鴨坦布蘇病毒E蛋白的原核表達(dá)

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-1085（2025）07-0017-07

鴨坦布蘇病毒?。―uck Tembusu virusdisease，DTMU）是由鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus，DTMUV）引起的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋大幅下降，雛鴨和育成鴨出現(xiàn)頭頸震顫、四肢麻痹等神經(jīng)癥狀為主要特征的急性、熱性傳染性疾病[1]。雛鴨、育成鴨感染后，以病毒性腦炎為特征，患病鴨表現(xiàn)為頭頸震顫，體溫升高，精神沉郁，癱瘓，站立困難，行走時(shí)雙腳向外叉開(kāi)呈“八字型”，倒翻掙扎，腹瀉、脫水、糞便粘污肛門(mén)羽毛；病情嚴(yán)重的病鴨表現(xiàn)采食困難，共濟(jì)失調(diào)，最后衰竭死亡。

產(chǎn)蛋鴨發(fā)病迅速，臨床主要表現(xiàn)是產(chǎn)蛋量驟然下降，畸形蛋比例增高。1995年，該病在我國(guó)河北等地首次出現(xiàn)，病鴨臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降和神經(jīng)癥狀，其病原被稱為病毒性腦炎病毒。2010年4月，該病在我國(guó)部分東南沿海省份大規(guī)模暴發(fā)，隨后在、河南等地區(qū)相繼出現(xiàn)。本病發(fā)病急、傳播快、發(fā)病率高，臨床一旦發(fā)現(xiàn)鴨群中出現(xiàn)病鴨，極易在短時(shí)間內(nèi)迅速蔓延至整個(gè)鴨群，發(fā)病率可達(dá) 100% 。近年來(lái)，坦布蘇病毒病在我國(guó)沿海地區(qū)的報(bào)告病例數(shù)量持續(xù)上升，其快速蔓延給我國(guó)及東南亞地區(qū)的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鴨對(duì)該病最易感，其他禽類以及小鼠等哺乳類動(dòng)物也可能有不同程度的感染。病鴨和帶毒鴨是主要傳染源。DTMUV為蟲(chóng)媒病毒，從鴨場(chǎng)內(nèi)的蚊子、飛鳥(niǎo)體內(nèi)均檢測(cè)到該病毒，這表明蚊和鳥(niǎo)類是其貯存宿主和傳播媒介[2]。TMUV在卵泡囊膜的檢出率最高，表明該病毒能經(jīng)卵垂直傳播。此外，TMUV可經(jīng)糞便排出體外，污染環(huán)境、飼料、飲水、器具以及運(yùn)輸工具等[3]，從而導(dǎo)致易感鴨感染發(fā)病。帶毒鴨或被污染的運(yùn)輸工具跨區(qū)域活動(dòng)，能進(jìn)一步促進(jìn)該病的傳播。目前，DTMUV檢出率約為 40% ，其感染嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。為有效遏制TMUV的流行，降低傳播風(fēng)險(xiǎn)，除了改善養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境、提升飼養(yǎng)管理水平等預(yù)防措施外，接種疫苗也是重要的防控手段。然而，目前使用的弱毒疫苗和滅活疫苗雖安全性較高，但存在疫苗品種有限、免疫保護(hù)水平低等問(wèn)題[4]。

