基因編輯水稻RPA-CRISPR/Cas12b快速檢測(cè)方法的建立

生命科學(xué)學(xué)院/湖北省豆類[蔬菜]植物工程技術(shù)研究中心/湖北省食用豆類自然科技資源中心，武漢 430056；2.中國(guó)質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)科學(xué)研究院，北京100176；3.三亞中國(guó)檢科院生物安全中心，海南三亞572024）

基因編輯是一種能夠?qū)蚪M進(jìn)行定點(diǎn)修飾的基因工程技術(shù)[1]。近年來(lái)，伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白系統(tǒng)（clusteredregularlyinterspacedshort palindromic repeats associated protein，CRISPR/Cas）作為一種新興的基因編輯工具，因其具有高效性、精確性和靈活性而被廣泛應(yīng)用[2-3]。其中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是常用的基因編輯系統(tǒng)，通過(guò)在特定基因組位點(diǎn)引入插入、缺失或替換堿基等方式實(shí)現(xiàn)基因的特異性改造，從而對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行定向改良[4-6]?，F(xiàn)階段已出現(xiàn)多種由基因編輯技術(shù)定點(diǎn)修飾基因組而獲得的新性狀作物，如耐鹽水稻和耐貯番茄[7-9]、抗除草劑水稻[10-11]、抗白粉病辣椒[12]、高產(chǎn)玉米[13-14]等，但是對(duì)其誤用和濫用可能危害生物安全。因此，加強(qiáng)對(duì)基因編輯作物及其產(chǎn)品的監(jiān)管，并開(kāi)發(fā)高靈敏度和高特異性的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)保障生物安全具有重要意義。

基因編輯技術(shù)在不引入外源DNA的條件下，可在編輯位點(diǎn)處實(shí)現(xiàn)堿基插入、缺失、替換或這3種類型的混合突變。這使得基因編輯突變體與親本之間在基因組水平上差異極小，極大地增加了檢測(cè)難度。因此，迫切需要研發(fā)更精準(zhǔn)、高效的檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因編輯產(chǎn)品的精準(zhǔn)識(shí)別與檢測(cè)[15-16]。目前，已報(bào)道了多種基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)方法。例如，基于T7核酸內(nèi)切酶I（T7endo-nuclease I）[17]、Surveyor酶[18]和Cruiser酶[19]等酶切檢測(cè)技術(shù)，可估計(jì)突變效率，但成本較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格?；诰酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)（polymer-asechainreaction，PCR）的檢測(cè)技術(shù)，如臨界退火溫度PCR、TaqMan方法和高分辨率熔解曲線法等[15]，其靈敏度高，且可實(shí)現(xiàn)對(duì)單堿基突變的檢測(cè)，但實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜，耗時(shí)耗力。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是目前常用的一種檢測(cè)技術(shù)，該系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白Cas12、Cas13和Cas14均被報(bào)道具有非特異性切割核酸特性。利用Cas蛋白的反式切割活性，結(jié)合人工合成單鏈向?qū)NA（single guide RNA， sgRNA） 和單鏈DNA（singlestrandedDNA，ssDNA）熒光報(bào)告分子；當(dāng)sgRNA識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)序列時(shí)，系統(tǒng)隨即被激活，同時(shí)熒光報(bào)告分子被切割，從而釋放出熒光信號(hào)，完成對(duì)目標(biāo)序列的檢測(cè)[20]?；贑RISPR/Cas系統(tǒng)的這一原理，可以將其與核酸擴(kuò)增方法如PCR、RPA和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-me-diated isothermal amplification，LAMP）等相結(jié)合，對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段快速、特異性檢測(cè)。在這些核酸擴(kuò)增方法中，RPA以其操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)速度快以及對(duì)設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用[21]。例如，有研究報(bào)道了CRISPR/Casl2a結(jié)合RPA，在 40min 內(nèi)即可在1個(gè)反應(yīng)管中完成對(duì)基因編輯水稻突變體的現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)。該技術(shù)顯示出對(duì)水稻突變體檢測(cè)的巨大潛力，尤其是對(duì)單堿基突變體的檢測(cè)[22]。此外，利用SpCas9突變體SpRY開(kāi)發(fā)了CRISPR/SpRY檢測(cè)平臺(tái)[23-24]。該平臺(tái)可精準(zhǔn)檢測(cè)基因編輯水稻樣本的TGW位點(diǎn)，并結(jié)合RPA開(kāi)發(fā)了“一管法\"CRISPR/SpRY 測(cè)定方法，可在 ¹h 內(nèi)成功鑒定各種類型的突變，包括插人、缺失和替換，且具有良好的靈敏度。相比其他傳統(tǒng)檢測(cè)方法，CRISPR/Cas檢測(cè)技術(shù)在基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域顯示出顯著的優(yōu)勢(shì)，其不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因編輯產(chǎn)品的快速、靈敏、特異檢測(cè)，還具備可視化的特點(diǎn)，極大地提高了檢測(cè)效率與準(zhǔn)確性，具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前CRISPR/Cas12b系統(tǒng)已在多個(gè)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，但其在基因編輯水稻檢測(cè)方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究以基因編輯水稻為材料，建立基于RPA-CRPSPR/Casl2b快速可視化檢測(cè)方法，從而為基因編輯產(chǎn)品研發(fā)和有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1水稻材料研究所用的野生型（WT）水稻‘日本晴'（japonica），水稻SWEET14基因編輯突變體由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢驗(yàn)與檢疫研究所保存。

