紅三葉干旱響應(yīng)基因TpMYB-like的克隆與表達(dá)分析

近年來，隨著全球氣溫不斷升高，植物面臨干旱時水分的蒸發(fā)和損耗使其生長發(fā)育受到嚴(yán)峻的考驗。植物本身具有固著性，在面臨外界惡劣的環(huán)境時顯得更加被動。因此，植物逐漸形成適應(yīng)機制來抵制外界帶來的傷害，可以通過其耐旱相關(guān)基因表達(dá)的變化和某些代謝途徑的改變來抵御和適應(yīng)嚴(yán)峻環(huán)境中帶來的水分虧損[1]。其中，屬于調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）可調(diào)節(jié)與抗旱性相關(guān)的多種功能基因的表達(dá)水平，如MYB、CBF（C-repeat binding factor）、WRKY、AP2/ERF（APETALA2/ethylene re-sponse factor）和 bZIP（basic leucine zipper），它們在植物干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[2]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)量最大、分布最廣泛的一類轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白結(jié)構(gòu)主要包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)（DNA-bindingdomain，DBD）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)（transcription regulation domain，TRD）和負(fù)調(diào)控區(qū)（negative transcription regulation do-main，NTRD）[3]。MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性結(jié)合下游靶啟動子，進(jìn)而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平，影響植物生長發(fā)育及逆境脅迫應(yīng)答。近年來，MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能在植物抗逆中都有相關(guān)研究，如過表達(dá)小麥（Triticum aestiuum）的 Ta -SIM（salinity-inducedR2R3-MYB）基因轉(zhuǎn)人擬南芥中，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脯氨酸和可溶性糖含量均高于野生型植株，抗旱性顯著增強[4]。芍藥PIMYB108在煙草植株中過表達(dá)時，其黃酮類化合物含量、抗氧化酶活性和光合作用均顯著提高，過表達(dá)植株與野生型（WT）植株相比，轉(zhuǎn)基因植株具有更強的抗旱能力[5]。在大田中穩(wěn)定過表達(dá)GmMYB-OX轉(zhuǎn)基因大豆和野生型（WT）植株模擬干旱試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GmMYB-OX轉(zhuǎn)基因植株具有更強的耐旱性[6]。以上研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物耐旱適應(yīng)性方面具有重要作用。

紅三葉（TrifoliumpratenseL.）又名紅車軸草、紅荷蘭翹搖等[7]，是豆科（Fabaceae）車軸草屬（Trifolium）多年生草本植物，因其產(chǎn)量高、品質(zhì)佳、固氮能力強、適口性好等，是豆科植物中最重要的牧草之一。紅三葉耐蔭耐濕性強，常年生長在水分充足的溫暖濕潤地帶，在年降雨量500mm以下的干旱地區(qū)栽培種植會使紅三葉草產(chǎn)量不佳、營養(yǎng)價值下降，甚至?xí)斐伤劳鯷8]。在中國，紅三葉主要種植在西北、華北地區(qū)，這些地區(qū)干旱、水資源匱乏，對其生產(chǎn)的威脅越來越大，因此提高紅三葉的抗旱性，降低干旱脅迫對其生長發(fā)育的影響成為亟待解決的問題，對實際生產(chǎn)有著舉足輕重的意義。迄今，國內(nèi)外對紅三葉的報道大量集中在栽培[9-10]、抗逆生理[1-12]、藥理作用[13]、生產(chǎn)性能和營養(yǎng)價值評價[14-16]等方面，然而，有關(guān)紅三葉耐旱基因的挖掘及功能研究方面的報道較少，紅三葉重要經(jīng)濟牧草的耐旱基因功能分析有助于引導(dǎo)植物的適應(yīng)性改良和遺傳改良。據(jù)此，本研究克隆紅三葉耐旱基因 T_PMYB- e，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)和干旱脅迫表達(dá)模式分析，以期為紅三葉耐旱基因資源的利用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院杜文華老師課題組前期《紅三葉新品系的抗旱性研究》的結(jié)果[17]，選取抗旱性最強的紅三葉新品系的顆粒飽滿、無病蟲害的成熟種子為試材，用次氯酸鈉消毒后蒸餾水沖洗干凈，置于雙層濾紙的培養(yǎng)皿后放入 光照 ^′8h 黑暗的植物培養(yǎng)間，待植株長出兩片子葉后，將幼苗栽培于統(tǒng)一大小的花盆中（口徑 6.5cm 、底內(nèi)徑 5cm 、高 7cm ），保持正常水分供應(yīng)。培養(yǎng)3個月后選擇長勢一致的紅三葉幼苗進(jìn)行干旱脅迫。用 200mL 的 20% PEG-6000高滲溶液澆灌苦豆子模擬干旱脅迫，所有樣品均設(shè)置3次重復(fù)。脅迫處理 3，6，12，24h 時，剪取紅三葉的根、莖和葉組織作為待測樣品，在液氮中速凍后置于 -80^°C 冰箱中保存，備用。

