蝴蝶蘭莖段組織石蠟切片方法的優(yōu)化研究

摘" 要：蝴蝶蘭莖部著生、潛伏于葉基部的腋芽在適宜環(huán)境下能夠萌發(fā)并伸長(zhǎng)分化形成花梗，其分化過程的顯微觀察是探明蝴蝶蘭花發(fā)育進(jìn)程及影響因素的重要研究?jī)?nèi)容之一。為了建立一套適用于軟硬相連接的帶腋芽莖段的石蠟切片方法，以蝴蝶蘭金蝶（Phalaenopsis Lioulin Phoenix ‘LM41’）帶腋芽的莖段為試驗(yàn)材料，針對(duì)主要影響石蠟切片效果的固定時(shí)長(zhǎng)、軟化液濃度和軟化時(shí)長(zhǎng)、脫水等制備步驟進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：固定時(shí)對(duì)固定液抽真空并延長(zhǎng)固定時(shí)間至48 h及以上有利于固定液充分滲透，材料固定效果最佳；使用濃度為10%、12%的氫氟酸溶液軟化12、15"d并在軟化期間抽真空30"min，可使木質(zhì)化程度較高的莖段組織脆度和硬度大大降低，達(dá)到切片的軟硬度要求，有效解決軟化不均勻造成的組織分離破碎問題；脫水處理設(shè)置從30%～100%乙醇的7個(gè)逐級(jí)脫水梯度，并增加無(wú)水乙醇到二甲苯逐漸置換的步驟，可以避免蝴蝶蘭組織材料收縮變形，保證組織形態(tài)的完整性。優(yōu)化后的制備方法解決了常規(guī)石蠟切片中蝴蝶蘭帶腋芽莖段（含軟硬相連接組織）的軟化不徹底、組織與石蠟分離、蠟帶皺縮破碎、切片空洞等問題，所獲切片的整體結(jié)構(gòu)趨于完整，染色均勻且鮮艷，各部位組織細(xì)胞著色明顯，能清晰區(qū)分開幼嫩的芽組織和木質(zhì)化的莖組織。本研究形成了一套適用于蝴蝶蘭帶腋芽莖段（含軟硬相連接組織）的石蠟切片制備方法，為深入研究蝴蝶蘭潛伏腋芽萌發(fā)的分化過程提供技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；腋芽；莖；石蠟切片中圖分類號(hào)：S682.31 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Optimization of Paraffin Section Method of Phalaenopsis Tissue

FENG Caiyun^1，2， HE Yaping^1，2， LYU Fubing²， CHEN Heming²， YAN Shijuan³， AI Ye^1*， XIAO Wenfang^2*

1. College of Landscape Architecture and Art， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Environmental Horticulture Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key Laboratory of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization， Guangzhou， Guangdong 510640， China; 3. Agro-biological Gene Research Center， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract： The axillary buds， which are embedded in the stem of Phalaenopsis and lurked at the base of leaves， can germinate and elongate to form pedicels under suitable conditions. The microscopic observation of the differentiation process is one of the important research contents to understand the flower development process and influencing factors of Phalaenopsis. In order to establish a paraffin section method for two different tissues with soft and hard connection， the stem segment with axillary bud was used as the test material. The preparation steps， such as fixed time， softening liquid concentration and softening time， dehydration， etc.， which mainly affect the paraffin section effect， were optimized. The results showed that vacuuming the fixative and extending the fixative time to 48 h or more were conducive to the full penetration of the fixative， and the fixative effect was the best. Using 10%， 12% hydrofluoric acid solution to soften for 12， 15 days and vacuuming for 30 min during softening could greatly reduce the brittleness and hardness of stem tissues with high lignification degree， meet the soft and hard requirements of sections， and effectively solve the problem of tissue separation and fragmentation caused by uneven softening. Dehydration treatment was set up with 7 step by step dehydration gradients from 30% to 100% ethanol， and the gradual replacement steps of anhydrous ethanol to xylene were added， which could avoid the shrinkage and deformation of tissue materials of Phalaenopsis and ensure the integrity of tissue morphology. The optimized preparation method avoids the problems such as incomplete softening， separation of tissues from paraffin wax， crumpling and crushing of wax bands， and cavity of sections caused by conventional preparation of the stem segment of the axillary bud of Phalaenopsis girdle， etc. The overall structure of the obtained sections tends to be complete， the staining is uniform and bright， and the tissue cells in each part are obviously colored. Young bud tissue and lignified stem tissue can be clearly distinguished. In this study， a set of paraffin section preparation method was developed which could be applied to the stem segment of Phalaenopsis axillary bud， a soft and hard tissue material， and would provide a technical basis for further study on the differentiation process of latent axillary bud germination of Phalaenopsis.