1.1.2主要試劑多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒（DP360，天根生化科技有限公司）；RPA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型）

（WLB8201KIT，安普未來(lái)生物科技有限公司）；DNA提取酚試劑（T0250，北京索萊寶科技有限公司）；無(wú)酶無(wú)菌水（R1600，北京索萊寶科技有限公司）;SynSorAaCasl2b（C2cl）蛋白（V2.0版本，北京迅識(shí)生物科技有限公司）等。

1.2方法

1.2.1水稻基因組提取剪取適量水稻葉片，加入液氮后充分研磨，稱取約 100mg 于 2mL 離心管中，按照多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒（DP360，天根生化科技有限公司）說(shuō)明書提取樣品DNA，于一 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2RPA 引物、 sgRNA 及ssDNA熒光報(bào)告分子設(shè)計(jì)根據(jù)水稻SWEET14基因序列，使用Primer5.O軟件設(shè)計(jì)RPA引物。CRISPR/Cas9基因編輯突變體水稻SWEET14基因序列及編輯靶位點(diǎn) （5^′3^′） 如圖1所示，突變靶位點(diǎn)信息見(jiàn)表1。RPA引物、sgRNA及ssDNA熒光報(bào)告分子序列均由生工生物工程科技（北京）有限公司合成（表2）。

1.2.3RPA-CRISPR/Casl2b檢測(cè)方法RPA擴(kuò)增體系（共 50μL ：向每個(gè)干粉管中加入ABuffer 29μL （主要成分重組酶、DNA聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白等），RPA上游和下游引物（ Ω_Ω10μmol/L） 各 2μL，ddH₂O 12μL ，待測(cè)樣品DNA 模板2.5μL ，最后加入BBuffer 2. 5μL （主要成分為Mg²⁺ ，激活RPA反應(yīng)），混合均勻后于加熱金屬浴上 39^°C 孵育 30min ，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，加入Tris飽和酚/氯仿/異戊醇（ 25： 24：1） 抽提液 1：1 提純，充分混勻，12000r/min 離心 5min ，取 10μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 2% 瓊脂糖凝膠電泳確定結(jié)果。

