甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育系閉蕾性狀的遺傳研究

油菜是中國乃至全世界重要的油料作物，是人類食用植物油的重要來源，也是動物飼料中蛋白質(zhì)的重要來源[1]。油菜雜種優(yōu)勢明顯，利用雜種優(yōu)勢可以大幅度提高油菜產(chǎn)量。目前，油菜雜種優(yōu)勢利用的主要途徑有細胞質(zhì)雄性不育（CMS）、細胞核雄性不育（GMS）、化學殺雄（CHA）及生態(tài)型雄性不育（EMS）等途徑[2-3]。CMS與其他幾種途徑比較，可實現(xiàn)不育系、保持系、恢復系“三系\"配套，雜交種生產(chǎn)成本低、純度高。因此，CMS是目前油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途經(jīng)之一，也是其他蕓墓屬十字花科蔬菜及大田作物雜種優(yōu)勢利用的主要途徑[4-8]。

目前，油菜雜優(yōu)育種中利用的主要細胞質(zhì)類型有 Ogu CMS[9]，Pol CMS[10-12]及 Shaan 2ACMS[11，13]等。根據(jù)前人報道及油菜生物技術(shù)育種課題組在油菜雜優(yōu)育種過程中的多年實踐，發(fā)現(xiàn)在選育Shaan2ACMS雜交種及制種過程中，某些優(yōu)良的CMS系在不理想環(huán)境下存在著閉蕾不開花問題，具體表現(xiàn)為花期花瓣、花萼緊緊包裹無法展開，部分花蕾還會出現(xiàn)柱頭外露現(xiàn)象[14]。這種閉蕾現(xiàn)象的發(fā)生嚴重影響了不育系的天然授粉，導致天然結(jié)實率降低，顯著降低了種子生產(chǎn)的效率，限制了優(yōu)良雜交種的推廣利用，是目前油菜雜種優(yōu)勢利用中急需解決的一個重要問題。徐亮等[14]在青海西寧和大通兩個不同的環(huán)境條件下，考察了4個春油菜不育系的育性、花器性狀和結(jié)實性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，影響不育系結(jié)實指數(shù)的主要因素是花期閉蕾率和花瓣張開角度。然而，目前對油菜CMS閉蕾性狀的研究缺少報道。

本研究以甘藍型油菜閉蕾CMS系2012A1、正常開花CMS系ZS09A、對應的保持系2012B1、ZS09為材料，對2個CMS系開花前后的花器官的形態(tài)特征、細胞學特征進行觀察比較；利用閉蕾CMS系、正常開花CMS系與對應的保持系、兩個保持系雜交得到的 F₁ 及 F₃ 群體進行測交，根據(jù)測交后代植株花蕾性狀及天然結(jié)實率，對閉蕾性狀進行遺傳研究。旨在揭示甘藍型油菜CMS閉蕾性狀的遺傳及細胞學機制，研究結(jié)果將對油菜CMS雜種優(yōu)勢利用具有重要參考價值。

1材料與方法

1. 1 試驗材料

甘藍型油菜（BrassicanapusL.）閉蕾CMS系2012A1及其保持系2012B1、正常開花CMS系ZS09A及其保持系ZS09。兩個CMS系均為Shaan2ACMS衍生系。供試材料由油菜生物技術(shù)育種課題組提供。

利用保持系2012B1與ZS09雜交得到 F₁ ，再連續(xù)自交得到 F₃ 群體。利用2012A1、ZS09A與其對應的保持系測交；利用2012A1與 ZS09*Ω 2012B1的 F₁ 進行測交；利用2012A1、ZS09A與ZS09*2012B1 的 F₃ 進行測交。上述材料于2021年至2023年9月中下旬播種于西北農(nóng)林科技大學曹新莊農(nóng)場試驗地 （34^°16^′N 108^°4^′E ，海拔 530m? ，小區(qū)種植，行長 2m ，株距15cm ，田間管理同當?shù)匾话愦筇锕芾怼?/p>

