華中五味子漆酶基因SsphLAC19的克隆及原核表達(dá)

華中五味子（Schisandra sphenanthera Re-hd.etWils.），俗稱南五味子，是五味子科五味子屬（Schisandra）的多年生落葉木質(zhì)藤本植物。它主要生長在海拔 600～3000m 的山坡或灌叢中，雌株的果實(shí)可供藥用[1]。華中五味子果實(shí)中主要含木脂素、萜類和糖類等化合物[2-5]，其中木脂素為主要化學(xué)成分，在植物體內(nèi)約占 8%[6-7] 。其木脂素類型主要包含：聯(lián)苯環(huán)辛烯類、二芳基丁烷類、四氫呋喃類、芳基四氫萘[8]。木脂素化學(xué)成分具有保肝、抗腫瘤及保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用[9-12]

前人所研究的木脂素生物合成路徑中，松柏醇通過苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、肉桂酰輔酶A還原酶（CCR）、肉桂醇脫氫酶（CAD）的催化，轉(zhuǎn)變?yōu)槟局氐那绑w。隨后，在指導(dǎo)蛋白（DIR）和漆酶的共同催化作用下，松柏醇生成具有立體選擇性的松脂酚[13]。在合成松脂酚的過程中，漆酶作為關(guān)鍵酶生成重要的自由基中間體。

漆酶（EC1.10.3.2，Laccase，LAC）屬于多銅氧化酶家族，其在自然界中的作用包括合成和降解反應(yīng)。其催化底物具有廣泛性，例如酚類、芳胺和羧酸等衍生物。漆酶的催化機(jī)制是在分子氧存在下，將底物氧化為相應(yīng)的自由基，同時產(chǎn)生的水為副產(chǎn)物[14]。這些自由基是重要的中間體，通過偶聯(lián)反應(yīng)生成二聚體、低聚體、聚合物或交叉偶聯(lián)產(chǎn)物[15]。漆酶廣泛存在于真菌中，在真菌中的作用多種多樣，包括形態(tài)調(diào)節(jié)、毒力和營養(yǎng)控制，以及使木質(zhì)組織脫木質(zhì)的能力[16]。研究表明，亞洲棉GaLAC1可催化芥子酸轉(zhuǎn)化成其二聚體[17]，丹參漆酶以迷迭香酸為底物生成一系列代謝產(chǎn)物，Li等[18]通過將丹參漆酶基因 SmLAC3 進(jìn)行基因沉默和過表達(dá)，導(dǎo)致了二聚體丹酚酸B的多樣化。迷迭香酸與芥子酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有相似性，這些研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明漆酶的功能奠定了基礎(chǔ)。漆酶不僅參與木質(zhì)素的合成，還具有抵抗害蟲、抗干旱脅迫及果皮褐化等多種功能[19-20]類似木脂素的代謝物合成途徑研究表明，漆酶可能參與了菘藍(lán)中落葉松脂素的生物合成[21]，并且能夠催化形成2，6-二甲氧基苯酚和3-羥基酪氨酸的二聚體等[22-24]。由于形成自由基的漆酶氧化木質(zhì)素前體（松柏醇）導(dǎo)致了3種外消旋偶聯(lián)產(chǎn)物（圖1），這說明漆酶在區(qū)域性和立體特異性控制方面存在一定的局限性。本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對華中五味子的漆酶基因SsphLAC19進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，為通過合成生物學(xué)途徑探究生成木脂素等二聚體木脂素奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

華中五味子取樣于湖南省懷化市通道侗族自治縣（109.78E，26.159N），選取雌株根、莖、葉（老葉、嫩葉）果實(shí)與雄株根、莖、葉（老葉、嫩葉）。各部位采取3次生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行取樣，作為轉(zhuǎn)錄組測序待測樣品，液氮凍存于 -80°C ，備用。