Keywords： Phalaenopsis; axillary bud; stem; paraffin section

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.009

蝴蝶蘭為蘭科（Orchidaeeae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis Blume）多年生草本植物，因花姿如蝴蝶飛舞而得名，素有“洋蘭皇后”之美譽(yù)。蝴蝶蘭因其花型奇特、花色艷麗、花期長(zhǎng)久，深受消費(fèi)者的喜愛，是目前蘭科植物中商品化程度最高的種類，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量逐年遞增，繁殖栽培更加專業(yè)化、工廠化^[1]。同時(shí)，消費(fèi)者對(duì)蝴蝶蘭的觀賞性與品質(zhì)要求也不斷提升。蝴蝶蘭的花序（花梗）由莖基部的潛伏芽萌發(fā)并伸長(zhǎng)形成，每一片葉基部的莖段上都有一大一小2個(gè)潛伏芽，一般只有大的潛伏芽在適宜的環(huán)境下會(huì)萌發(fā)形成花序。研究并掌握潛伏芽的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，對(duì)蝴蝶蘭商業(yè)化生產(chǎn)中采取恰當(dāng)?shù)墓芾泶胧┻M(jìn)行催花有重要的指導(dǎo)意義。

石蠟切片是細(xì)胞組織學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究中常用的一種用于觀察植物顯微結(jié)構(gòu)的試驗(yàn)手段，通常步驟包括取材、固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、貼片、染色、透明、封片等。由于石蠟切片具有成本低、易操作、可連續(xù)切片及能永久保存等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、植物解剖學(xué)及分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域^[2-6]。傳統(tǒng)的石蠟制片方法對(duì)具有不同組織結(jié)構(gòu)的樣品并不完全適用，因而需要根據(jù)組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)摸索適用的制片方法^[7]。蝴蝶蘭極端縮短的莖段與腋芽緊密相連，觀察發(fā)現(xiàn)莖段木質(zhì)化嚴(yán)重但花芽組織非常幼嫩，2種不同的組織結(jié)構(gòu)軟硬度差異極大，因此在進(jìn)行石蠟切片制作時(shí)，采用常規(guī)的軟化方法無(wú)法獲得完整的蠟帶，后續(xù)切片過程中也常伴有脫片、疊片的情況，導(dǎo)致最終無(wú)法進(jìn)行微觀形態(tài)觀察。石蠟切片現(xiàn)有技術(shù)中尚無(wú)針對(duì)2種不同軟硬度組織緊密連接的樣品進(jìn)行優(yōu)化的制片方法。近年來多花梗型蝴蝶蘭越來越受市場(chǎng)青睞，因此腋芽發(fā)育形成花梗的過程是現(xiàn)今蘭花產(chǎn)業(yè)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一，但石蠟切片制作方法的不完善嚴(yán)重影響對(duì)腋芽萌發(fā)成花梗的微觀形態(tài)觀察研究。

鑒于所需，本研究以蝴蝶蘭金蝶的莖段及其腋芽為試驗(yàn)材料，在傳統(tǒng)石蠟切片的基礎(chǔ)上，根據(jù)蝴蝶蘭莖段和潛伏芽的生長(zhǎng)特點(diǎn)及組織軟硬度的差異，對(duì)石蠟切片的固定、脫水、透明等制備步驟進(jìn)行優(yōu)化，既能夠保證不傷害幼嫩腋芽又能使較硬莖段很好的達(dá)到軟化效果，形成一套能夠應(yīng)用于不同軟硬度相接的植物組織材料石蠟切片的制備方法，以期為深入研究蝴蝶蘭潛伏腋芽萌發(fā)的機(jī)制和微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 "材料與方法

1.1" 材料

供試蝴蝶蘭品種為具5～6片葉片且無(wú)病蟲害、株高約為10 cm的蝴蝶蘭金蝶二年生苗。種植在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所溫室大棚。

試劑：FAA固定液（由5%甲醛、5%乙酸、90%的50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇組成）、無(wú)水乙醇、二甲苯、固體石蠟、氫氟酸、番紅染液、固綠染液、中性樹脂。

儀器：石蠟切片機(jī)、生物顯微鏡、鼓風(fēng)干燥箱、恒溫箱、染色缸、載玻片、蓋玻片、燒杯、量筒等。

1.2 "方法

1.2.1" 取材與固定" 將新鮮的蝴蝶蘭植株剝?nèi)ト~片并切掉不定根等部位，保留莖及其腋芽，切取的組織長(zhǎng)度為10～12"mm，直徑為3～10"mm，將組織迅速投入到30 mL 50% FAA固定液中進(jìn)行固定。對(duì)固定液抽氣3次以排除材料中細(xì)胞間隙的空氣，分別固定48 h備用。植物組織與固定液的質(zhì)量體積比為1∶20。

1.2.2" 軟化 "軟化過程中設(shè)置不同的軟化液濃度和軟化時(shí)間進(jìn)行技術(shù)優(yōu)化（表1）：將固定后的組織材料放入塑料染色缸中，分別采用30"mL的10%、12%、15%不同梯度濃度的氫氟酸軟化液中抽真空30 min，密封，放入55"℃鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行軟化，各濃度氫氟酸溶液分別軟化12、15"d。當(dāng)用拇指和食指輕輕按壓組織時(shí)，組織按壓得動(dòng)且有彈性時(shí)，即軟化完成。軟化后的組織放入到流水中過夜洗至中性，以便于后期染色。以傳統(tǒng)甘油乙醇軟化處理的材料為對(duì)照。

1.2.3" 脫水" 將軟化后的材料用流水沖洗，去除材料表面的軟化劑后放入脫水盒中。將脫水盒放進(jìn)吊籃里置于脫水機(jī)內(nèi)采用不同濃度梯度的乙醇進(jìn)行脫水。在常規(guī)脫水方法^[8-9]的基礎(chǔ)上優(yōu)化脫水方案（表1），具體步驟為：30%乙醇中保持2 h；50%乙醇中保持2 h；70%乙醇中保持2 h；80%乙醇中保持1 h；90%乙醇中保持1 h；無(wú)水乙醇中保持2 h；二甲苯-無(wú)水乙醇混合液（體積比1∶1）中保持1 h；后在二甲苯中保持2 h。