1. 2 試驗方法

1.2.1RNA提取及cDNA合成將干旱脅迫處理下、不同時間節(jié)點的紅三葉根、莖和葉用液氮速凍，研磨成粉末狀后利用天根RNA提取試劑盒（DP419）提取總RNA，利用BioSpec-nano 紫外可見分光光度計檢測RNA質(zhì)量， 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，選擇質(zhì)量良好的RNA反轉(zhuǎn)錄得到紅三葉干旱脅迫0、3、6、12和 24h 的cDNA，于 -20^°C 冰箱保存，后續(xù)用于基因脅迫表達(dá)特征分析。

1.2.2TpMYB-like基因克隆與測序根據(jù)紅三葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中 T/pMYB–like 的基因序列，使用SnapGene軟件設(shè)計擴增引物（ T_PMYB -F： 5^′

ATGAATGAGAATAAGATTGAT -3^′ 、TpMYB-R：5^′ -CTAACTTATCTTTGAAGG- 3^′ ），送至北京擎科生物科技股份有限公司合成。使用 2× SanTaqMix酶進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系 20μL 2×San Taq Mix 10μL 、TpMYB-like-F和TpMYB-like-R各 1μL 、cDNA 2μL 、 06μL 。PCR反應(yīng)程序： 94^°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30s，58^°C 退火 30s，72^°C 延伸 1min，72^°C 再延伸 7min ，30個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳后確定目的條帶后，用TaKaRa的膠回收試劑盒回收目的基因片段，然后連接pMD19-T并使用 E . coli DH5α Compe-tentCells試劑盒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，在含有抗生素（氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基上涂布劃線，倒置培養(yǎng)基于 37^°C 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12h 。挑選陽性菌落于LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌，菌落PCR鑒定后選取陽性的菌液送至擎科生物公司進(jìn)行測序。

1.2.3TpMYB-like生物信息學(xué)分析對T/pMYB–like 編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，具體軟件及網(wǎng)址見表1。

1.2.4 T_PMYB 基因的表達(dá)模式分析提取模擬干旱脅迫處理不同時間節(jié)點（0、3、6、12和 24h ）下的紅三葉根、莖和葉的RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模版，TpAction為內(nèi)參基因（TpActionF： 5^′ -CTATTCATTGATGATGCTGCTA- 3^′ 、Action-R： 5^′ -CGCCTCCAAGACGATTCAC- ?3^′ ）檢測TpMYB-like（TpMYB-like-F： 5^′ -TGAT-GATGCTGCTACAATT- 3^′ 、TpMYB-like-R： 5^′ 一CGCCTCCAAGACGATTCAC- 3^′ ）的表達(dá)變化。天根SYBRGreen-熒光定量試劑盒的qRT-PCR反應(yīng)體系為： 10μL （204號 2× TalentqPCRPreMix、0.6μL TpMYB-like-F、0.6 μL TpMYB-like-R、2μL cDNA、6.8 μL RNase-Free ; qRT-PCR反應(yīng)程序為： 95°C 預(yù)變形 3min，95^°C 變形5s，58^°C 退火 15s，40 個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。采用相對定量 2^-ΔΔCt 方法計算試驗結(jié)果，GraphPadPrism軟件對數(shù)據(jù)處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1紅三葉新品系RNA質(zhì)量檢測與 TpMYB like基因克隆

利用TaKaRa試劑盒提取PEG-2OOO處理下紅三葉的根、莖和葉，RNA的 OD_260/280 值為 1.8～2.2 濃度為 200～500ng/μL ，且 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示兩條帶，表明RNA質(zhì)量較好，可進(jìn)行后續(xù)試驗。通過TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA并以其為模板， TρMYB-like-F/R 為引物進(jìn)行PCR擴增，對得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，克隆得到長度 1 269bp 的清晰目的條帶（圖1），膠回收純化后將其與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落PCR鑒定后將陽性菌落送樣測序，測序結(jié)果經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)該序列與目的序列一致。