1.2方法

1.2.1形態(tài)特征觀察對甘藍型油菜閉蕾CMS系2012A1、正常開花CMS系ZS9A及其保持系ZS09開花前后的植株及花器官進行觀察，并拍照記錄。

1.2.2細胞學觀察石蠟切片：油菜初花期，選取植株主花序上不同大小花蕾（直徑 lt;1mm，1～ 2mm，2～4mm，4～7mm） 、以及 4～7mm 花蕾中剝?nèi)〉幕ㄖ肍AA固定液（ 50% 無水乙醇：福爾馬林：冰醋酸 =89：5：6） 固定 2h，75% 、85%.100% 酒精梯度脫水 ²h ，二甲苯浸泡15min ，石蠟（熔點 60^°C ）包埋， 55°C 烘箱固定 ^48h .縱切，切片 4～6μm ，展片， 干燥，二甲苯脫蠟，梯度復水、番紅固綠染色，阿拉伯樹膠封片[15]。使用Olympus BX51光學顯微鏡（奧林巴斯，日本）觀察照相。軟件ImageJ測量花柱細胞長度、面積和數(shù)量 （n/12.0mm² ）。

半薄切片：油菜初花期，選取參試材料的主花序放置于戊二醛固定液中，迅速帶回實驗室。分離花蕾及花的萼片、花瓣，切取中央 1mm³ 大小組織，用 4% 戊二醛固定液固定。后固定：真空泵抽氣直至沉底放置 24h，0.1mol/L 磷酸緩沖液PB （pH=7.4） 漂洗3次，每次 15min;1% 酸避光室溫固定 ⁷h，0.1mol/L 磷酸緩沖液PB（ pH=7.4） 漂洗3次，每次 15min ；室溫脫水：30%-50%-70%-80%-95%-100%-100% 酒精脫水，每次 ^1h ；滲透包埋：將純包埋劑倒人包埋板，樣品插人包埋板后 37^°C 烤箱過夜包埋， 60^°C 烤箱聚合 ^48h ，取出樹脂塊，備用。切片：切片約1～2μm ，貼附于載玻片上；染色：甲苯胺藍染液中染色 2min ，烤干，中性樹膠封片觀察[16]

1.2.3閉蕾性狀及天然結(jié)實率考察整個花期觀察參試材料的花蕾開閉情況，并于盛花期統(tǒng)計。觀察發(fā)現(xiàn)，測交后代株系存在閉蕾系、開蕾系以及開閉蕾混合系3種情況。測交群體全部表現(xiàn)為閉蕾的株系稱為閉蕾系；全部表現(xiàn)為開蕾的株系為開蕾系；存在開蕾和閉蕾兩種類型的株系為開閉蕾混合系。在開閉蕾混合系中，單株閉蕾數(shù)目 ? 10的統(tǒng)計為開蕾株，單株閉蕾數(shù)目 gt;10 的為閉蕾株。成熟期，每個材料隨機選取10株，統(tǒng)計單株主花序總花蕾數(shù)以及結(jié)實角果數(shù)，計算結(jié)實率，結(jié)實率 主序結(jié)實角果數(shù)/主序總花蕾數(shù)量 x 100% 。

1.2.4最少基因數(shù)目估計方法采用castlewright法（或稱矩法），利用父母本雙親表型方差（P、P2）以及F3群體來估計最少基因數(shù)目[17-18]

其中： K 表示基因?qū)?shù)目， 表示親本均值差， σ_F;² 表示 F₃ 群體表型方差， σ_P²=1/2 （σ_P1²+σ_P2² ）；其中 σ_P1²，σ_P2² 分別表示父母本表型方差。

1.2.5數(shù)據(jù)處理利用Excel2010對試驗數(shù)據(jù)進行整理，SPSS24.0進行統(tǒng)計分析，對測交 F₁ 代群體開閉蕾分離比進行 x² 檢驗。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)士標準誤差\"的形式表示，差異顯著性分析使用Duncan's法。

2 結(jié)果與分析

2.1甘藍型油菜CMS系的閉蕾表現(xiàn)

對不同生長時期的油菜閉蕾CMS系2012A1、正常開花CMS系ZS09A及保持系ZS09進行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與ZS09A、ZS09相比，2012A1無法正常開花，閉蕾現(xiàn)象嚴重，柱頭被花瓣、萼片緊緊包裹，無法伸出，部分花蕾柱頭掙脫包裹、伸長外露，而花瓣、花萼仍無法打開（圖1-A₁ ＼～圖 1-C₁ ）；與ZS09A、ZS09相比（圖 1-B₂～ 圖 1-B₃ ，圖 1-C₂ ～圖 1-C₃ ），2012A1花器官柱頭存在不同程度的扭曲現(xiàn)象（圖 1-A₂ ），死蕾多，天然結(jié)實率低，角果粒少（圖 1-A₃ ）。