1.2.4" 浸蠟" 在65"℃恒溫箱中將脫水完成后的材料浸入融化的石蠟中1 h，然后更換融化的石蠟浸蠟1 d，再次更換融化的石蠟浸蠟1 d。

1.2.5" 包埋" 將浸好蠟的組織置于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出，按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽。于?20"℃凍臺(tái)上冷卻，蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。

1.2.6" 切片與展片" 將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)中進(jìn)行切片，厚度選擇4"μm。切片漂浮于攤片機(jī)40"℃溫水上將組織展平，利用載玻片將組織撈起，除去多余的蒸餾水，并在40"℃烘箱內(nèi)烤片。水烤干、蠟烤化后取出常溫保存，備用。

1.2.7" 脫蠟及復(fù)水 "晾干后的切片必須經(jīng)脫蠟和復(fù)水才能在水溶性染液中完成染色^[10-11]。將切片放入二甲苯中保持8 min，在純二甲苯與無(wú)水乙醇混合液（體積比1∶1）中保持3"min；在無(wú)水乙醇中保持3"s；在90%乙醇中保持3 s；在80%乙醇中保持3 s；在70%乙醇中保持3 s；在50%乙醇中保持3 s；在30%乙醇中保持3 s；在純水中保持3 s。

1.2.8" 染色" 染色采用番紅－固綠雙重染色法。組織切片放入番紅染液中1～2"min后水洗；在50%乙醇中保持3 s；在70%乙醇中保持3 s；乙醇晾干后，切片放入固綠染液1 min；隨后切片經(jīng)過3次無(wú)水乙醇快速脫水，每次3 s。

1.2.9" 透明封片" 將染色完成的切片放入二甲苯透明5"min，后用中性樹膠封片。從側(cè)面慢慢移動(dòng)蓋上蓋玻片，在恒溫箱中40"℃烘干或置于室內(nèi)自然晾干并貼標(biāo)簽。隨后進(jìn)行顯微觀察并拍照。

2" 結(jié)果與分析

2.1 "固定方法的優(yōu)化

為了探究最優(yōu)固定時(shí)間，采用50% FAA為固定液，以傳統(tǒng)固定時(shí)長(zhǎng)24 h為對(duì)照。通過后期切片鏡檢對(duì)比2種固定時(shí)間（24 h和48 h）的石蠟切片效果，發(fā)現(xiàn)24 h固定處理下的切片結(jié)構(gòu)受損較嚴(yán)重，效果較差，中間樣本組織出現(xiàn)明顯破損，可能是由于固定時(shí)間不夠，切片時(shí)組織無(wú)法與蠟塊緊密貼合致使蠟帶粉碎，最終導(dǎo)致鏡檢的組織

結(jié)構(gòu)破損變形；48 h固定處理后的切片中，大部分蠟帶連續(xù)，組織結(jié)構(gòu)基本完整（圖1）。結(jié)果說明延長(zhǎng)固定時(shí)間至48 h有利于固定液充分滲透，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)制作方法，有效解決了細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形、固定不夠徹底造成組織破碎的問題。

2.2 "軟化方法的優(yōu)化

采用3種不同濃度的氫氟酸軟化液和2種軟化時(shí)間進(jìn)行改良試驗(yàn)，以傳統(tǒng)甘油－乙醇混合液分別軟化12 d和15 d為對(duì)照。優(yōu)化后的固定方法為50% FAA固定液固定48 h。有研究表明，軟化期間的真空處理有助于軟化劑快速滲入到樣本中，從而有效提高軟化效率，未經(jīng)真空處理獲得的組織材料軟化效果較差，后續(xù)浸蠟不完全，切片時(shí)蠟片不易連成蠟帶，攤片時(shí)皺折多，影響制片效果。因此，本研究均進(jìn)行抽真空30 min處理。不同軟化處理對(duì)切片效果的影響見圖2。通過對(duì)比不同軟化方法的石蠟切片，發(fā)現(xiàn)使用10%和12%氫氟酸溶液分別浸泡12 d和15 d，均能有效降低蝴蝶蘭莖段組織硬度，從而達(dá)到切片的軟硬度要求，切片呈蠟帶狀，組織結(jié)構(gòu)均較為完整，但存在組織皺縮現(xiàn)象（圖2A）；然而，當(dāng)氫氟酸溶液濃度提升至15%時(shí)，即使只浸泡12"d，材料仍出現(xiàn)了過度軟化的現(xiàn)象，組織松散易解離導(dǎo)致浸蠟不徹底，所得切片材料中間出現(xiàn)了較多的空洞，組織結(jié)構(gòu)皺縮變形（圖2B）；使用的傳統(tǒng)甘油-乙醇軟化液即使浸泡15 d，蝴蝶蘭組織材料形狀的改變不明顯，材料相對(duì)較硬，組織材料結(jié)構(gòu)破損嚴(yán)重，耗時(shí)久且效果差（圖2C）。因此，濃度為10%、12%的氫氟酸軟化劑均能有效軟化高木質(zhì)化的莖段組織至硬度適中的程度，對(duì)于以上軟化方法中存在的切片組織材料皺縮現(xiàn)象，需要進(jìn)一步優(yōu)化其脫水處理。