2.2TpMYB-like生物信息學(xué)分析

2.2.1TpMYB-like基因編碼蛋白的理化性質(zhì)及親疏水性分析利用ExPASy的ProtParam在線工具對TpMYB-like基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)其CDS全長1269bp，開放閱讀框（ORF）為694bp， T_PMYB -like編碼蛋白的分子式為 C₃₄₁₇H₅₁₉₄N₈₇₀O₈₉₆S₃₃ ，包括626個氨基酸，該蛋白相對分子量為73856.10，理論等電點（PI）為9.60，帶正電荷的殘基（ Arg⁺ Lys）總數(shù)為82，帶正電荷的殘基（ Asp+Glu） 總數(shù)為39，含有20種氨基酸（圖2-A），絲氨酸（Ser）含量最高，占 12.3% ，甲硫氨酸（Met）含量最低，占 1.4% （圖2-B）。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為41.18（不穩(wěn)定蛋白）。利用在線軟件ProtScale對TpMYB-like蛋白的親、疏水性進(jìn)行解析，結(jié)果如圖3所示，第190個氨基酸位置，疏水性最大值為1.4，在第199個氨基酸位置，疏水性最小值為一2.8?？偲骄H水性 lt;1 ，表明TpMYB-like是親水性蛋白（圖3）。

2.2.2保守結(jié)構(gòu)域與蛋白結(jié)構(gòu)分析利用NC-BI中 的 Conserved Domain Search Service 對TpMYB-like蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示TpMYB-like蛋白的氨基酸位置在 246～302 、330～376 位有2個MYB結(jié)構(gòu)域（圖4），因此該蛋白屬于R2R3-MYB家族。利用在線軟件PSIPRED對TpMYB-like蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示，該蛋白的組成形式主要有α^- 螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈3種，其中 α -螺旋占比較大。同時，利用在線軟件SWISS-MODEL對TpMYB-like編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TpMYB-like蛋白大豆 GmMYB 的晶體結(jié)構(gòu)具有 70.97% 的相似性，以該蛋白為模板，通過同源建模的氨基酸殘基范圍為 142～212 位，占編碼氨基酸總數(shù)的 24% 。TpMYB-like蛋白如圖6所示，由 a- 螺旋和無規(guī)卷曲組成。

2.2.3磷酸化、糖基化位點、信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域分析蛋白質(zhì)磷酸化是生物體調(diào)節(jié)、控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本的機制。利用在線軟件NetPhos3.1對TpMYB編碼蛋白進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白磷酸化位點潛能 gt;0.5 ，且含有47個磷酸化位點，包括32個絲氨酸（S）磷酸化位點，9個蘇氨酸（T）磷酸化位點，4個酪氨酸（Y）磷酸化位點（圖7）。蛋白質(zhì)的糖基化是蛋白翻譯后的一種修飾，對蛋白行使功能有著重要的影響。利用NetNGlyc1.O軟件對TpMYB-like編碼蛋白進(jìn)行糖基化位點預(yù)測，結(jié)果表明TpMYB-like蛋白有5個潛在的糖基化位點，分

別位于第28、38、44、217、239個氨基酸位置（圖8）。通過SignalP4.1工具對TpMYB-like信號肽剪切位點預(yù)測，結(jié)果如圖9所示，原始剪切位點分值（C值）為0.127，信號肽分值（S值）為0.110，綜合剪切分值（Y值）為0.109，TpMYB-like蛋白D值為0.101；Sec/SPI為0，其他類型蛋白占比為O.5，因此推測TpMYB-like蛋白可能不含有信號肽，即該蛋白可能屬于非分泌性蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)主要含有跨膜域、胞外域、胞內(nèi)域，使用Phobius軟件對TpMYB-like編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果如圖10所示，TpMYB-like蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2.4亞細(xì)胞定位預(yù)測及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析利用在線工具BaCeILo對 TpMYB -like編碼蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn) TpMYB -like蛋白主要定位于線粒體 （43.6% ）、細(xì)胞核 （32.8% ）、細(xì)胞質(zhì)（ 15% ）、液泡 （4.3%） 和分泌系統(tǒng)囊泡（ 4.3% ）（圖11）。

