水晶香柚莖段離體誘導(dǎo)培養(yǎng)條件初探

中圖分類(lèi)號(hào)：S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：【Objective】To explore the suitable culture conditions virus-fre tissuecultureseedlings pomelo，inorder toscreenthe method eficientinductionadventitious budspomelo，providereferencefortheutilizationdevelopment pomelo germplasm resources sustainable healthy development in .【Methods】Adult Shui Jing Xiang pomelo branches were disinfected with varying NaClOconcentrations\"Bycomparing thedata，the appropriate explant disinfection methods，coection season，themostappropriatehormoneratiorotstock seed disinfectionmethods fortissueculture wereselected.Micro bud grafting experiments werecarriedouttoanalyze thesurvival status microbud grafting.【Results】 The optimal disinfection method for the explants Shui Jing Xiang pomelo was 75% alcohol +5% NaClO disinfection for 20min twice；The best timeforstem segment colection suitable for in vitro induction culture was in summer;The MS solid medium supplemented with 1mg/L （20 6- Benzylaminopurine （6-BA） ， 0.05mg/L indoleacetic acid（IAA） 0.5mg/L （204號(hào) gibberelin（GA3）was beneficial tothe germination adventitiousbuds.【Conclusion】The most suitablecultureconditions foradventitiousbudinduction grapefruitexplants werepreliminarilyscreenedout，therootstocksedculturemethodwas preliminarilydetermined.Thegrapefruit Seedlings Grafted bymicrobud grafting technologygrew wellInthefuture，the grafting survivalratecould be improvedbyimproving the grafting technology，soasturther enhancetheappicatio value.

Key words： Shui Jing Xiang pomelo； in vitro culture；hormone ratio；micro bud grafting

柑橘是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2022年底我國(guó)柑橘種植面積已達(dá)2 995.81hm² 、年產(chǎn)量突破6000萬(wàn)t，占全球總產(chǎn)量的 1/3^[1-2] 。但近年來(lái)，隨著柑橘種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，果園管理問(wèn)題逐漸顯現(xiàn)，尤其是廢棄果園處理不當(dāng)導(dǎo)致柑橘病害頻發(fā)的問(wèn)題[3]。目前，世界上已報(bào)道的柑橘病毒和類(lèi)似病毒病普遍具有傳播快、危害重、宿主終身帶毒等特點(diǎn)，傳統(tǒng)防治手段收效甚微[4]。在此背景下，微芽嫁接技術(shù)因能有效脫除柑橘體內(nèi)中的多種病毒而備受關(guān)注[5]。莖尖組織培養(yǎng)是微芽嫁接的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，一些研究表明，莖尖組織培養(yǎng)仍面臨污染率高、芽體分化難等問(wèn)題，這些內(nèi)外部因素制約微芽嫁接技術(shù)在柑橘生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用[6-7]。前人研究顯示，使用 1%00HgCl₂ 雖能顯著降低外植體的污染率[6]，但其高毒性限制了應(yīng)用，相比之下，NaClO作為替代方案安全性更高，但需進(jìn)一步優(yōu)化處理參數(shù)。例如，李麗[8]（2014）發(fā)現(xiàn)，采用 5% 和 10% NaClO對(duì)柑橘外植體進(jìn)行消毒結(jié)合 1.0mg/L6-BA+0.5mg/L 吲哚3一乙酸（IAA） +1.0mg/L 赤霉素（GA3）更有利于柑橘腋芽萌發(fā)；周海霞[9]（2010）研究認(rèn)為，添加 1.0mg/L6-BA+0.5mg/L 吲哚丁酸（IBA） +0.5mg/L GA3更有利于紅江橙腋芽萌發(fā)。盡管如此，柑橘嫁接技術(shù)仍面臨效率低下的問(wèn)題，羅君琴等[10]（2011）報(bào)道其微芽嫁接萌發(fā)率僅為 0～20% ；隆雨薇[11]（2015）進(jìn)一步指出微芽嫁接成活率不足 5% ，亟需技術(shù)突破。當(dāng)前，柚類(lèi)相關(guān)研究較少，尤其是消毒方法、激素配比與嫁接效率的系統(tǒng)性探索不足。本研究以水晶香柚為對(duì)象，篩選適宜的培養(yǎng)條件，旨在為后續(xù)微芽嫁接及培育柚類(lèi)脫毒苗提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為水晶香柚的成年態(tài)莖段，采自的柑橘種質(zhì)資源圃，砧木種子為酸柚種子。

試劑： 75% 酒精、NaClO溶液（ 2.5% 和5.0% 、蔗糖、瓊脂粉、6－芐氨基嘌呤（6一BA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（ GA₃ ）、MS培養(yǎng)基、MT培養(yǎng)基等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體采集