2.2甘藍型油菜CMS系花器官的細胞學觀察

2.2.1花蕾觀察對油菜開花CMS材料ZS09A和閉蕾CMS材料2012A1不同大小的花蕾進行石蠟切片觀察。結(jié)果顯示（圖2），兩種CMS系直徑 lt;1mm 的花蕾發(fā)育無明顯差異（圖

2-A，圖2-B）；直徑 1～2mm 花蕾，ZS09A（圖2-C）萼片之間聯(lián)系比2012A1更緊密（圖2-D）；直徑 2～4mm 花蕾，與ZS09A（圖2-E）比較，2012A1柱頭伸出花瓣（圖2-F）；直徑 4～7mm 花蕾，ZS09A柱頭被包裹在花瓣內(nèi)，隨著柱頭伸長推動花瓣開放（圖2-G），而2012A1柱頭已伸出花蕾，導致花瓣綻放動力不足，無法正常開放（圖2-H）。

2.2.2花瓣觀察 對閉蕾CMS系2012A1、正常開花CMS系ZS09A及其保持系ZS09花瓣進行細胞學觀察?；ɡ倨?，2012A1花瓣細胞結(jié)構(gòu)與ZS09A、ZS09無明顯區(qū)別，3種材料的薄壁細胞組織緊密排列，細胞間隙較小，細胞近似規(guī)則的圓形或橢圓形（圖3）。

開花期，正常開花CMS系ZS09A及其保持系ZS09花瓣的薄壁細胞之間排列疏松，細胞間隙增大，細胞縱向拉伸成長條狀或極不規(guī)則形狀（圖4-A，圖4-B）；然而，閉蕾CMS系2012A1仍保持近似花蕾時期的細胞形態(tài)，花瓣皺縮，被花萼緊緊包裹，細胞近似圓形或橢圓形，排列緊密，細胞間隙較?。▓D4-C）。這說明2012A1花瓣細胞生長緩慢，花瓣皺縮，從而導致閉蕾現(xiàn)象。

2.2.3 花萼觀察 對2012A1、ZS09A及其保持 間隙較小（圖5）。

系ZS09花萼進行細胞學觀察?；ɡ倨冢?012A1與ZS09A、ZS09比較無明顯區(qū)別，細胞排列緊密，

開花期，正常開花CMS系ZS09A及其保持系的薄壁細胞呈現(xiàn)較為規(guī)則的圓形或者橢圓形，

細胞間隙變大（圖6-A，圖6-B）；然而，閉蕾CMS系2012A1花萼的薄壁細胞呈不規(guī)則的形狀，細胞間隙狹?。▓D6-C）。2012A1花萼在發(fā)育后期生長近乎停滯，花瓣被花萼緊緊包裹，說明閉蕾現(xiàn)象的發(fā)生與花瓣、萼片的不正常發(fā)育存在著密切聯(lián)系。

2.2.4花柱細胞觀察對ZS09A和2012A1相同大小花蕾花柱進行細胞學觀察。結(jié)果顯示，與ZS09A（圖7-A）比較，2012A1的花柱細胞數(shù)量多，面積?。▓D7-B）。ZS09A花柱細胞長為15.03μm . 2012A1 花柱細胞長為 17. 07μm ：ZS09A的花柱細胞面積為 213.1μm² ，2012A1花柱細胞面積為 174.18μm² ： ΔZS09A 花柱單位面積（ 12mm² ）細胞數(shù)量為54.7個，2012A1花柱單位面積細胞數(shù)量為71個（圖8），2012A1花柱細胞面積顯著低于ZS09A，單位面積細胞數(shù)量顯著多于ZS09A（圖8）。

A.ZSO9A；B.ZS09；C.2012A1。Bc.維管束鞘細胞；Cg.細胞間隙；E.上表皮；Le.下表皮；Pc.薄壁細胞；Vb.維管束組織。標 廠 （2 A.ZS09A;B.ZSo9;C.212A1.Bc.Bundle sheathcell；Cg.Intercelularspace；E.Upperepidermis;Le.Lowerepidermis；Pc.Parenchyma cell；Vb.Vascular bundle tissue. Bar=20μm