由以上結(jié)果可知，經(jīng)過10%、12%氫氟酸溶液浸泡12、15 d后并在軟化期間真空30 min的蝴蝶蘭組織能夠與石蠟融合成不可分離的狀態(tài)，能夠得到連續(xù)的蠟帶，有效降低后續(xù)浸蠟處理的難度?；诟咝Ч?jié)儉的原則，最終選擇10%氫氟酸，真空30 min，軟化12 d為最優(yōu)軟化處理。

2.3 "脫水方式的優(yōu)化

參照李和平^[12]的乙醇梯度脫水法制定脫水優(yōu)化方案，以傳統(tǒng)脫水處理為對(duì)照，探究不同的脫水過程對(duì)蝴蝶蘭莖段組織石蠟切片制作效果的影響。發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法從較高濃度起始進(jìn)行脫水，樣品組織迅速失水干癟，影響后續(xù)的浸蠟及包埋，切片皺縮嚴(yán)重，無(wú)法展平（圖3A）。結(jié)合蝴蝶蘭主莖木質(zhì)化程度高、硬度較大等特征，在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上依次增加了30%乙醇、50%乙醇、1∶1苯醇和二甲苯梯度溶液，脫水過程逐級(jí)細(xì)分，由低濃度到高濃度逐級(jí)進(jìn)行脫水，材料無(wú)變形破碎現(xiàn)象，所得蠟片切片效果好，切出的蠟片呈現(xiàn)完整蠟帶，且蠟帶平整無(wú)缺損（圖3B）。因此，蝴蝶蘭組織脫水的最優(yōu)處理為30%乙醇保持2 h，50%乙醇保持2"h，70%乙醇保持2"h，80%乙醇保持1"h，90%乙醇保持1"h，無(wú)水乙醇保持1"h，無(wú)水乙醇保持1"h，1∶1苯醇保持1"h，二甲苯保持2 h。

2.4" 優(yōu)化方法效果驗(yàn)證

石蠟切片中植物組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)是否完整，細(xì)胞是否清晰是判斷切片質(zhì)量的主要指標(biāo)^[13]。為驗(yàn)證優(yōu)化后的石蠟切片方法的效果，選取長(zhǎng)勢(shì)一致，長(zhǎng)度為10～12 mm、直徑為3～10 mm的帶腋芽莖段樣品30個(gè)，傳統(tǒng)石蠟切片方法處理與優(yōu)化石蠟切片方法處理各15個(gè)。結(jié)果表明：選用傳統(tǒng)處理方法所獲切片效果較差，切片時(shí)蠟帶粉碎，無(wú)法形成完整的蠟帶，中間組織皺縮變形嚴(yán)重，芽組織出現(xiàn)明顯破損，切片分色效果不明顯，難以清晰鑒別蝴蝶蘭腋芽的生長(zhǎng)狀況（圖4A），說明該方法可能無(wú)法較大程度地軟化樣本木質(zhì)部的硬度。優(yōu)化后的制片方法能夠得到連續(xù)的蠟帶，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)制作方法，處理后2種軟硬度相連接的組織材料細(xì)胞均較完好，能有效保持組織原有形態(tài)并解決細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形、固定不夠透徹造成組織破碎的問題，所獲切片的整體結(jié)構(gòu)趨于完整；后續(xù)染色效果好，各部分組織細(xì)胞著色明顯，并能清晰區(qū)分開柔軟的芽組織和木質(zhì)化的莖組織（圖4B），說明優(yōu)化后的石蠟切片方法適用于軟硬相接的蝴蝶蘭的帶腋芽莖段的微觀形態(tài)觀察。

3" 討論

本研究針對(duì)硬組織和軟組織相連接的2個(gè)部位進(jìn)行綜合考慮，優(yōu)化了適合2種材質(zhì)相連接的組織的石蠟切片制作方法，對(duì)固定時(shí)間、軟化液、

軟化時(shí)間、軟化步驟、脫水等制備步驟進(jìn)行了優(yōu)化，探索得到適合2種軟硬度相連接的蝴蝶蘭組織材料的最佳石蠟切片制作方法。改良后的石蠟

切片制備方法保證了對(duì)幼嫩腋芽組織破壞性較小的同時(shí)又能達(dá)到木質(zhì)化主莖部位的軟化要求。

3.1 "不同固定時(shí)間和處理對(duì)固定效果的影響

固定是石蠟切片標(biāo)本制作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其作用在于使蛋白質(zhì)變性、凝固、沉淀，保持細(xì)胞、組織的原有形態(tài)^[14-15]。固定時(shí)間受材料性質(zhì)、固定液、環(huán)境條件等因素影響，差別較大^[16]，固定時(shí)間對(duì)于獲得高質(zhì)量的切片至關(guān)重要，固定時(shí)間不對(duì)均會(huì)對(duì)組織的物理特性（如硬度、彈性等）產(chǎn)生不同的影響。固定時(shí)間過短，會(huì)導(dǎo)致組織錯(cuò)位破碎，切片時(shí)無(wú)法與蠟塊緊密貼合導(dǎo)致蠟帶粉碎，無(wú)法達(dá)到固定目的；固定時(shí)間過長(zhǎng)，則影響組織材料的染色性能，導(dǎo)致染色不均勻。因此，適宜的固定時(shí)間更易獲得硬度適中，結(jié)構(gòu)完整的切片。康云艷等^[8]在黃瓜幼苗莖段石蠟切片制作的固定流程中將FAA固定時(shí)間由24"h延長(zhǎng)至1周，確保固定液充分滲透組織，獲得了蠟帶連續(xù)、切片組織完整的高質(zhì)量切片。為了防止后期包埋蠟塊過程中材料受熱釋放空氣，表面出現(xiàn)氣泡影響切片質(zhì)量，固定時(shí)需要對(duì)固定液抽氣3次以排除材料中細(xì)胞間隙的空氣，直到液體中不再有氣泡產(chǎn)生。抽氣還可使固定液快速滲透到組織內(nèi)部，從而起到良好的固定效果，確保后續(xù)操作中蠟塊的質(zhì)量和切片的清晰度。抽氣的次數(shù)和時(shí)間可根據(jù)材料的類型和具體要求進(jìn)行調(diào)整。權(quán)金娥等^[13]將四倍體刺槐的插穗基部組織放入改良的FAA固定液中，對(duì)固定液抽真空至莖段組織下沉后保