選擇晴天剪取水晶香柚生長(zhǎng)健康的半木質(zhì)化芽條，剪去葉片和刺裝入潔凈自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，自來(lái)水沖洗、洗滌劑浸泡 10min ，再用流水沖洗干凈。將枝條剪成 3cm 的帶單芽莖段。

1.2.2 外植體消毒

根據(jù)NaCIO濃度及消毒時(shí)間的不同，共設(shè)置8種處理方法對(duì)水晶香柚莖段進(jìn)行消毒處理，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。MS固體培養(yǎng)（ ΔMS+40.0g/L 蔗糖 +6.0g/L 瓊脂）基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 27± 1^°C ，光/暗周期 16h/8h 。每組30段，3次重復(fù)。14d后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率和生長(zhǎng)良好（未污染、未褐化）的外植體數(shù)。

污染率 （%）= 污染數(shù)/總數(shù) ×100 褐化率 （%）= 褐化數(shù)/總數(shù) ×100

1.2.3外植體采集季節(jié)篩選

分春（4月—6月）、夏（7月—8月）、秋（9月—10月）三季采集莖段，按照1.2.2中的消毒方式進(jìn)行消毒和培養(yǎng)，10d后統(tǒng)計(jì)污染率。

1.2.4激素配比篩選

采用1.2.2和1.2.3篩選出的方法處理水晶香柚莖段，接種于下列含不同激素配比的MS固體培養(yǎng)基（見(jiàn)表2）中，每組接種30段，3次重復(fù)。培養(yǎng)溫度 27±1^°C ，光/暗周期 16h/8h 。14d后統(tǒng)計(jì)外植體的誘導(dǎo)率、平均出芽個(gè)數(shù)等。

誘導(dǎo)率 （%）= 誘導(dǎo)段數(shù)/未污染接種段數(shù) ∵×100 平均出芽個(gè)數(shù)（個(gè)/段） Σ= 出芽總數(shù)/誘導(dǎo)段數(shù)

1. 2.5 砧木種子消毒

選取充實(shí)飽滿的酸柚種子，按照表3的處理方式進(jìn)行種子消毒。種子剝?nèi)⊥夥N皮消毒后置于MT固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度 27±1^°C 、暗培養(yǎng)。每組50粒種子，3次重復(fù)。14d后統(tǒng)計(jì)種子的污染率和發(fā)芽率。

污染率 （% ） 污染種子數(shù)/接種種子總數(shù) ×100

發(fā)芽率 （%）= 萌芽且未污染種子數(shù)/未污染種子總數(shù) ×100

1. 2.6 微芽嫁接試驗(yàn)

取培養(yǎng)誘導(dǎo)的外植體不定芽30個(gè)，與1.2.5中培養(yǎng)成功的黃化砧木進(jìn)行微芽嫁接，嫁接后置于MT培養(yǎng)基 （MT+40.0g/L 蔗糖）中，利用濾紙橋法進(jìn)行液體培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度 27±1^°C 、光/暗周期 16h/8h 。觀察嫁接苗生長(zhǎng)情況及成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1外植體不同采集季節(jié)、不同消毒方法的消毒效果比較

由表4可知，水晶香柚外植體莖段在不同消毒組合處理下的污染率和褐化率具有較大差異。依據(jù)NaClO消毒濃度可將處理分為兩組，分別是組1（A、B、C、D）、組2（E、F、G、H）。將這兩組進(jìn)行組內(nèi)比較，單次消毒的污染率都很高，經(jīng)兩次NaClO消毒（D、H組合）的污染率明顯降低，都在 30% 以下，但是隨著NaClO消毒時(shí)間的增加污染率降低，褐化率卻隨之升高；兩組間比較， 5% NaClO處理的試驗(yàn)組整體污染率低于 2.5% 濃度處理的試驗(yàn)組，褐化率則相反，組2高于組1。單看污染率和褐化率，兩者呈負(fù)相關(guān)，無(wú)法直接從平均值得出最佳消毒效果值。因此，根據(jù)表5統(tǒng)計(jì)的未污染、未褐化數(shù)據(jù)進(jìn)行排名得出處理組H為最佳的消毒方式，該方式消毒后的正常生長(zhǎng)莖段數(shù)最多，其次是處理組D，處理組F、G并列第3；從表4的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)還可以看出，不同采集季節(jié)的污染率和褐化率平均值差距在 10% 以內(nèi)，相對(duì)而言夏季采集的外植體莖段的污染率和褐化率較低，秋梢次之，春梢最高。因此，用于外植體離體誘導(dǎo)培養(yǎng)的莖段最佳采集季節(jié)為夏季。