DTMUV屬于黃病毒科黃病毒屬的RNA病毒，有三種基因型，分別為T(mén)MUV1（TMUV1a、TMUV1b和TMUV1c）、TMUV2（TMUV2a、TMUV2b）和TMUV 3^[5] 。病毒粒子呈球形，直徑約 50nm ，有囊膜，不能凝集雞、鴨、鵝和鴿的紅細(xì)胞[?；蚪M為單股正鏈不分節(jié)段RNA，長(zhǎng)度為 10990bp ，編碼一個(gè)大的多聚蛋白[，該多聚蛋白在蛋白酶的作用下水解成10種病毒蛋白，分別為3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白[8]。由E基因編碼的囊膜蛋白是TMUV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒吸附、膜融、組裝和侵入密切相關(guān)，決定著病毒的親嗜性、毒力和致病性[9。E基因編碼的囊膜蛋白是病毒的主要毒力蛋白，介導(dǎo)識(shí)別受體、膜融、裝配、釋放病毒粒子[1]。此外，E蛋白含有多個(gè)特異性抗原表位，能夠誘導(dǎo)機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答并產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[11]。因此以E蛋白為靶點(diǎn)進(jìn)行TMUV新型疫苗的研發(fā)尤為關(guān)鍵。本研究擬通過(guò)構(gòu)建pET28a-TMUV-E原核表達(dá)重組載體，在體外表達(dá)并純化TMUVE蛋白，為鴨坦布蘇病毒新型疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株與載體質(zhì)粒pET28a-TMUV-E原核表達(dá)質(zhì)粒、 pET-28a（+） 載體、目的基因模板質(zhì)粒pUC57-TMUV-E-Ecoli購(gòu)自HonorGene有限公司；DH5 a 克隆菌株、BL21（DE3）表達(dá)菌株購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。

1.1.2試劑Prime STAR MaxDNAPolymerase、T4DNALigase為T(mén)AKARA公司產(chǎn)品，核酸內(nèi)切酶、DNAPolymerase為寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒與質(zhì)粒小提試劑盒為碧云天生物有限公司產(chǎn)品。DNAMarker、ProteinMarker為寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒為碧云天生物有限公司產(chǎn)品；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒為碧云天生物有限公司產(chǎn)品；10% ExpressCastPAGE彩色凝膠快速試劑盒為蘇州新賽美公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為北京索萊寶公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1模板質(zhì)粒的構(gòu)建以NCBIGenBank 提供的鴨坦布蘇病毒E基因片段原始序列為基礎(chǔ)，針對(duì)大腸桿菌種屬進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在5’端和3'端分別加上NdeI、BamHI酶切位點(diǎn)，通過(guò)全基因合成獲得所需要的目的基因片段。目的基因模板質(zhì)粒pUC57-TMUV-E-Ecoli，購(gòu)自HonorGene公司。

1.2.2pET28a-TMUV-E質(zhì)粒構(gòu)建用NdeI、BamHI分別對(duì)pUC57-TMUV-E-Ecoli模板質(zhì)粒和 pET-28a（+） 載體雙酶切， 恒溫反應(yīng) 。酶切反應(yīng)結(jié)束后，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收相應(yīng)的基因片段條帶和載體條帶。使用T4DNA連接酶將酶切后的基因片段和載體片段進(jìn)行連接， 過(guò)夜。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化平板上挑取若干個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定，鑒定為陽(yáng)性的克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并用ApaI、XhoI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，對(duì)酶切鑒定正確的質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，將測(cè)序正確的質(zhì)粒冷凍保存。1.2.3重組原核載體的表達(dá)與鑒定將1.2.2 陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中，操作步驟同1.2.2，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)與鑒定。取鑒定正確的菌液，接種到 5mL 含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中， 培養(yǎng) 16h ；取 3mL 菌液接種到 300mL 的LB培養(yǎng)液（預(yù)熱至 ，含卡那霉素）， 培養(yǎng)至菌液 OD₆₀₀ 達(dá)0.6；加入IPTG至終濃度為 Ω_1mM ，誘導(dǎo) 4.5h ；取出培養(yǎng)物 4mL ，離心 10000rpm ，3min ，倒掉上清，用 100μL1×SDS 上樣緩沖液，重懸沉淀；剩余培養(yǎng)物離心 5000rpm ， 10min ，倒掉上清，用PBS重懸沉淀后超聲波破碎，取上清液與沉淀液分別加入 1×SDS 上樣緩沖液重懸。1.2.4SDS-PAGE 電泳 取菌液 40mL ， 4‰ 、離心 12 000rpm ， 5min ，倒掉上清；PBS洗滌菌體3次。PBS重懸沉淀，超聲破碎，設(shè)置為：工作 4s ，間歇 3s ，電壓 220V ， 15min 。超聲完成后，取 40μL 菌體與 10μL5×SDS 蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴 10min ，冷卻。配膠：使用新賽美 10% ExpressCastPAGE彩色凝膠快速試劑盒配制向制膠板內(nèi)倒入溶液，插入梳子，放至37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，待上層膠凝固。上樣：安裝電泳裝置，槽中加滿 1× Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液，沒(méi)過(guò)梳子，拔出梳子后，孔內(nèi)加入樣品，設(shè)定電壓 150V ， ；電泳結(jié)束后將凝膠塊放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色，時(shí)間 2h ，取出膠塊脫色 10h ，直至呈現(xiàn)清晰條帶，使用凝膠成像系統(tǒng)呈現(xiàn)圖像，拍照保存。1.2.5融合蛋白的Ni柱親和純化目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后離心，向菌液沉淀中加入 5mL 裂解液，重懸細(xì)菌；冰上超聲裂解細(xì)菌，離心，取上清；將BeyoGold TM His-tagPurification Resin 裝柱， 2mL 裂解液平衡純化柱3次，收集穿流液并重復(fù)上柱