將TpMYB-like編碼的氨基酸序列比對到NCBI數(shù)據(jù)庫中，下載同源性較高的11個物種的氨基酸序列：白三葉（Trifoliumrepens）、百脈根（Lotuscorniculatus）、赤豆（Vigna angularis）、豌豆（Pisumsativum）、大豆（Glycinemax）、蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）、綠豆（Vigna ra-diata）、木豆（Cajanuscajan）、苜蓿（Medicagosativa）、狹葉羽扇豆（Lupinusangustifolius）鷹嘴豆（Cicerarietinum）。利用MEGA6.0軟件將TpMYB-like與以上11個物種的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅三葉TpMYB-like與其他11個物種合成兩個大分支，鷹嘴豆、赤豆、豌豆、大豆、百脈根、苜蓿、白三葉聚為一個分支，紅三葉與狹葉羽扇豆、木豆、綠豆、蒺藜苜蓿4個物種聚為一個分支（圖12）。

2.3模擬干旱脅迫下TpMYB-like基因表達(dá)模式分析

選取穩(wěn)定表達(dá)的Action為內(nèi)參基因，qRT

PCR檢測 T_PMYB–like 基因在紅三葉根、莖和葉中的表達(dá)模式，結(jié)果表明 T_PMYB–like 在紅三葉3種組織的表達(dá)量為葉 gt; 根 gt; 莖，說明該基因表達(dá)具有組織特異性（圖13-A）。同時，對干旱脅迫下紅三葉根、莖、葉不同時間點 T_PMYB–like 表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，用 20% 的PEG-6000脅迫紅三葉植株，發(fā)現(xiàn)在根組織中T_PMYB–like 基因表達(dá)量呈不穩(wěn)定的動態(tài)變化，與對照 （0h） 相比， 3h 時表達(dá)量增加， 6h 時表達(dá)量迅速升高至峰值， ^12h 時表達(dá)量再次下降，干旱脅迫 12～24h 時表達(dá)量再次升高（圖13-B）；在莖組織中， T_PMYB–like 基因表達(dá)量在 ³h 達(dá)到峰值后迅速下降， 12～24h 又呈現(xiàn)上升的趨勢（圖13-B）；就葉而言， T_PMYB–like 表達(dá)量在干旱脅迫 0～3h 時迅速升高達(dá)到峰值， 3～6h 時急劇下降，隨著干旱脅迫時間的增加，TpMYB-ike的表達(dá)量緩慢升高后又降低（圖13-B）。

3討論

植物在生長發(fā)育的過程中存在多種生物及非生物脅迫，當(dāng)發(fā)生干旱脅迫時，植物為了適應(yīng)這種逆境條件，其自身會產(chǎn)生一系列相應(yīng)的形態(tài)、生理及基因表達(dá)方面的復(fù)雜機制來保護(hù)自身免受逆境脅迫的危害[18]。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控功能基因的表達(dá)是植物抗逆反應(yīng)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，MYB作為植物體內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域，通常每個MYB結(jié)構(gòu)域含3個規(guī)則間隔排列的色氨酸殘基，這種特殊結(jié)構(gòu)域可形成“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋\"構(gòu)型，從而使MYB轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合參與調(diào)控[19]。本研究結(jié)果表明，TpMYB-like的CDS全長1269bp，ORF閱讀框長694bp蛋白的氨基酸位置在 246～302.330～ 376位有2個MYB結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB家族。TpMYB-like蛋白是一種不穩(wěn)定的親水蛋白，這與荔枝（Litchichinensi）[2o]、四季秋海棠（Begonia sem perflorens）[21]、馬鈴薯（Solanumtuberosum）[22]等MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，TpMYB-like蛋白不含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，這與柴華等[23]研究結(jié)果相同。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，TpMYB-like蛋白與狹葉羽扇豆LaMYB、木豆TpMYB-like蛋白的結(jié)構(gòu)域同源性達(dá)到 88% ，說明TpMYB-like在進(jìn)化過程中具有高度保守性，這為進(jìn)一步研究TpMYB-like的功能特征奠定了基礎(chǔ)。由于蛋白或表達(dá)產(chǎn)物行使功能的差異，不同植物中MYB蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果也有所不同，如黃花苜蓿MfMYB3R-3在細(xì)胞核中發(fā)揮作用[23]，艾草中92個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，89個蛋白定位在細(xì)胞核中，3個蛋白同時定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[24]。本研究通過對TpMYB-like蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在線粒體中，由此說明MYB轉(zhuǎn)錄因子可以在植物細(xì)胞內(nèi)的不同位置發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