2.2不同激素配比對(duì)外植體萌芽效果的影響

由表6可看出，每個(gè)試驗(yàn)組之間的出芽率差距不大；開(kāi)始萌發(fā)的時(shí)間參差不齊，相差 3～5d 。最終統(tǒng)計(jì)時(shí)間為播種后的第 30d ，添加植物激素的試驗(yàn)組均比對(duì)照組（組5）未添加任何激素的誘導(dǎo)率和平均出芽數(shù)高，其中，組3（ 1.0mg/L 6- BA+0.05mg/LIAA+0.5mg/LGA₃ ）的誘導(dǎo)率和平均出芽數(shù)最高，并且通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)的不定芽生長(zhǎng)良好（見(jiàn)圖1），組2次之。

2.3不同消毒方法對(duì)砧木種子萌發(fā)的影響

根據(jù)表7可知， 2.5% NaClO消毒的砧木種子的污染率和發(fā)芽率均高于試驗(yàn)組Ⅱ，因此黃化苗砧木種子培養(yǎng)的消毒方法可選擇用 2.5% NaClO消毒剝?nèi)ネ夥N皮的酸柚種子。

2.4微芽嫁接結(jié)果

將誘導(dǎo)的不定芽進(jìn)行微芽嫁接30株，成活2株，成功率為 6.7% ；嫁接成活后1個(gè)月，嫁接苗葉片展開(kāi)，多數(shù)葉片展開(kāi)，生長(zhǎng)情況良好（見(jiàn)圖2）。

3討論與結(jié)論

本研究通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選水晶香柚莖段離體誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，明確了外植體消毒方法、采集季節(jié)、激素配比及砧木種子消毒濃度。結(jié)果顯示，單次消毒處理的外植體污染率都較高，可能與柚類(lèi)的表面具有較多絨毛結(jié)構(gòu)特性有關(guān)，單次難以穿透外植體表層絨毛殺滅深層菌群，而采用 5% NaClO間隔^48h 兩次消毒（處理組H）顯著降低了外植體污染率（ 20.0% ，但褐化率提升（ 78.15% 。這一現(xiàn)象與吳思?jí)鬧12]（2017）對(duì)溫州蜜柑和紐荷爾臍橙的離體培養(yǎng)結(jié)果相似，也與前人研究中 HgCl₂ 的消毒效果相似[，但避免了 HgCl₂ 的高毒性風(fēng)險(xiǎn)，兼顧安全性與有效性。此外，夏季采集的外植體污染率和褐化率均低于春、秋梢，可能與夏季高溫高濕環(huán)境下植物組織代謝活躍、愈傷能力較強(qiáng)有關(guān)，但具體生理機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

在激素配比方面，添加 1.0mg/L6-BA+ 0.05mg/LIAA+0.5mg/LGA₃ （組3）的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率（ 65% ）和平均出芽數(shù)（1.62個(gè)/段）最優(yōu)，表明適度提高細(xì)胞分裂素（6一BA）與低濃度生長(zhǎng)素（IAA）協(xié)同作用可有效促進(jìn)不定芽分化，與李麗[8]（2014）的柑橘研究結(jié)論一致。然而，赤霉素（ GA₃ ）的增效作用在本研究中更為顯著，可能與水晶香柚品種特異性相關(guān)。砧木種子消毒試驗(yàn)中， 2.5% NaClO處理（組I）的污染率（ 18.67% ）雖略高于 5% 處理（組Ⅱ），但其發(fā)芽率（ 60.67% ）更高，提示低濃度NaClO更利于平衡消毒效果與種子活力保存，可能因高濃度消毒劑滲透過(guò)深損傷胚芽。

在微芽嫁接方面，成活率僅為 6.7% ，與羅君琴等[10]（2011）、隆雨薇[11]（2015）報(bào)道的柑橘嫁接萌發(fā)率（ 0～20% ）相符，表明柚類(lèi)嫁接技術(shù)仍存在瓶頸。嫁接苗后續(xù)長(zhǎng)勢(shì)良好，說(shuō)明成活后的適應(yīng)性較強(qiáng)，未來(lái)可通過(guò)優(yōu)化嫁接操作（如砧木一接穗親和性匹配、嫁接切面的形狀、嫁接后培養(yǎng)條件調(diào)控等）進(jìn)一步提高成功率。本研究雖初步篩選出培養(yǎng)條件，但樣本量較小，且未探究褐化抑制劑的添加效果，后續(xù)可進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)規(guī)模并引入抗褐化劑（如活性炭）以完善體系。

本研究明確了水晶香柚莖段離體誘導(dǎo)的最適宜條件，包括 5% NaClO兩次消毒、夏季采集外植體、 1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IAA + 0.5mg/LGA₃"的激素配比及 2.5% NaClO砧木消毒方法。盡管微芽嫁接成活率較低，但為柚類(lèi)莖尖脫毒苗的培養(yǎng)和生產(chǎn)提供了技術(shù)基礎(chǔ)，對(duì)提升梅州地區(qū)柚類(lèi)產(chǎn)業(yè)抗病能力及可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，未來(lái)可進(jìn)一步優(yōu)化微芽嫁接技術(shù)以推動(dòng)其實(shí)際應(yīng)用。

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