5次，以充分結(jié)合His標(biāo)簽蛋白。 1mL 裂解液洗滌6次后， 1mL 洗滌液洗柱6次； 0.5mL 洗脫液洗脫8次，收集洗脫液；將收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS透析過(guò)夜；蛋白加入緩沖液煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE分析，檢測(cè)蛋白純化效果。分別以BSA標(biāo)準(zhǔn)品與收集的蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化蛋白質(zhì)量。

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1重組pET28a-TMUV-E質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果分析重組載體經(jīng)ApaI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切后出現(xiàn) 4393bp 和 2679bp 兩條電泳條帶，同預(yù)期相符，見(jiàn)圖1。

2.2重組pET28a-TMUV-E質(zhì)粒測(cè)序鑒定結(jié)果分析重組載體核苷酸序列同預(yù)期一致，測(cè)序比較結(jié)果見(jiàn)圖2；重組載體pET28a-TMUV-E構(gòu)建成功，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖3。

2.3重組原核表達(dá)載體SDS-PAGE分析結(jié)果 2.4純化蛋白 SDS-PAGE分析結(jié)果

將 pET28a（+） 誘導(dǎo)空載、未誘導(dǎo)菌液、誘導(dǎo)后菌液、誘導(dǎo)破碎后上清、誘導(dǎo)破碎后沉淀處理后分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后分析。

結(jié)果顯示在 54.58kD 位置出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，同預(yù)期相符合，表示蛋白成功表達(dá)。目的蛋白主要在誘導(dǎo)破碎后的上清液中，SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖4。

融合蛋白的Ni柱親和純化SDS-PAGE結(jié)果，見(jiàn)圖5，由此可見(jiàn)目的蛋白全部結(jié)合到層析柱，純化效果較好。

2.5蛋白質(zhì)檢分析

將 0.5mg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)品蛋白與純化后的目的蛋白同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后，目的蛋白在 54.58kD 處出現(xiàn)明顯條帶，質(zhì)檢合格，結(jié)果見(jiàn)圖6。

x

3討論與結(jié)論

鴨坦布蘇病毒病是由TMUV引起的以蛋鴨產(chǎn)蛋量驟降和雛鴨及育成鴨病毒性腦炎為主要特征的急性傳染病，目前該病在全國(guó)多個(gè)水禽養(yǎng)殖地區(qū)廣泛流行，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12]，并對(duì)公眾健康造成潛在威脅[13]