存至少48"h，并以不進(jìn)行抽真空為對(duì)照，結(jié)果表明，在固定處理中添加抽真空步驟所制得的四倍體刺槐莖段組織切片表皮完整，細(xì)胞無(wú)萎縮變形，切片效果更好。本研究中，為了讓固定液充分滲透，保持組織原有形態(tài)，將固定時(shí)間由24 h延長(zhǎng)至48"h，并采用抽氣機(jī)抽氣排除固定液中氣泡的干擾，得到的切片成蠟帶狀、平整且無(wú)缺損。由此可見，在蝴蝶蘭軟硬相接組織的石蠟切片制樣過程中，對(duì)固定液進(jìn)行抽真空和采用適宜的固定時(shí)間更易獲得硬度適中，結(jié)構(gòu)完整的切片。這與張寶華^[17]的研究結(jié)論一致。

3.2" 不同氫氟酸濃度和處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)石蠟切片軟化的影響

對(duì)于蝴蝶蘭這類存在莖段與腋芽的軟硬度差異極大的材料，其各部分組織在硬度和密度上的不均勻是影響石蠟切片制樣效果的重要原因。非均質(zhì)化組織很難按照傳統(tǒng)石蠟切片制樣方法得到完整、高質(zhì)量切片^[6]。因此，適宜的軟化過程為石蠟切片制作的首要條件^[18]，如果對(duì)纖維化程度強(qiáng)、硬度較大的材料未進(jìn)行相應(yīng)的軟化處理，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)制片過程中的脫水劑與石蠟等物質(zhì)無(wú)法徹底滲入材料組織而影響浸蠟效果，切片時(shí)會(huì)出現(xiàn)蠟帶分離破碎現(xiàn)象。

石蠟切片中常用的軟化處理方法是甘油乙醇軟化法^[19]，甘油使組織材料柔軟易切，乙醇穿透組織能力強(qiáng)，可加快軟化速度，增加組織韌性。但因蝴蝶蘭莖段與腋芽的軟硬度差異極大，常規(guī)的甘油乙醇軟化方法無(wú)法平衡二者的軟化程度獲得完整的蠟帶，導(dǎo)致后續(xù)切片過程中也常伴有脫片、疊片的情況。氫氟酸軟化法常用于中藥材等的軟化處理，可很好地軟化木質(zhì)化程度高的脆硬材料^[20]，也可通過低濃度長(zhǎng)時(shí)間的浸泡方式軟化草本或質(zhì)地較軟的木本植物組織^[21]，但由于氫氟酸具有強(qiáng)腐蝕性，會(huì)破壞材料的組織結(jié)構(gòu)，需針對(duì)不同材料優(yōu)化濃度和浸泡時(shí)間等^[22-24]。安菊紅等^[18]根據(jù)8種不同入藥部位藥材不同纖維強(qiáng)度分別進(jìn)行相應(yīng)的軟化處理，對(duì)于木質(zhì)化程度強(qiáng)的桂枝，含有纖維及石細(xì)胞的厚樸、黑根藥等采用氫氟酸水溶液在加熱環(huán)境下進(jìn)行軟化，能有效達(dá)到軟化目的。程茂高等^[25]發(fā)現(xiàn)，僅用煮沸、浸泡的方法處理質(zhì)地堅(jiān)硬的骨碎補(bǔ)無(wú)法達(dá)到理想的軟化效果，還需用15%氫氟酸進(jìn)一步軟化。李葉等^[26]針對(duì)桑樹花芽表層木質(zhì)化程度較高的特性，采用15%氫氟酸溶液軟化處理10"d，有效解決了軟化不均勻造成的材料卷曲、材料破裂及部分組織分離和折疊問題。本研究選用氫氟酸溶液作為軟化劑，發(fā)現(xiàn)使用濃度為10%、12%的氫氟酸溶液軟化12、15"d并在軟化期間真空30"min，可以使蝴蝶蘭莖段的脆度和硬度大大降低，切片時(shí)組織不易碎，切片組織結(jié)構(gòu)完整。軟化過程的真空處理有助于去除材料中的空氣，促進(jìn)軟化劑迅速滲入組織內(nèi)部，提高軟化效率^[27]。優(yōu)化后的制備方法保證了對(duì)幼嫩腋芽細(xì)胞組織破壞性較小的同時(shí)又能達(dá)到木質(zhì)化主莖部位的軟化要求。

