn)行透析，去除背景溶液，最終獲得純化后的目標(biāo)蛋白.為純化得到組裝成病毒樣顆粒的VLP-catcher，使用Sepharose6FastFlow填料進(jìn)行凝膠過濾層析（使用 50mmol/L Tris， 200mmol/L 氯化鈉 ，pH7.6 的組裝緩沖液），獲得均一的病毒樣顆粒，即帶有SpyCatcher的諾如病毒樣顆粒（VLP-catcher）.

2.2.3純化后蛋白及VLP的相關(guān)鑒定及驗(yàn)證使用 12% 的免染SDS-PAGE蛋白凝膠分離蛋白樣品，用ImageLab拍照記錄目的條帶的圖片．再將凝膠印跡到PVDF膜上，一抗采用小鼠抗IL-10的單克隆抗體（1：100O），二抗采用HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體（1：5OOO）.WesternBlotting（WB）檢測(cè)：采用標(biāo)準(zhǔn)化的流程和方法，最后用ECL顯影蛋白條帶.使用透射電子顯微鏡觀察VLP-catcher病毒樣顆粒的形態(tài).

2.2.4荷瘤小鼠模型的構(gòu)建將 1×10⁵ 個(gè)/100μL的TC-1細(xì)胞對(duì)小鼠右側(cè)進(jìn)行皮下接種，并隨機(jī)將小鼠平均分為3組，待腫瘤體積至 30～50mm³ 時(shí)進(jìn)行干預(yù).皮下注射VLP-IL1O（VLP-catcher為20μg ，TF-Spytag-IL10為 10μg 到小鼠體內(nèi)，同時(shí)分別以注射PBS和IL-1O作為對(duì)照組，每隔1wk注射1次，共進(jìn)行3次注射.監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤生長(zhǎng)，每隔1d測(cè)量小鼠腫瘤體積，體積計(jì)算公式為：腫瘤體積 （mm³）= 長(zhǎng) x （寬） ²×0.5 于第31d麻醉后處死小鼠，收集腫瘤樣本以進(jìn)行進(jìn)一步分析.

2.2.5酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)（ELISPOT）提取腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞.按照標(biāo)準(zhǔn)的ELISPOT檢測(cè)試劑盒中的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并拍照記錄分析，實(shí)驗(yàn)中用的刺激肽為 E7_49-57

2.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樹突狀細(xì)胞成熟的標(biāo)記分離得到小鼠淋巴結(jié)中的細(xì)胞對(duì)不同的細(xì)胞標(biāo)志物分別進(jìn)行流式抗體染色.細(xì)胞表面分子染色步驟參考Biolegend官網(wǎng)，最后進(jìn)行流式細(xì)胞分群的上機(jī)分析.

2.2.7統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPadPrismlO.O軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.誤差線表示平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（SD）.腫瘤生長(zhǎng)曲線使用Two-wayANOVA進(jìn)行分析；多組比較使用One-wayANOVA進(jìn)行分析； ns 表示無顯著性差異； ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ：^***Plt;0.001 ****Plt;0.0001

3 結(jié)果與分析

3.1Spytag-IL10與Trx-Spytag-IL10重組質(zhì)粒 的構(gòu)建及表達(dá)

通過同源重組將Spytag-IL1O融合蛋白構(gòu)建在載體pThioHisA上（圖1a），通過同源重組將Trx-Spytag-IL1O融合蛋白構(gòu)建在載體pThioHisA上（圖1b）.將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過生工測(cè)序后，用1mmol/L 的異丙基 β -D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），在恒溫?fù)u床上 30^°C 誘導(dǎo)蛋白表達(dá) 16h ，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后IL-10融合蛋白的表達(dá)量并沒有明顯提高，并且還不足以達(dá)到純化的標(biāo)準(zhǔn)（圖1c）.