T_PMYB–like 基因在干旱脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，本研究對紅三葉模擬干旱脅迫處理發(fā)現(xiàn)， T_PMYB–like 基因在紅三葉的根、莖和葉中均表達(dá)，該基因在葉中相對表達(dá)量最高，根中次之，莖中表達(dá)量較低，艾草（Artemisiaargyi）AaMYB60AA，AaMYB63 和 AaMYB86 基因也呈現(xiàn)出葉中的表達(dá)高于莖和根，而橡膠（Heveabra-siliensis）HbMYB88在橡膠樹莖和花中表達(dá)量高，在根、葉片、樹皮和膠乳中表達(dá)量極低[25]。掌葉大黃（Rheum palmatum） RpMYB2，RpMYB6 基因在根中轉(zhuǎn)錄本豐度最高，而 R_PMYB3 、R?MYB5 基因分別在葉片、葉柄中高表達(dá)[26]說明MYB具有較為明顯的組織特異性。

4結(jié)論

本研究成功克隆到紅三葉TpMYB-likeCDS全長序列 1 269bp ，其ORF閱讀框長694bp， T/pMYB–like 編碼蛋白包括626個氨基酸，有2個MYB結(jié)構(gòu)域，屬于MYB超家族；該蛋白含有47個磷酸化位點、5個潛在的糖基化位點、不含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞定位顯示該蛋白定位于線粒體； T_PMYB–like 在 20% PEG-6000模擬干旱脅迫下的紅三葉根、莖和葉中均可誘導(dǎo)表達(dá)，但在葉組織中表達(dá)量最高，該基因可能在紅三葉防御干旱脅迫的過程中起重要作用。

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Cloning and Expression Analysis of Drought Stress TpMYB-like Gene in Trifolium pratense

SU Dandan and DU Wenhua

（Research Center for Sustainable Grassand and Livestock Management，Key Laboratory of Grassand Ecosystem unde！ Ministry of Education of China，Pratacultural College of Gansu Agricultural UniversityLanzhou730o7o，China）

AbstractTo explore the biological function of TpMYB-like gene in Trifolium pratense under drought stress， T . pratense was used as experimental material. We successfully cloned TpMYB-like gene by PCR and analyzed its bioinformatics and expression pattern to investigate the role of TpMYBlikein T . pratense under drought stress. The results showed that the coding region of the gene was bp in length，the open reading frame（ORF） encoded 626 amino acids，contained two MYB structural domains，belonged to the R2R3-MYB superfamily；the protein had 47 phosphorylation sites，five potential glycosylation sites，and lacked a signal peptide or transmembrane structure; the prediction of subcellular localization showed that the protein was localized in the mitochondria;and the phylogenetic analysis revealed that the TpMYB-like was clustered into a single branch with 91% homology to four species： Lupinus angustifolius ，Cajanus cajan，Vigna radiata，and Medicago truncatula ; qRTPCR showed that the expresson of TpMYB-Like could be induced in the roots，stems and leaves of T . pratense under simulated drought stress at 20% of PEG-6ooo，and the amount of expression was in the following order from high to low：leavesgt;roots gt; stems. The TpMYB-like gene was hypothesized to be induced by drought stress in T .pratense and might play a key role in its drought resistance. T_PMYB-like gene was hypothesized to be induced by drought stress in T . pratense，and might play an important role in its drought resistance.

Key words Trifolium pratense ; Drought stress;MYB gene; Gene cloning; Expression analysis

Received 2024-08-20 Returned 2024-09-21

Foundation itemGansu Provincial Higher Education Industry （No.2O22CYZC-49）；Major Special Project of Gansu Province （No. 21ZD4NAol2）; Major Special Project of Tibet Autonomous Region （No.XZ202101ZDo03N）;National Natural Science Foundation of China （No. 32260339）.

First author SU Dandan，female，doctoral student. Research area：grass germplasm resources and their breeding and cultivation.E-mail：ddansu@163.com

Corresponding authorDU Wenhua，female，Ph. D，professor. Research area： grass germplasm resources and their breeding and cultivation.E-mail：duwh gsau. edu. cn

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsibleeditor：GUYulan）