3.3 "不同脫水方式對(duì)石蠟切片效果的影響

脫水的主要目的是去除組織切片中的水分，使得材料與石蠟更好地結(jié)合，從而保持組織材料原有結(jié)構(gòu)和形態(tài)，供后續(xù)的染色和觀察。脫水時(shí)間和乙醇梯度濃度是影響浸蠟與染色的關(guān)鍵因素。石蠟切片中的脫水時(shí)間與植物材料的性質(zhì)和狀態(tài)密切相關(guān)^[27]。過快的脫水可能導(dǎo)致組織發(fā)生收縮和形態(tài)改變，影響切片的平整性和后續(xù)制片操作，因此脫水過程要逐步且溫和地進(jìn)行，確保組織既能夠有效去除水分，又不至于過度收縮而損傷。但是脫水時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使材料變硬，加大石蠟切片制樣難度，所以需要準(zhǔn)確把握各步驟的脫水時(shí)間，避免脫水過度造成材料硬度增加。常規(guī)的脫水流程是由70%乙醇至無(wú)水乙醇逐級(jí)進(jìn)行的，每級(jí)保持1～3 h，其中無(wú)水乙醇處理重復(fù)1～2次^[28]。材料為柔嫩組織時(shí)，使用高濃度乙醇對(duì)材料進(jìn)行脫水容易造成組織硬化變脆，在后續(xù)切片時(shí)導(dǎo)致切片易碎^[7-8]，所以在選擇乙醇脫水濃度時(shí)，最佳的方式是以較低濃度作為起始脫水濃度，再使用梯度法完全脫水。高東菊等^[29]針對(duì)黃瓜果實(shí)果瘤性狀和含水量較多的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，增加7個(gè)乙醇濃度梯度：50%乙醇（30"min，2次），60%乙醇（30"min），70%乙醇（30"min），80%乙醇（30"min），90%乙醇（30"min），95%乙醇（30"min），無(wú)水乙醇（30 min，2次），處理后的材料脫水徹底且不易皺縮，獲得石蠟切片制樣的最佳脫水方式和時(shí)間。左丹丹等^[30]對(duì)杉木種鱗脫水和透明時(shí)間優(yōu)化處理：50%乙醇（2 h），70%乙醇（過夜），85%乙醇（2 h），90%乙醇（2 h），95%乙醇（2 h），無(wú)水乙醇（1 h，2次），可將材料徹底脫水。為了避免高濃度乙醇對(duì)蝴蝶蘭幼嫩腋芽的直接傷害，本研究根據(jù)蝴蝶蘭莖段和潛伏芽的生長(zhǎng)特點(diǎn)，設(shè)置從30%至無(wú)水乙醇的逐級(jí)脫水梯度，并增加無(wú)水乙醇到二甲苯逐漸置換的步驟，避免了蝴蝶蘭組織材料收縮變形，得到了蝴蝶蘭組織石蠟切片最適脫水方法：30%乙醇（2"h），50%乙醇（2 h），70%乙醇（2 h），80%乙醇（1 h），90%乙醇（1 h），無(wú)水乙醇（1 h，2次），1：1苯醇（1 h），二甲苯（2 h）。雖然增加了總的脫水時(shí)間，但減少了后續(xù)切片中組織被切碎的風(fēng)險(xiǎn)，為后期的透明和浸蠟創(chuàng)造條件。因此，不同的材料脫水方式需要根據(jù)植物材料的特征進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整和優(yōu)化，只有達(dá)到適當(dāng)?shù)拿撍潭?，才能保證組織形態(tài)的完整性、切片的穩(wěn)定性和染色效果。

4" 結(jié)論

本研究以蝴蝶蘭金蝶帶腋芽的莖段為試驗(yàn)材料，針對(duì)這種軟硬相接的組織材料進(jìn)行綜合考慮，優(yōu)化得到一套適宜的石蠟切片制作方法：固定時(shí)對(duì)固定液抽真空并延長(zhǎng)固定時(shí)間至48 h及以上，固定效果最佳；使用濃度為10%、12%的氫氟酸溶液軟化12、15 d并在軟化期間真空30"min，可以使木質(zhì)化程度較高的莖段組織脆度和硬度大大降低，有效解決了軟化不均勻造成的組織分離破碎問題；脫水處理設(shè)置從30%至無(wú)水乙醇的7個(gè)逐級(jí)脫水梯度，并增加無(wú)水乙醇到二甲苯逐漸置換的步驟，避免了蝴蝶蘭組織材料收縮變形，保證其組織形態(tài)的完整性。優(yōu)化方法所制備的石蠟切片的出片質(zhì)量較好，完整度較高，處理后2種軟硬度相連接的組織材料細(xì)胞均較完好，說明優(yōu)化后的石蠟切片制作方法能更好地保持切片中材料組織整體細(xì)胞的完整性，并能清晰區(qū)分柔軟組織和木質(zhì)化的較硬組織，能夠同時(shí)對(duì)緊密相連的2種差異組織材料開展很好的微觀形態(tài)觀察。

參考文獻(xiàn)

[1]"""""" 呂秉韜， 吳靜雪， 馬關(guān)喜， 金蓉， 孫德利， 胡衛(wèi)珍， 陳利萍， 齊振宇. 6-BA對(duì)不同品種蝴蝶蘭開花性狀的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2020， 61（6）： 1115-1118.LYU B T， WU J X， MA G X， JIN R， SUN D L， HU W Z， CHEN L P， QI Z Y. Effects of 6-BA on flowering traits of different Phalaenopsis cultivars[J]. Zhejiang Agricultural Sciences， 2020， 61（6）： 1115-1118. （in Chinese）

[2]"""""" COATES P J. Paraffin section molecular biology： review of current techniques[J]. Journal of Histotechnology， 1991， 14（4）： 263-269.