1.2方法

1.2.1華中五味子漆酶候選基因的篩選采取雌株華中五味子的根、莖、老葉、嫩葉、果實(shí)和雄株的根、莖、老葉、嫩葉各組織進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，使用DNBSEQ-T7進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序后得到原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到cleanreads，隨后利用Trinityv2.15.1軟件進(jìn)行從頭組裝，最終通過聚類獲得去除冗余的Unigenes。將Uni-genes與Nr、KEGG、KOG、TrEMBL 和 Swis-sProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，基于對漆酶的典型的3個保守結(jié)構(gòu)域即：Cu-oxidase（PF00394）， Cu -oxi-dase-2（PF07731），Cu-oxidase-3（PF07732），隨后將篩選到最優(yōu)的序列注釋到Pfam數(shù)據(jù)庫。

1.2.2SsphLAC19基因的克隆參照寶生物工程（大連）有限公司的TotalRNA提取試劑盒說明書獲得RNA，參照諾唯贊生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；谵D(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，利用SnapGene6.O.2設(shè)計特異性引物，Ss-phLAC19-F： 5^′ -acaataacaacaacctcgggATGCGA-CCTCCTCCGAATTTC- 3^′ ；SsphLAC19-R： 5^′- cagtggtggtggtggtggtgTTACAGAGGTCGTGTGTGACGAC- 3^′ 引物下劃線為同源臂。將以反轉(zhuǎn)錄合成的華中五味子的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，參照諾唯贊高保真酶 2× PhantaFlashMasterMix說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：2× Phanta 13μL ，SsphLAC19-F 0.7μL ，Ss-phLAC19-R 0.7 μL ，cDNA 1μL 用滅菌蒸餾水補(bǔ)足 25μL 體系，PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C 預(yù)變性3min 95^°C 變性15s， 58^°C 退火15s， 72^°C 延伸 60s，33 個循環(huán)；最后 72^°C 延伸 5min 。將回收的目的片段參照EasyPure QuickGelExtrac-tionKit試劑盒進(jìn)行純化。

1.2.3生物信息學(xué)與構(gòu)建進(jìn)化樹分析從轉(zhuǎn)錄組中篩選的漆酶基因通過在線工具ExPASy

ProtParam預(yù)測蛋白理化性質(zhì)，TMHMMServerv.v2.O、SignalP4.1Server、Plant-mPLocv2.0、SOPMA分別進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽、亞細(xì)胞定位的預(yù)測和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，利用Al-phaFoldv2.3.1進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)同源建模。使用SMART（ http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測。利用MEGAv7.0.26將序列與其他植物漆酶基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用MAFFTv7.526進(jìn)行多重序列比對，并以Ge-neious Prime v2021 進(jìn)行可視化；使用TBtools-II對華中五味子漆酶基因進(jìn)行熱圖繪制。

1.2.4原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組轉(zhuǎn)化將帶有MBP標(biāo)簽的p ET-28a（+） 進(jìn)行線性化PCR，即線性化引物F： 5^′ ctcgagcaccaccaccaccaccac-3^′ ，R： 5^′ -cccgaggttgttgttattgttattg 3^′ 得到一個線性化載體，參照生工生物工程（上海）股份有限公司的Ready-to-Use Seamless Cloning Kit 說明書，體系： 2× Seamless Cloning Master Mix 5μL ，片段 5μL ，線性化 pET-28a（+）1μL . ，于 50^°C 孵育 20min 。孵育完成后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，在含卡那霉素LB平板上篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)測序比對成功后，將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 E .coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR進(jìn)行陽性克隆檢測，原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-28a-LAC19。