3.2TF-Spytag-IL10重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)純化

通過同源重組將Spytag-ILO融合蛋白構(gòu)建在載體pColdTMTF上，載體為低溫表達(dá)載體，并同時(shí)帶有促溶標(biāo)簽TriggerFactor（TF）.將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過生工測(cè)序后，用 0.5mmol/L 的異丙基 β -D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），在恒溫?fù)u床上16°C 誘導(dǎo)蛋白表達(dá) 16h .SDS-PAGE結(jié)果顯示（圖2a），TF-Spytag-IL1O有很好的表達(dá)效果，說明加入TF標(biāo)簽后對(duì)于融合蛋白Spytag-IL10的表達(dá)量有明顯的提高.將誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行重懸破碎，發(fā)現(xiàn)TF-Spytag-IL1O融合蛋白主要表達(dá)在于上清中（圖2a）.通過鎳柱梯度洗脫，純化得到TF-SpytagIL10融合蛋白（圖2b），純化得到的融合蛋白純度在90% 以上，濃度經(jīng)Braforad測(cè)定為 3～5mg/mL

3.3VLP-catcher的純化及與TF-Spytag-IL10共 孵育

VLP-catcher（Nov-S-catcher）的質(zhì)粒由科室前期構(gòu)建，按照1mmol/L的IPTG，恒溫?fù)u床上 30^°C 誘導(dǎo)蛋白表達(dá) 16h ，將誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行重懸破碎，通過鎳柱梯度洗脫及超濾濃縮，純化得到VLP-catcher（圖3a），純化得到的融合蛋白純度在（a）IPTG誘導(dǎo)TF-Spytag-IL10表達(dá)的結(jié)果（M：Proteinmarker;1：TF-Spytag-IL1O工程菌未加IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果;2：TF-Spytag-IL10工程菌加IPTG誘導(dǎo)后的結(jié)果;3：TF-Spytag-IL10工程菌破碎后的上清;4：TF-Spytag-IL10工程菌破碎后的沉淀）；（b）鎳柱梯度洗脫純化得到TF-Spytag-IL1O重組蛋白（M：Protein marker;1：TF-Spytag-IL1O工程菌未加IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果;2：TF-Spytag-IL10工程菌加IPTG誘導(dǎo)后的結(jié)果;3：TF-Spytag-IL10工程菌破碎后的上清;4：TF-Spytag-IL10工程菌破碎后的沉淀;5：鎳柱純化的穿流液;6-12：鎳柱梯度洗脫純化得到的蛋白）.

（a）重組質(zhì)粒Spytag-IL10構(gòu)建的示意圖；（b）重組質(zhì)粒Trx-Spytag-IL10構(gòu)建的示意圖；（c）IPTG誘導(dǎo)Spytag-IL1O和Trx-Spytag-IL10表達(dá)的結(jié)果（M：Protein marker;1：Spytag-IL1O工程菌未加IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果;2：Spytag-IL10工程菌加IPTG誘導(dǎo)后的結(jié)果;3：Trx-Spytag-IL10工程菌未加IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果;4：Trx-Spytag-IL10工程菌加IPTG誘導(dǎo)后的結(jié)果）.

Fig.1Construction and expresson of Spytag-IL1O and Trx-Spytag-IL1O recombinant plasmids.

（a）SchematicdagramofrecombinantplasmidSpytag-ILOconstruct;（b）SchematicdiagramofrecombinantplasmidTrx-Spytag-Icon struction；（c）ResuofGduedexresioofSpyg-andT-Syag-：Proemarker;1：ResultsofSyta-ei neredacteriaioutIiductio；2ResultsofpytaegiedbcteraithIiductio；3Resultsorx-Spy gineredbacteriawithoutIPTGinduction；4：ResultsofTrx-Spytag-IL1OengineredbacteriawithITGResultsafterinduction）.

（a）Resultsof1.Ommol/LITGinducedTF-Spyag-IL1Oexpression（M：Proteinmarker;1：ResultsofTF-Spyag-IL1Oengieingbac teriinducedwitoutIG；：ResultsofSytag-ngieerigbacteriinducedwithIG；3：SupeatantofTFSpyae neringbacterfrgetatioPreiiateofSpg-icteergmeatio）；）ickeodi tiopurifiaaiSagombtproterotearkesulsfaingctucd withoutPG；lsoSpag-ecterucedit；pataofSpa-ec terfragmentatio；4preciiateofSpagneacteraferfrmetatio；5ickelolpuredpriplas teins obtainedby nickel column gradient elution purification）.