CRISPR/Cas12b熒光檢測(cè)體系（共 50μL） “AaCasl2b（2.5 μmol/L ）2 μL ，sgRNA（3μmol/L）1μL，10×AaCas12b Buffer 5μL ， ssD-NA熒光報(bào)告分子 （10μmol/L）0.5μL ，RPA反應(yīng)產(chǎn)物 1μL，ddH₂O 補(bǔ)足 50μL ，充分混勻后于加熱金屬浴上 45^°C 反應(yīng) 25min ，使用便攜式藍(lán)光儀 （440～460nm） 進(jìn)行可視化檢測(cè)，當(dāng)肉眼觀察到溶液發(fā)綠色熒光時(shí)，即可判定待測(cè)樣品為陽(yáng)性。1.2.4RPA-CRISPR/Casl2b反應(yīng)條件優(yōu)化以WT水稻DNA為模板，進(jìn)行RPA-CRISPR/Cas12b反應(yīng)條件優(yōu)化。（1）RPA反應(yīng)條件優(yōu)化。根據(jù)設(shè)計(jì)的4條RPA引物篩選特異性引物；設(shè)置RPA反應(yīng)時(shí)間分別為 5min?10min.15min?20 min.25min.30min ，其他反應(yīng)條件保持不變，以 作為陰性對(duì)照，篩選RPA最適反應(yīng)時(shí)間。（2）CRISPR/Casl2b反應(yīng)條件優(yōu)化。 ① 基于RPA最適反應(yīng)條件，共設(shè)置7個(gè)反應(yīng)溫度，分別為 35^°C?40^°C?45^°C?50^°C?55^°C?60^°C?65^°C 其他反應(yīng)條件保持不變，以 作為陰性對(duì)照，按照“1.2.3\"體系進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果使用便攜式藍(lán)光儀檢測(cè)。 ② 固定Cas12b的濃度為100nmol/L不變，分別設(shè)置Casl2b與sgRNA的比例為 1：0.5，1：1，1：2，1：5，1：10 ；設(shè)置Cas12b與sgRNA濃度均為 篩選最佳的Cas12b與sgRNA的比例和濃度。③ 為篩選ssDNA熒光報(bào)告分子最適濃度，分別設(shè)置ssDNA熒光報(bào)告分子終濃度為 nmol/L.400nmol/L.600nmol/L.800nmol/L.

，在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下進(jìn)行。④ 設(shè)置6個(gè)反應(yīng)時(shí)間，分別是 3min，5min，7 minmin?11minmin ，其他反應(yīng)條件保持不變，在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下進(jìn)行，篩選CRISPR/Cas12b最適反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5RPA-CRISPR/Casl2b 靈敏度驗(yàn)證分別設(shè)置樣品DNA 濃度為 200ng/μL，100ng/μL ， ， 1ng/μL 、 、 、1pg/μL，100fg/μL，ddH₂O 作為陰性對(duì)照，按照優(yōu)化后的最適條件進(jìn)行RPA-CRISPR/Cas12b檢測(cè)，結(jié)果使用便攜式藍(lán)光儀檢測(cè)，確定RPA-CRISPR/Cas12b的檢測(cè)靈敏度。

1.2.6實(shí)際樣品驗(yàn)證 使用野生型水稻的sgRNA（WT-sgRNA）和突變水稻sgRNA（TB1-sgRNA、TB2-sgRNA），以突變水稻DNA為陽(yáng)性樣品，設(shè)置WT水稻DNA、 為對(duì)照，利用建立的RPA-CRISPR/Casl2b方法檢測(cè)突變水稻樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA引物篩選

以WT水稻樣品DNA為模板，對(duì)4條RPA引物進(jìn)行篩選。結(jié)果如圖2所示，對(duì)比各泳道擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，其中F3/R3引物相對(duì)其他引物擴(kuò)增效率更高，熒光強(qiáng)度最大。由于Cas12b蛋白識(shí)別靶標(biāo)依賴TTN（N為任意堿基）PAM位點(diǎn)，因而將F3引物第23位堿基 （5^′3^′）C 突變?yōu)閴A基T，引人Casl2bPAM位點(diǎn)。F3/R3擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，結(jié)果與目標(biāo)序列大小一致，且成功引入Cas12bPAM位點(diǎn)，因此選擇F3/R3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 RPA反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

RPA反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果如圖3所示，反應(yīng)5min 時(shí)無(wú)擴(kuò)增條帶，隨著反應(yīng)進(jìn)行，擴(kuò)增條帶亮度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到 25min ，擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，但在 30min 時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶有拖尾現(xiàn)象。因此，確定RPA最佳反應(yīng)時(shí)間為 25min 。