E蛋白作為外膜蛋白參與鴨坦布蘇病毒的融合和穿入，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是主要的免疫原性蛋白，其所含的大量抗原表位與病毒入侵宿主細(xì)胞以及病毒致病性密切相關(guān)[14]。本研究通過(guò)構(gòu)建pET28a-TMUV-E原核表達(dá)重組載體，成功地在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了TMUVE蛋白。王鈺等[15]通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)截短的E蛋白進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其含有能夠精準(zhǔn)識(shí)別鴨坦布蘇病毒的特異性抗原表位。這一發(fā)現(xiàn)為以E蛋白為關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行TMUV新型疫苗研發(fā)，提供了重要理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

pET系列載體是目前最常用的重組表達(dá)載體，也是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的首選載體。本研究采用的 pET-28a（+） 原核表達(dá)載體，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，基礎(chǔ)表達(dá)水平極低，表達(dá)能力強(qiáng)大。在對(duì)外源目的基因進(jìn)行原核表達(dá)的過(guò)程中，需要根據(jù)目的蛋白的下游應(yīng)用選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。為了方便純化，本研究采用的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，具有易培養(yǎng)、易操作、成本低和表達(dá)水平高的特點(diǎn)。姬希文等[通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件和插入片段的長(zhǎng)度等方法解決了E蛋白表達(dá)量始終偏低的問(wèn)題。針對(duì)在SDS-PAGE電泳過(guò)程中存在電泳條帶過(guò)粗和電泳分辨率不高的問(wèn)題，本研究采取增加濃縮膠的長(zhǎng)度和降低電壓的方法解決了電泳條帶過(guò)粗的問(wèn)題；并通過(guò)將凝膠置于室溫凝固放置一段時(shí)間后再使用的方法，使聚丙烯酰胺充分聚合，提高了凝膠的分辨率。在目的蛋白純化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后有雜帶，這種情況是由雜質(zhì)與標(biāo)簽蛋白結(jié)合引起，可以通過(guò)在超聲破碎細(xì)胞之前添加去垢劑，增加去垢劑濃度，逐步優(yōu)化咪唑濃度，有效減少了雜質(zhì)的產(chǎn)生，提高了蛋白純度。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組載體pET28a-TMUV-E，且E蛋白可在大腸桿菌中正確表達(dá)。

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Prokaryotic Expression ofE protein ofDuck Tembusu Virus

WANG Jiayu1，ZHANG Chi¹ ，WANG Lin² ，ZHANG Zhenpeng3，DIAO Youjiang1 （1.ShandongAgricultureand EngineeringUniversity，Jinan25010o，China; 2.JinanYiminAnimalPharmaceutical C0. ，Ltd.，Jinan 50100，China; 3.ShandongLugangFuyouPharmaceutical co. ，Ltd.，Jinan，China）

Abstract：E protein is the major antigen of Tembusu virus （TMUV），and to express this antigenusing the prokaryotic expression system，inthis study，we referred to the published E gene sequence of duck Tembusu virus in GenBank，and ligated the E gene into the cloning vector by gene synthesis; On this basis，we used homologous recombination to recombine the E gene with the prokaryotic expression vector pET -28a（+） ；therecombinant plasmid pET28a-TMUV-Ewas constructed by transforming the pET28a-TMUV-E plasmid into BL21（DE3） expressing strain. On this basis，the E gene was recombined with the prokaryotic expression vector pET-28a（+） by homologous recombination technology to construct the recombinant plasmid pET28aTMUV-E; the pET28a-TMUV-E plasmid was transformed into BL21（DE3） expression strain，and the recombinant protein was expressed under the induced culture of IPTG.SDS-PAGE showed that the molecular weight of the expressed recombinant protein was 54.58kDa ，which was basically the same as the expected size of the protein bands;the recombinant protein was expressed in a purified form to be suitable for the applicationof the protein.Inorder to obtain a purer target protein for downstream experiments，this study also carried out Ni-columnaffinity purification of the fusion protein obtained from the expression of the E protein; the purification results showed that the target protein was allbound to the chromatographic column，and the SDSPAGE showed that the target protein was purified with good eficiency and no heterogeneous bands.In conclusion，the prokaryotic expression recombinant vector pET28a-TMUV-E was successfully constructed in this study，and the E protein could be correctly expressed in E .coli.

Keywords：Duck Tembusu virus;E protein;Prokaryotic expression; Purification