85% 以上.再經(jīng)分子篩二次純化得到組裝成顆粒的VLP-catcher，得到的顆粒純度在 95% 以上（圖3b）.通過透射電鏡拍攝，確認(rèn)純化后的VLP-catcher已經(jīng)組裝成顆粒形態(tài)，大小約在 20～30nm ，結(jié)果如圖3c.將組裝成顆粒形態(tài)的Nov-S-catcher與TF-Spytag-IL10在 4^°C 下孵育過夜，通過WB檢測(cè)，確定TF-Spytag-IL1O被展示在VLP-catcher表面，結(jié)果如圖3d.但是通過孵育結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)并不是所有的TF-Spytag-IL1O都被展示在VLP-catcher表面，推測(cè)可能是因?yàn)門F促融標(biāo)簽的分子量過大，造成了一定的空間位阻效應(yīng)，使得融合蛋白與病毒樣顆粒的結(jié)合效率大大降低.

（a）鎳柱梯度洗脫純化得到VLP-catcher（M：Protein marker;1：VLP-catcher工程菌未加IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果;2：VLP-catcher工程菌加 IPTG誘導(dǎo)后的結(jié)果;3：VLP-catcher工程菌破碎后的上清；4：VLP-catcher工程菌破碎后的沉淀；5：鎳柱純化的穿流液；6～11：鎳柱梯度洗脫 純化得到的蛋白；12：超濾濃縮下層濾液；13：超濾濃縮得到的VLP-catcher）；（b）分子篩純化得到VLP-catcher（1＼～12：均為分子篩純化連續(xù) 收集到的蛋白樣品）；（c）電鏡觀察純化后得到的VLP-catcher;（d）VLP-catcher和TF-Spytag-IL1O共孵育后，TF-Spytag-IL10被呈遞在 VLP-catcher表面，左為WB結(jié)果，右為SDS-PAGE結(jié)果（1：VLP-catcher和TF-Spytag-IL10共孵育后的結(jié)果;2：VLP-catcher未加TF-SpytagIL10的對(duì)照）.

（a）VLP-catcherwasobtaiedbypurificationwithgradientelutiononanickelcolumn（M：Proteinmarker；l：resultsofVLP-catcherengi neringbacteriaiotGuctio；2esultsfcatchgineiacteritIGductioupeatantofVca ginerigbacteriftecushg；4Vcatcratchreginedacteriafecushg；5oufoolutioofcelfi tion;6＼～1l：rotedbcelogadtpuatio；ulrafiratoceflatea obtainedyulrafitratioconetratio）；）atchasoaidpuriioitoleulasieallfaroe tivelylletedrotepesyoleaeurifi））Eomosoeatoabdf; （d）Aftercoubatioofachenytag-FSpyg-aspreseedohatcersufaceleftistesult rightistheSD-PAGEresult（1：VP-catcherand-Spytag-10afterc-icubation;2：ontrolofV-catcherwithoutT-Sptag-）.

3.4VLP-IL10有較強(qiáng)的腫瘤殺傷能力

為了評(píng)價(jià)VLP-IL1O的抗腫瘤效果，將TC-1腫瘤細(xì)胞接種于C57BL/6雌鼠右側(cè)進(jìn)行皮下接種，構(gòu)建荷瘤小鼠模型.每7d皮下注射1次VLP-IL10，共3次，監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況（圖4a）.對(duì)照組分別為PBS和單獨(dú)IL1O，腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示，病毒樣顆粒呈遞的IL1O比游離的IL1O有更好地抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力.在第31d收集并稱取腫瘤塊的重量（圖4b）進(jìn)行分析也支持上述結(jié)果.分離得到腫瘤塊中的淋巴細(xì)胞，通過ELISPOT檢測(cè)到，病毒樣顆粒呈遞的IL1O組表達(dá)IFN-γ的應(yīng)答要強(qiáng)于IL10組和PBS組（圖4c）.證明了VLP-IL10有較強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤殺傷的能力.