圖2RPA引物篩選Fig.2RPA primer screening

2.3 RPA-CRISPR/Cas12b反應(yīng)溫度優(yōu)化

RPA-CRISPR/Cas12b體系反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果如圖4所示，當(dāng)溫度為 35^°C 時(shí)，未出現(xiàn)明顯的綠色熒光；隨著反應(yīng)溫度升高，綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)溫度為 55^°C 時(shí)，綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大；繼續(xù)升高反應(yīng)溫度，綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。此結(jié)果表明溫度過(guò)低或過(guò)高均會(huì)抑制Cas12b的酶切活性。因此，選擇 55^°C 作為反應(yīng)溫度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 Cas12b與sgRNA濃度比例優(yōu)化

Cas12b與sgRNA濃度比例的優(yōu)化結(jié)果如圖5-A所示，當(dāng)Casl2b與sgRNA濃度比例為 1：1 時(shí)，反應(yīng)管中綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度最高；隨著sgRNA濃度比例提高，反應(yīng)管中綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低，這表明sgRNA高濃度會(huì)抑制Casl2b的剪切效率。Casl2b與sgRNA濃度篩選結(jié)果如圖5-B所示，按照Cas12b與sgRNA的濃度比例為 ，設(shè)置12.5nmol/L、25nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L 和 200nmol/L共5個(gè)濃度，當(dāng)Casl2b與sgRNA濃度由 12.5nmol/L 逐漸增加至 200nmol/L 時(shí)，反應(yīng)管中綠色熒光強(qiáng)度隨著濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度為 100nmol/L 時(shí)綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大。研究結(jié)果表明，Cas12b與sgRNA的濃度比例為 1：1 且濃度均為 100nmol/L 時(shí)，反應(yīng)體系達(dá)到最優(yōu)反應(yīng)條件。

2.5ssDNA熒光報(bào)告分子濃度篩選

ssDNA熒光報(bào)告分子濃度優(yōu)化結(jié)果如圖6所示，隨著ssDNA熒光報(bào)告分子濃度增加，反應(yīng)管中綠色熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。當(dāng)ssDNA熒光報(bào)告分子終濃度為 600nmol/L 時(shí)，反應(yīng)管中綠色熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，繼續(xù)增加ssDNA熒光報(bào)告分子終濃度，綠色熒光強(qiáng)度無(wú)顯著變化。因此，本反應(yīng)體系的ssDNA熒光報(bào)告分子最適濃度為600nmol/L 。

2.6 RPA-CRISPR/Cas12b檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

RPA-CRISPR/Cas12b檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果如圖7所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為 3min 時(shí)，反應(yīng)管出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，但信號(hào)較弱。隨著反應(yīng)時(shí)間增加，反應(yīng)管中熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到 11min 時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，綠色熒光強(qiáng)度無(wú)顯著變化。因此，本反應(yīng)體系的最適反應(yīng)時(shí)間為 11min 。

2.7 RPA-CRISPR/Cas12b檢測(cè)體系靈敏度

為驗(yàn)證RPA-CRISPR/Cas12b檢測(cè)靈敏度，以WT水稻DNA為模板，分別設(shè)置模板濃度為200ng/μL，100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100 pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，N 表示陰性對(duì)照。按照優(yōu)化后的最佳條件進(jìn)行RPAC-RISPR/Cas12b檢測(cè)。結(jié)果如圖8所示，CRISPR/Casl2b的檢測(cè)靈敏度可達(dá) 1pg/μL 。

2.8 實(shí)際樣品驗(yàn)證

利用建立的RPA-CRISPR/Cas12b檢測(cè)方法對(duì)CRISPR/Cas9基因編輯突變體水稻進(jìn)行檢測(cè)。如圖9-A所示，當(dāng)檢測(cè)體系中sgRNA為WT-sgRNA時(shí)，WT水稻樣品可以觀察到明顯綠色熒光信號(hào)，空白對(duì)照（CK）以及突變1和突變2基因編輯水稻樣品均未觀察到熒光信號(hào)。當(dāng)檢測(cè)體系中sgRNA為TBl-sgRNA時(shí)，如圖9-B所示，突變1水稻樣品可以觀察到明顯熒光信號(hào)，WT水稻樣品和空白對(duì)照（CK）檢測(cè)均未觀察到熒光信號(hào)。如圖9-C所示，當(dāng)檢測(cè)體系中sgRNA為TB2-sgRNA時(shí)，突變2水稻樣品可以觀察到明顯熒光信號(hào)，WT水稻樣品和空白對(duì)照（CK）檢測(cè)均未觀察到熒光信號(hào)。表明研究建立的RPA-CRISPR/Cas12b熒光檢測(cè)體系能夠準(zhǔn)確識(shí)別并檢測(cè)到單堿基突變的基因編輯水稻樣品，具有較高的特異性。