2.3甘藍型油菜CMS系閉蕾性狀的遺傳

2.3.1基于閉蕾表型的遺傳分析本研究中，選擇閉蕾CMS系2012A1、開蕾CMS系ZS09A、對應保持系2012B1和ZS09為親本，以兩個保持系及其雜交 F₁、F₃ 與兩個CMS系測交，根據(jù)測交后代的表現(xiàn)推測油菜CMS閉蕾性狀的遺傳規(guī)律。結(jié)果表明（表1），2012A1群體90株全部表現(xiàn)閉蕾，ZS09A群體165株全部表現(xiàn)開蕾（圖1-A₁ ，圖 1-B₁ -B₁），2012A1×ZS09，ZS09A×2012B1 后代全部開蕾， （2012B1*ZS09）F₁ 與ZS09A的測交 F₁ 群體共160株，全部開蕾，說明閉蕾受隱性基因控制，親本ZS09含有CMS系的顯性開蕾基因，親本2012B1含有對應的隱性閉蕾基因。（2012B1*ZS09）F₃ 與ZS09A測交，得到88個測交 F₁ 群體，所有株系均表現(xiàn)開蕾（表2），這也說明ZS09A中含有顯性開蕾基因。

（2號 （2012B1?ZS09）F₁ 與2012A1的測交 F₁ 群體共180株，其中88株閉蕾，92株開蕾，分離比符合 ε₁：ε₁ （表1）。（ ：2012A1*ZS09）ΔF₃ 與2012A1測交，得到73個測交 F₁ 群體，結(jié)果25個株系表現(xiàn)開蕾，27個株系表現(xiàn)閉蕾，21個株系中存在開蕾和閉蕾兩種類型植株，且開蕾：閉蕾 O= 1：1 。開蕾系：混合系（開蕾：閉蕾 =1：1? ：閉蕾系 =3：3：2 ，卡方測驗符合該理論比（表2）。

基于上述結(jié)果，筆者提出油菜CMS閉蕾性狀的遺傳受不育細胞質(zhì)和1對核基因控制，其中，s 為Shaan2ACMS不育基因， N 為可育基因，rf 為Shaan2ACMS的保持基因，細胞核中顯性開蕾基因為A，其對應的隱性閉蕾基因為a，則開蕾不育系基因型為 S（rfrfAA） 、其保持系基因型為 ，閉蕾不育系基因型為S（rfrfaa）、其保持系基因型為N（rfrfaa），其雜交及測交后代的表型及基因型推測如圖9所示。

2.3.2基于結(jié)實率的遺傳分析開蕾CMS系ZS09A、閉蕾CMS系2012A1，以及2012A1與（2號 （2012B1*ZS09）F₃ 的測交 F₁ 的結(jié)實率如圖10所示，親本開蕾CMS系的天然結(jié)實率為0.74557±0.04400 ，閉蕾CMS系2012A1的天然結(jié)實率為 0.45288±0.06500，2012A1 與（2012B1?ZS09）F₃ 的測交 F₁ 共73個株系平均結(jié)實率呈正態(tài)分布，平均結(jié)實率為 0.596 24± 0.09100，介于兩親本之間。

根據(jù)親本 P₁（2012A1 ）、 P₂ （ZS09A）、2012A1與 （2012B1?ZS09）F₃ 測交 F₁ 的結(jié)實率，采用castle-wright法來估計控制甘藍型油菜不育系結(jié)實率最少的基因數(shù)。