1.2.5原核表達(dá)與SDS-PAGE檢測將表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-LAC19單克隆抗體在 100mL 三角錐形瓶過夜活化，按 1% 的接種量接種于500mL含卡那霉素的LB中， 37°C，220Δr/min 條件下培養(yǎng) 4～5h，OD_600nm 為 0.6～0.8h 放置室溫冷卻，加入終濃度為 0.2mmol/L 的IPTG（異丙基 ?{β} -D-硫代半乳糖苷）， 16^°C ， 180r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng) ^16h 。誘導(dǎo)結(jié)束后進(jìn)行收菌，棄上清，使用50mmol/LTris，20O mmol/LNaCl緩沖溶液重懸菌體，使用高壓細(xì)胞破碎儀以壓力值KPSI為20進(jìn)行細(xì)胞破碎， 12 000r/min 離心 30min ，上清使用 0.8μmol/L 濾膜過濾并用鎳層析柱進(jìn)行蛋白純化。將不同樣品與蛋白上樣緩沖液混合制樣， 100^°C 變性 10min，12 000r/min 離心 5min 后并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 SsphLAC19 的體外酶活檢測緩沖溶液配置為 pH=7.0，50mmol/L 磷酸鉀溶液，用二甲基亞砜配置 100mmol/L 的底物芥子醇，用無菌水配置 20mmol/L 的 CuSO₄ ，反應(yīng)體系中分別加入終濃度為 1mmol/L 芥子醇， 1mmol/L 的 CuSO₄ 和 50mmol/L 咪唑沖洗的蛋白 Ss^- phLAC19（濃度為 1mg/mL ，使用緩沖溶液補(bǔ)足體系 250μL ，混勻后于 50°C 孵育 3h，500 r/min ，反應(yīng)結(jié)束后加入 250μL 乙酸乙酯進(jìn)行反應(yīng)終止與萃取，氮吹儀蒸發(fā)至干，重新加入250μL 的 50% 甲醇進(jìn)行復(fù)溶，過濾 0.22μmol/L 的反應(yīng)產(chǎn)物采用HPLC-MS進(jìn)行檢測，檢測方法如下。色譜條件：使用的柱子為phenomenex00D-4462-EC-C18（100mm×4.6mm，2.6μm） ，流速0.5mL/min 。流動相為 A（0.01% 甲酸水）和B（乙腈），梯度為 0min ， .A：B=65：35 ； 10min ，A： B=50 ：50；15m in，A：B=35：65 ： 20min，A：B=20：80 ；25min，A：B=0：100 。質(zhì)譜條件：離子源采用的是正離子模式，掃描范圍為 50～1700m/z 。

2 結(jié)果與分析

2.1 SsphLAC19基因的篩選

基于課題組前期完成對華中五味子雌雄株不同組織的轉(zhuǎn)錄組測序中對于PfamScanvl.6的結(jié)果，篩選到均含有3個（PF00394、PF07731、PF07732）完整的銅離子結(jié)構(gòu)域，以SsphLAC19基因?yàn)槔▓D2），共獲得25條華中五味子漆酶基因，暫命名為 SsphLACOI-SsphLAC25 。通過多重序列比對25條漆酶基因中具有銅離子結(jié)合位點(diǎn)的（HWH、HAH、HLH、HCH）篩選出了12條候選基因，即SsphLAC03、Ss-phLAC10 ～ SsphLAC14、SsphLAC16＼～ Ss-phLAC20、SsphLAC23（圖3）以及它們具有顯藍(lán)色的重要結(jié)構(gòu)位點(diǎn)[21]。利用擬南芥（Arabidop-sisthaliana）作為模式植物將華中五味子與已知功能漆酶植物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分類。根據(jù)鄒灝嵐[25]對AtLACs的分類可分為7組（圖4-A），其中在第ⅡI組中AtLAC4（NP_565881.1）、At-LAC11（NP_195946.2）、AtLAC17（NP_200810.1）這3個擬南芥漆酶的功能主要與木質(zhì)素的合成有關(guān)[26]，陸地棉GhLAC1（NP_001314382.1）能增強(qiáng)木質(zhì)素化[27]，與它們聚為一支的華中五味子漆 酶 有SsphLAC03、SsphLAC12、Ss-phLAC17、SsphLAC2;第ⅢI組中 AtLAC3（ NP_- 180580.1）、AtLAC5（NP_181568.1）、AtLAC13（NP_196330.3）都與凱氏帶的形成相關(guān)[28]，與它們聚為一支的有SsphLAC03、SsphLAC10；在