3.5VLP-IL10可以靶向淋巴結(jié)并激活樹突狀細(xì)胞的成熟

淋巴結(jié)（LNs）是免疫系統(tǒng)的基本組織，在腫瘤免疫中許多關(guān)鍵步驟都是在其中進(jìn)行的，實(shí)體瘤中高度免疫抑制的微環(huán)境（TME）可能會(huì)嚴(yán)重阻礙激活LNs內(nèi)抗腫瘤免疫.在TME中，樹突狀細(xì)胞（DC）等APC通常表現(xiàn)出未成熟的表型.因此，效應(yīng)T細(xì)胞在實(shí)體瘤中往往存在活化不足以及募集不良的問題.病毒樣顆粒因其納米結(jié)構(gòu)可以很好地靶向LNs并激活樹突狀細(xì)胞，為了探究VLP-IL1O抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制，我們對(duì)TC-1荷瘤小鼠模型進(jìn)行了靶向LNs及激活DC的實(shí)驗(yàn).對(duì)荷瘤小鼠用CY7-SE染料分別對(duì)IL-1O及VLP-IL10進(jìn)行標(biāo)記后進(jìn)行皮下給藥，分別在給藥 24h和48h后取小鼠LNs進(jìn)行熒光拍照.結(jié)果顯示，病毒樣顆粒呈遞的IL1O比游離的IL1O有更好地靶向LNs及駐留的能力（圖5a），在 48h 后仍可以觀察到駐留的結(jié)果．同時(shí)，我們對(duì) 48h 后分離得到的LNs進(jìn)行流式分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VLP-IL1O組可以更好地激活DC的成熟（圖5b），以達(dá)到啟動(dòng)效應(yīng)T細(xì)胞，最終實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫的激活.

（a）各組腫瘤生長(zhǎng)曲線 （n=3） ；（b）各組腫瘤的重量統(tǒng)計(jì) （n=3. ；（c）抗原肽刺激 36h 后，腫瘤組織中的淋巴細(xì)胞分泌的 IFN-γ 通過ELISPOT檢測(cè)并定量 （n=3） .誤差線代表平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（SD）.腫瘤生長(zhǎng)曲線使用Two-wayANOVA進(jìn)行分析；多組組間比較使用one-way ANOVA進(jìn)行分析； ns ，不顯著； ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^***Plt;0.001 ^{****Plt;0.0001}

（a）Tumor growth curves of each group （n=3） ；（b）Weight statistics of tumors ineach group （n=3） ；（c）After 36hof antigenpeptide stimulation，IFN- γ secreted by lymphocytesin tumor tissueswasdetected and quantified by ELISPOT n=3 .Theerror line represents the mean ± standard deviation（SD）.Tumor growthcurves wereanalyzedbyTwo-wayANOVA；multi-groupcomparisons wereanalyzed byoneway ANOVA; ns ，not significant; ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^{***Plt;0.001 ****Plt;0.0001}

4討論

IL-10因其在腫瘤免疫中的作用具有雙重性，一直以來是研究的熱點(diǎn).本研究利用諾如病毒樣顆粒（NoV-VLP）作為遞送平臺(tái)，通過SpyCatcher/SpyTag系統(tǒng)高效呈遞IL-1O，探索其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用潛力.SpyCatcher/SpyTag系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了IL-10與VLP的穩(wěn)定共價(jià)連接，有效提升了IL-10的穩(wěn)定性和遞送效率，解決了傳統(tǒng)細(xì)胞因子在靶向性和穩(wěn)定性方面的局限.