3討論

RPA-CRISPR/Casl2b檢測(cè)方法作為一種新興的分子診斷技術(shù)，在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域備受矚目，該方法結(jié)合了重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）的快速擴(kuò)增特性與CRISPR/Cas12b系統(tǒng)的高靈敏性和特異性，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)核酸的高精準(zhǔn)檢測(cè)，在實(shí)際應(yīng)用中得到廣泛認(rèn)可。在基因編輯產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所開(kāi)發(fā)了基于CRISPR/Casl2a的便攜式快速可視化檢測(cè)生物傳感平臺(tái)，將RPA反應(yīng)試劑放置在反應(yīng)管底部，CRISPR/Cas12a反應(yīng)試劑預(yù)置在管蓋里，實(shí)現(xiàn)了2個(gè)反應(yīng)的一體化檢測(cè)， 40min 內(nèi)完成對(duì)基因編輯水稻的檢測(cè)，可在藍(lán)光下肉眼觀測(cè)結(jié)果，該平臺(tái)基于 Cas12a/ CRISPR/crRNA復(fù)合體對(duì)靶標(biāo)序列的準(zhǔn)確識(shí)別，在檢測(cè)少數(shù)幾個(gè)堿基變異及SV突變時(shí)表現(xiàn)出良好的性能，檢測(cè)限為12 copies/ μL^[22] 。Wang等[25]將多重RPA與Casl2a 結(jié)合，開(kāi)發(fā)了單管檢測(cè)系統(tǒng)，使用便攜式藍(lán)光儀實(shí)現(xiàn)對(duì)基因編輯豬的CD163基因和乳鐵蛋白基因的熒光可視化檢測(cè)，與傳統(tǒng)PCR檢測(cè)相比，可以更準(zhǔn)確區(qū)分基因編輯豬與野生型豬，在 30min 內(nèi)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)每個(gè)反應(yīng) 8×10³ copies。在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方面，Han等[26]將耐熱Casl2b與LAMP結(jié)合開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法，結(jié)果表明耐熱Cas12b最適溫度在 60^°C 左右，與LAMP技術(shù)的最適反應(yīng)溫度相一致，能夠檢測(cè)到10copies/ μL 的質(zhì)粒

DNA樣品，在 40min 內(nèi)檢測(cè)到 0.05% 的轉(zhuǎn)基因含量。與Cas12a最適反應(yīng)溫度 37°C 相比，CRISPR/Cas12b可在更高的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，出現(xiàn)非特異剪切的概率更低，對(duì)單堿基突變的檢測(cè)更為精準(zhǔn)[27]。本研究基于Cas12b的這些優(yōu)點(diǎn)，建立了RPA-CRISPR/Cas12b基因編輯水稻檢測(cè)方法。

本研究設(shè)置CRISPR/Cas12b反應(yīng)溫度為35～65^°C ，相鄰溫度 5^°C 梯度。結(jié)果表明Cas12b在 40～60°C 均有明顯反應(yīng)，最適溫度為55°C ，結(jié)果與已報(bào)道的Cas12b最適反應(yīng)溫度基本一致。不同提取來(lái)源的Cas12b其最適反應(yīng)溫度也存在一定差異，為確定其更準(zhǔn)確的最適反應(yīng)溫度，可在 50～60^°C 范圍設(shè)置更小跨度的溫度梯度，進(jìn)而確定誤差在 1°C 左右的最適溫度。除了反應(yīng)溫度， Cas12b/sgRNA 復(fù)合體的準(zhǔn)確剪切也依賴于PAM位點(diǎn)，Casl2b蛋白識(shí)別靶標(biāo)依賴TTN（N為任意堿基）PAM位點(diǎn)，本研究在RPA反應(yīng)正向引物上1個(gè)堿基C突變?yōu)閴A基T，引入Cas12bPAM位點(diǎn)，成功檢測(cè)到CRISPR/Cas9單堿基基因編輯突變水稻。研究建立的檢測(cè)體系整個(gè)反應(yīng)時(shí)間不超過(guò) 36min ，其中RPA擴(kuò)增時(shí)間為 25min ，CRISPR/Cas12b反應(yīng)時(shí)間為 11min 與傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法相比，明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間。本方法檢測(cè)靈敏度為 1pg/μL ，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度相當(dāng)[28]。隨著sgRNA與Cas12b濃度比例提高，反應(yīng)管中綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度反而逐漸降低，說(shuō)明過(guò)高的sgRNA濃度會(huì)對(duì)