1. DAY R C. Laser microdissection of paraffin-embedded plant tissues for transcript profiling[J]. Plant Developmental Biology， 2010， 655： 321-346.
2. 閆紹鵬. 歐美山楊雜種扦插生根的理化與分子機(jī)理研究[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2011.YAN S P. Study on physiological， biochemical and molecular mechanism of rooting to Populus tremula ×P.tremu-loi-des[D]. Harbin： Northeast Forestry University， 2011. （in Chinese）
3. 吳清韓， 趙慶芳， 朱慧， 馬瑞君. 植物高度木質(zhì)化葉片表皮細(xì)胞制備方法[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2012， 47（4）： 422-426.WU Q H， ZHAO Q F， ZHU H， MA R J. A method to improve sample preparation for observing epidermis of highly lignified leaf[J]. Chinese Bulletin of Botany， 2012， 47（4）： 422-426. （in Chinese）
4. 周乃富， 張俊佩， 劉昊， 查巍巍， 裴東. 木本植物非均質(zhì)化組織石蠟切片制作方法[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2018， 53（5）： 653-660.ZHOU N F， ZHANG J P， LIU H， ZHA W W， PEI D. New protocols for paraffin sections of heterogeneous tissues of woody plants[J]. Chinese Bulletin of Botany， 2018， 53（5）： 653-660. （in Chinese）

[7]"""""" 陳利娜， 薛輝， 李好先， 牛娟， 張杰， 劉貝貝， 張富紅， 趙弟廣， 曹尚銀. 石榴花芽石蠟切片制作方法的改良[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45（2）： 1-3， 16.CHEN L N， XUE H， LI H X， NIU J， ZHANG J， LIU B B， ZHANG F H， ZHAO D G， CAO S Y. Improvements of traditional paraffin section for pomegranate floral bud[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2017， 45（2）： 1-3， 16. （in Chinese）

[8]"""""" 康云艷， 宋愛婷， 柴喜榮， 楊暹. 黃瓜幼苗莖段石蠟切片制作和番紅染色實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)[J]. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理， 2022， 39（1）： 182-184， 190.KANG Y Y， SONG A T， CHAI X R， YANG X. New protocols for paraffin sections and safranine staining of cucumber stems[J]. Experimental Technology and Management， 2022， 39（1）： 182-184， 190. （in Chinese）

[9]"""""" 陳林， 王清隆， 王祝年. 海南龍血樹莖干石蠟切片技術(shù)的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45（10）： 5-7， 21.CHEN L， WANG Q L， WANG Z N. Study on the paraffin section technology of Dracaena cambodiana stems[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2017， 45（10）： 5-7， 21. （in Chinese）

[10]""" 張馨文， 劉麗萍. 蒲公英石蠟切片技術(shù)研究[J]. 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物， 2022， 25（10）： 18-20.ZHANG X W， LIU L P. Study on paraffin section technology of Taraxacum mongolicum[J]. Special Economic Animals and Plants， 2022， 25（10）： 18-20. （in Chinese）

[11]""" 張志誠(chéng)， 程海濤. 常規(guī)植物石蠟切片方法的改進(jìn)[C]//第十五屆全國(guó)中藥標(biāo)本館學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第十二屆中國(guó)中藥鑒定學(xué)教學(xué)研討會(huì)論文集， 2017： 167-168.ZHANG Z C， CHENG H T. Improvement of conventional plant paraffin section method[C]//Proceedings of the 15^th National Herbarium of Chinese Materia Medica Academic Seminar and the 12^th Chinese Materia Medica Identification Teaching Seminar， 2017： 167-168. （in Chinese）

[12]""" 李和平."植物顯微技術(shù)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2009.LI H P. Plant microscopy[M]. Beijing： Higher Education Press， 2009. （in Chinese）

[13]""" 權(quán)金娥， 朱海蘭， 張春霞， 張勝， 趙忠. 四倍體刺槐莖段組織石蠟切片的制作方法[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2014， 29（3）： 140-144.QUAN J E， ZHU H L， ZHANG C X， ZHANG S， ZHAO Z. Preparation of paraffin section of tetraploid Robinia pseudoacacia stem segment tissue[J]. Journal of Northwest Forestry University， 2014， 29（3）： 140-144. （in Chinese）

[14]""" 張新梅， 董曉英， 沈仁芳. 水稻幼嫩根尖常規(guī)石蠟切片制作技術(shù)改良[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 41（12）： 71-73.ZHANG X M， DONG X Y， SHEN R F. Improvement of conventional paraffin cutting technique for young root tips of rice[J]. Jiangsu Agricultural Sciences， 2013， 41（12）： 71-73. （in Chinese）

[15]""" 龔志錦， 詹镕洲. 病理組織制片和染色技術(shù)[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1994.GONG Z J， ZHAN R Z. Pathological tissue preparation and staining techniques[M]. Shanghai： Shanghai Science and Technology Press， 1994. （in Chinese）

[16]""" 侯春春， 徐水. 淺析影響石蠟切片質(zhì)量的關(guān)鍵因素[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2009， 25（23）： 94-98.HOU C C， XU S. Analysis on the key influence factors of paraffin section’s quality[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2009， 25（23）： 94-98. （in Chinese）