針對(duì)IL-1O與SpyTag融合后表達(dá)效率較低的技術(shù)瓶頸，本研究系統(tǒng)評(píng)估了不同促溶標(biāo)簽Trx和標(biāo)簽TF（TriggerFactor）的作用，發(fā)現(xiàn)TF標(biāo)簽顯著提高了SpyTag-IL1O的表達(dá)水平和可溶性.TF作為分子伴侶標(biāo)簽，通過減少錯(cuò)誤折疊和蛋白聚集，優(yōu)化了IL-1O的折疊過程，增強(qiáng)了融合蛋白的穩(wěn)定性.這一結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了TF標(biāo)簽在復(fù)雜融合蛋白表達(dá)中的普適性和優(yōu)勢(shì)[15-17].此外，實(shí)驗(yàn)表明，低溫表達(dá)（ 16^°C） 進(jìn)一步提升了TF-SpyTag-IL1O的溶解性和純化效率，表明降低表達(dá)溫度能夠有效緩解蛋白聚集問題[18.19]，為高效生產(chǎn)功能性細(xì)胞因子提供了新的思路.在抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，VLP-IL1O顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，相比游離IL-1O表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤活性和IFN-γ應(yīng)答.這一結(jié)果表明，通過VLP遞送IL-10能夠顯著改善細(xì)胞因子的穩(wěn)定性和遞送效率，并在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用.值得注意的是，這一策略不僅提升了IL-10的生物活性，也進(jìn)一步驗(yàn)證了IL-1O在腫瘤免疫治療中的潛在價(jià)值.同時(shí)通過皮下注射熒光染料標(biāo)記的VLP-IL10和游離IL-1O，發(fā)現(xiàn)病毒樣顆粒呈遞的IL-10

（a）活體成像分別拍攝皮下給藥 24h（ 左）和48h（右）后小鼠腋窩淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)不同疫苗的靶向及駐留情況；（b）取給藥后小鼠的淋巴結(jié)進(jìn)行流式分析，檢測(cè)多種DC成熟指標(biāo) （n=3） .誤差線代表平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（SD）.流式結(jié)果比較使用one-wayANOVA進(jìn)行分析；ns ，不顯著； ^*Plt;0.05 **Plt;0.01 ^***Plt;0.001

（a）Invioimagingaspefoedtoapturetetargeingandresidencofdiferentvaccnesinxllaylyphodesandinguinallyph nodesof mice after subcutaneousadministration of the vaccines for 24h （left）and 48h （right），respectively；（b）Lymph nodes of mice afteradministrationof thevaccines were taken for flow-through analysis to detectavarietyofDC maturation indices（ ?n=3） .Error linesrepresent mean ± standard deviation（SD）.The error line represents the mean ± standard deviation（SD）.Multi-group comparisons were analyzed by one-way ANOVA; ns ，not significant; ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ***Plt;0.001 ：

可以更好地靶向并駐留在淋巴結(jié)中.流式細(xì)胞術(shù)分析給藥后淋巴結(jié)中DC，發(fā)現(xiàn)VLP-IL1O可以激活DC的成熟，從而更好地實(shí)現(xiàn)效應(yīng)T細(xì)胞的活化，實(shí)現(xiàn)腫瘤的免疫治療.

自基于VLP的乙肝疫苗首次開發(fā)以來，該平臺(tái)的應(yīng)用不斷拓展，目前已有針對(duì)HPV和HEV等多種疾病的VLP疫苗成功上市.此外，VLP在癌癥疫苗開發(fā)中的研究也取得了重要突破[20]，通過化學(xué)連接和基因重組融合等方式[21.22]，可將異源腫瘤抗原高效引入VLP載體，進(jìn)一步增強(qiáng)了癌癥免疫治療的效果.通過該平臺(tái)，IL-10得以精準(zhǔn)遞送至腫瘤部位，進(jìn)一步增強(qiáng)了遞送系統(tǒng)的穩(wěn)定性和功能性，展現(xiàn)了IL-1O在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用潛力，并為細(xì)胞因子療法與納米疫苗技術(shù)的結(jié)合提供了新思路．未來，這一遞送系統(tǒng)有望在腫瘤疫苗開發(fā)和多功能細(xì)胞因子治療中得到廣泛應(yīng)用，為解決腫瘤免疫治療中的遞送效率、抗原穩(wěn)定性及精準(zhǔn)性問題提供了重要啟示，同時(shí)，該平臺(tái)還可進(jìn)一步拓展至其他治療性蛋白或抗原遞送領(lǐng)域，為生物醫(yī)學(xué)研究與臨床轉(zhuǎn)化提供更多可能性.

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（責(zé)任編輯：白林含）