Cas12b的剪切效率造成干擾，因此，針對(duì)sgRNA與Cas12b的濃度比例進(jìn)一步精細(xì)優(yōu)化有利于提高檢測(cè)效率并降低成本。研究使用便攜式藍(lán)光儀實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果可視化，后續(xù)可進(jìn)一步結(jié)合CRISPR/Cas12b核酸檢測(cè)試紙條，使檢測(cè)結(jié)果的呈現(xiàn)不依賴儀器設(shè)備。

4結(jié)論

Casl2b在sgRNA的引導(dǎo)下，能夠精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)序列。研究設(shè)計(jì)的3條sgRNA可以準(zhǔn)確區(qū)分單堿基突變的基因編輯水稻與野生型水稻，具有較高的特異性。

研究建立的方法檢測(cè)時(shí)間不超過(guò) 36min ，檢測(cè)靈敏度可達(dá) 1pg/μL ，具有反應(yīng)快速、靈敏度高的特點(diǎn)。

研究建立的RPA-CRISPR/Cas12b檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)便攜式現(xiàn)場(chǎng)快速可視化檢測(cè)。

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Establishment of a Rapid Detection Method for Gene-edited Rice Using RPA-CRISPR/Cas12b

LUO Liang1，2，NIU Mengliang1，QIAN Yike1，F(xiàn)U Wei3 ， WANG Zhi ² ，WANG Mengyu3 ，ZHAO Wenjun ^2，3 and HU Guang2

（1.School of Life Sciences，Jianghan University/Hubei Province Engineering Research Center for Legume Plants/Hubei Province Natural Science Resource Center of Edible Legume，Wuhan 43oo56，China;

2.Chinese Academy of Quality and Inspection amp; Testing，Beijing 1Oo176，China;3.Center for Biosafety， Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Sanya Hainan 572o24，China）

Abstract This study established a rapid visual detection method based on recombinase polymerase amplification （RPA） combined with CRISPR （clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Casl2b （CRISPR-associated protein l2b） for detecting mutation sites in the SWEET14 gene of gene-edited rice，providing technical support for the detection of gene-edited rice.By optimizing the reaction system，the optimal conditions were determined as follows：a reaction temperature of 55°C，a 1：1 molar ratio of Casl2b to sgRNA，and a final concentration of the ssDNA reporter at 600nmol/L Under these conditions，results could be directly observed using a portable blue light transilluminator after 36 minutes of reaction，with a detection sensitivity of 1pg/μL . The system was capable of effectively distinguishing between single-base-mutated gene-edited rice and wild-type rice. The RPACRISPR/Casl2b rapid visual detection system established in this study is not only applicable for detecting single-base mutations in gene-edited rice but also serves as a technical reference for the detection of other gene-edited products.

Key wordsRPA;CRISPR/Casl2b;Rapid detection;Gene-edited;Rice

Received 2024-10-30 Returned 2025-01-13

Foundation item The Key Research and Development Project of Hainan Province （No. ZDYF2024XDNY160）.

First author LUO Liang，female，master student.Research area：gene-edited crop detection methods. E-mail：19006441251@163.com

Corresponding author NIU Mengliang，male，Ph. D，master supervisor. Research area：development of industrialized seedling cultivation and green pest control technologies.E-mail：nfuyuer@163.com HU Guang，male，Ph.D，master supervisor. Research area：development and detection of biotechnology products. E-mail：huguang@caiq. org. cn

[責(zé)任編輯：陳婷婷，顧玉蘭 Responsibleeditor：CHEN Tingting，GUYulan