[17]""" 張寶華. 聚焦植物石蠟切片制作[J]. 吉林省教育學(xué)院學(xué)報(bào)（下旬）， 2013， 29（4）： 153-154.ZHANG B H. Focus on plant paraffin section production[J]. Journal of Educational Institute of Jilin Province： Late， 2013， 29（4）： 153-154. （in Chinese）

[18]""" 安菊紅， 朱婷婷， 邱偉珊， 楊月， 鐘世紅. 不同入藥部位干藥材石蠟制片方法的改良研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2024， 50（4）： 408-417.AN J H， ZHU T T， QIU W S， YANG Y， ZHONG S H. A study on the improvement of the method for paraffin sectioning of dried herbs from different parts of the medicinal plant[J]. Journal of Southwest Minzu University （Natural Science Edition）， 2024， 50（4）： 408-417. （in Chinese）

[19]""" 胡玉熹， 林金星. 高度木質(zhì)化材料軟化的簡(jiǎn)便方法[J]. 生命世界， 2000（3）： 31.HU Y X， LIN J X. A simple method for softening highly lignified materials[J]. 2000（3）： 31. （in Chinese）

[20]""" TOMASI V H， ROVASIO R A. Softening of plant specimens （Equisetaceae） to improve the preparation of paraffin sections[J]. Biotechnic amp; Histochemistry 1997， 72（4）： 209-212.

[21]""" 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院. 文冠果扦插枝條及其愈傷組織的石蠟制片方法： CN201810977753.6[P]. 2021-06-25.Henan University of Animal Husbandry and Economy. Para-f-fin paraffin preparation of cuttings and callus of Xanthoceras sorbifolium Bunge： CN201810977753.6[P]. 2021-06- 25. （in Chinese）

[22]nbsp;"" 程蓮銀. 干、硬中藥材作石蠟切片的技術(shù)處理方法[J]. 中國(guó)藥師， 2000（6）： 374.CHENG L Y. Technical treatment method for paraffin sections of dry and hard Chinese herbal materials[J]. China Pharmacist， 2000（6）： 374. （in Chinese）

[23]""" 徐彥， 陳佳正， 吳春蕾， 張志鋒. 11種常用中藥材在石蠟切片中的軟化處理方法[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2010， 36（4）： 603-605.XU Y， CHEN J Z， WU C L， ZHANG Z F. Study on the softening method of 11 kinds of Chinese material medica for preparing paraffin sections[J]. Journal of Southwest Minzu University （Natural Science Edition）， 2010， 36（4）， 603-605. （in Chinese）

[24]""" 尤華明， 劉銀春， 劉寶， 陳峰. 竹桿、馬尾松莖木質(zhì)材料超薄切片技術(shù)[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2007， 27（4）： 376-379.YOU H M， LIU Y C， LIU B， CHEN F. Technique of ultrat-hin slicing of bamboo and Pinus massoniana stems[J]. Journal of Fujian College of Forestry， 2007， 27（4）： 376-379. （in Chinese）

[25]""" 程茂高， 喬卿梅， 魏志華， 韋小敏， 楊瑾， 李苗青. 不同軟化方法對(duì)干燥骨碎補(bǔ)石蠟切片的影響[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志， 2015， 34（3）： 29-30.CHENG M G， QIAO Q M， WEI Z H， WEI X M， YANG J， LI M Q. Effect of different softening methods on paraffin section quality of dried Rhizoma Drynarias [J]. Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine， 2015， 34（3）： 29-30. （in Chinese）

[26]""" 李葉， 劉家糧， 武華周， 林培群， 皇晶晶， 王樹昌. 一種優(yōu)化的桑樹花芽石蠟切片制作方法[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2024， 44（4）： 58-64.LI Y， LIU J L， WU H Z， LIN P Q， HUANG J J， WANG S C. An improved method for paraffin sections of mulberry flower bud[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture， 2024， 44（4）： 58-64. （in Chinese）

[27]""" 吳華， 陳娉婷， 袁玲， 徐永榮， 陳龍清. 蕨類植物石蠟切片制作技術(shù)探討[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 50（18）： 3767- 3769， 3774.WU H， CHEN P T， YUAN L， XU Y R， CHEN L Q. Study on the technique of making paraffin sections of fern[J]. Hubei Agricultural Sciences， 2011， 50（18）： 3767-3769， 3774. （in Chinese）

[28]""" 王灶安. 植物顯微技術(shù)[M]. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1992.WANG Z A. Plant microscopy[M]. Beijing： Agriculture Press， 1992. （in Chinese）

[29]""" 高東菊， 鮑文敏， 陳岳， 潘俊松， 張微微. 黃瓜果瘤石蠟切片制片技術(shù)[J]. 分子植物育種， 2020， 18（21）： 7143-7148.GAO D J， BAO W M， CHEN Y， PAN J S， ZHANG W W. Paraffin section technology of fruit tumor tissues in cucumber （Cucumis sativus L.）[J]. Molecular Plant Breeding， 2020， 18（21）： 7143-7148. （in Chinese）

[30]""" 左丹丹， 熊升， 李佳， 饒麗莎， 林思祖， 陳宇. 杉木種鱗石蠟切片工藝優(yōu)化研究[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)）， 2018， 38（1）： 59-65.ZUO D D， XIONG S， LI J， RAO L S， LIN S Z， CHEN Y. Process optimization of paraffin section method for scale of Cunninghamia lanceolata[J]. Journal of Southwest Forestry University （Natural Sciences）， 2018， 38（1）： 59-65. （in Chinese）