即控制甘藍型油菜閉蕾CMS系結(jié)實率的基 因?qū)?shù)至少為3對。

3討論

細胞質(zhì)雄性不育（CMS）是油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途經(jīng)之一[2-4]。在油菜細胞質(zhì)雄性不育三系育種實踐中，常發(fā)現(xiàn)一些優(yōu)良的Shaan2ACMS衍生不育系花期時出現(xiàn)閉蕾現(xiàn)象，嚴重時整個花期僅有少數(shù)花蕾能正常開放。這種現(xiàn)象的發(fā)生嚴重影響了不育系的天然授粉結(jié)實率，降低了不育系的制種產(chǎn)量，極大地影響種子企業(yè)的積極性和優(yōu)良雜交種的推廣利用，是目前油菜雜種優(yōu)勢利用中急需解決的一個重要問題。目前對油菜CMS閉蕾性狀的研究報道較少。徐亮等[14]在青海西寧和大通兩個不同的環(huán)境條件下，考察了4個春油菜不育系的育性、花器性狀和結(jié)實性，指出影響不育系結(jié)實指數(shù)的主要因素是花期閉蕾率和花瓣張開角度，但對于油菜CMS閉蕾的細胞學及遺傳機制缺乏研究。本文通過對甘藍型油菜閉蕾CMS系的形態(tài)學、細胞學及遺傳機制進行研究，發(fā)現(xiàn)開蕾CMS系開花后，閉蕾CMS系的花瓣、萼片保持近似花蕾時期的細胞形態(tài)，發(fā)育生長緩慢、近乎停滯，閉蕾CMS系花柱細胞數(shù)量多、面積小。這說明閉蕾現(xiàn)象的產(chǎn)生與花瓣、萼片以及花柱器官發(fā)育停滯關(guān)系密切?；陂_閉蕾表型，CMS閉蕾性狀受不育細胞質(zhì)和1對核基因控制（開蕾顯性）；基于天然結(jié)實率，油菜閉蕾CMS系結(jié)實率至少由3對基因控制。這些研究結(jié)果對油菜優(yōu)良CMS的選育、雜交種制種及推廣具有重要的理論指導及參考價值。

油菜CMS系閉蕾性狀受遺傳及環(huán)境因素的共同影響。通過長期觀察，筆者發(fā)現(xiàn)油菜閉蕾CMS系花期遇到陰雨天，天晴后，環(huán)境濕度增加，開花變暢。此外，有研究表明植物激素在植物開花及發(fā)育的過程中起著重要的調(diào)控作用[19]。未來，筆者將進行以下方面的研究：1）以閉蕾CMS系和開蕾CMS系的保持系的雜交后到衍生的重組自交系為材料，根據(jù)其與閉蕾不育系的測交后代開閉蕾表型，對閉蕾性狀進行QTL定位及候選基因的定位克??；2）利用人工氣候箱，設(shè)置不同溫、濕度梯度處理，探究溫、濕度對閉蕾性狀的影響；3）挖掘可以改善油菜CMS系閉蕾的化學物質(zhì)及其施用方法。

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Cytological and Genetic Analysis of Bud Closure in Cytoplasmic Male Sterile Lines in Brassica napus

YANG Yaxing，YU Haibo，ZHANG Dongsuo and HU Shengwu （Collge of Agronomy，Northwest Aamp;.F University，Yangling Shaanxi 7121oo，China）

Abstract Cytoplasmic male sterility （CMS） is one of the most important pollination control systems for utilizing hybrid heterosis in rapeseed （Brassica napus L.）. The seed yield of CMS lines is a key factor affecting the seed production benefit and promotion potential of hybrid varieties. This study aimed to elucidate the cytological and genetic mechanism of bud closure in rapeseed CMS lines，which may improve breeding efficiency and popularization of CMS hybrids. The morphological and cytological changes in flowering organs of CMS lines 2Ol2A1，ZSo9A，their maintainers and their hybrid progenies were observed and compared during flowering period. Based on the closed bud performance and natural seed-setting rates of male sterile lines，maintainer lines and their hybrid progenies，a genetic study of bud closure was conducted. The results showed that，compared to the open bud CMS line，the petals and sepals of the closed bud CMS line maintained the similar cellshape during flowering period， and the cell development was slower and nearly stagnant. The styles in the closed-bud CMS line had a greater number of cels，which were also larger. The closed-bud trait in the CMS line was controled by sterile cytoplasm and a pair of nuclear genes，with the open-bud trait dominant over the closed-bud trait. Based on natural seed-seting rates，the seed-seting rates of the CMS line was controlld by at least three pairs of genes.

Key words Rapeseed （Brassica napus L.）; Cytoplasmic male sterility （CMS）; Bud closure; Cytology；Inheritance

Received2024-05-17 Returned 2024-06-22

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China（No.32172O75）；Key Research and Development Project of Yangling Seeding Industry Innovation Center （No. YLzy-yc2021-01）. First author YANG Yaxing，male，master student. Research area： rapeseed genetics and breeding. E-mail：1601336682@qq.com

Corresponding authorHU Shengwu，male，professor，doctoral supervisor. Research area： rapeseed genetics and breeding. E-mail：swhu83251 @ nwsuaf.edu.cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）