第Ⅳ組中只包含2個擬南芥漆酶與1個華中五味子漆酶；第V組中AtLAC8（NP_195724.1）可以使開花時間來得更早[29]，玉米ZmLAC1（NP_001105789.1）的轉(zhuǎn)錄水平能響應(yīng)高濃度的NaCl^[29] ，因此SsphLAC18可能具有類似功能；第VI組有14個華中五味子漆酶，說明這可能是華中五味子漆酶中具有特殊功能的漆酶蛋白；第V組中AtLAC15（NP_199621.2）對種皮顏色和種子木質(zhì)素含量有關(guān)[30]，它與SsphLAC13、SsphLAC14、SsphLAC16、SsphLAC19的親緣關(guān)系最近，在本研究中選取的SsphLAC19在此分組中（圖4-A）。在木脂素的合成中，漆酶產(chǎn)生的自由基可催化松柏醇形成雙駢四氫呋喃環(huán)類二聚體松脂醇，據(jù)報道金山五味子（SchisandraglaucescensDiels）中雙駢四氫呋喃環(huán)類木脂素（松脂醇、丁香脂素、青刺尖木脂醇））的組織特異性主要在莖中[31-32]，因此在表達(dá)量熱圖結(jié)果中在莖中具有組織特異性的華中五味子漆酶候選基因有8條（SsphLAC03、SsphLAC10、SsphLAC12、SsphLAC17、SsphLAC19、SsphLAC20、Ssph-LAC21SsphLAC24）（圖4-B），除了SsphLAC21、SsphLAC24 外，剩下的6條SsphLACs均具有銅離子

2.2SsphLAC19基因序列的生物信息學(xué)分析

以華中五味子的cDNA為模板克隆得到預(yù)期大小為 1704bp （圖5）。開放閱讀框預(yù)測結(jié)果顯示SsphLAC19編碼567個氨基酸（圖6）。ProtParam預(yù)測其分子質(zhì)量為 63.69ku ；分子式為 C₂₈₉₀H₄₃₈₉N₇₆₉O₈₂₈S₁₇ ；等電點(diǎn)為6.28；不穩(wěn)定系數(shù)為36，屬于穩(wěn)定蛋白，含量較高的氨基酸主要有Leu（49個， 8.6% ）、Gly（43個， 7.6% ）、Pro（42 個， 7.4% ）、 Thr（42 個， 7.4% ）；負(fù)電荷氨基酸殘基（ Asp+Glu ）的數(shù)目為53個，正電荷氨基酸殘基（ Arg+Lys） 的數(shù)目為45個，總平均

2.3 原核表達(dá)及SDS-PAGE檢測

SsphLAC19與pET-28a（+）進(jìn)行同源重組后轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，重組質(zhì)粒pET-28a-SsphLAC19經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證得到其陽性轉(zhuǎn)化子（圖8-A），經(jīng) 16^°C IPTG誘導(dǎo) ^16h ，收集菌體進(jìn)行SDS-聚丙酰胺凝膠電泳檢測。本研究在蛋白表達(dá)載體上引入了麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽（MBP），試驗(yàn)結(jié)果顯示：MBP-SsphLAC19蛋白在沉淀、 .50mmol/L 咪唑與 250mmol/L 咪唑洗脫液中均存在大小約為 ，表明SsphLAC19在原核中進(jìn)行蛋白表達(dá)（圖8-B）。

2.4SsphLAC19體外酶活性檢測

將酶反應(yīng)與對照提交HPLC-MS分析，結(jié)果顯示體外酶活性產(chǎn)物能在 7.6min 提取出m/z=401[M+H+H₂O]⁺，m/z=419[M+Λ HJ⁺?m/z=441[M+Na]⁺?m/z=457[M+ KJ⁺ 特征峰（圖9-C），與標(biāo)準(zhǔn)品丁香脂素一致，同時在對照里也提取到3個特征峰（圖9-B）。據(jù)前人報道，木脂素前體松柏醇能通過自發(fā)的氧化偶合反應(yīng)隨機(jī)生成外消旋二聚體木脂素松脂醇[-34]。因此，得到的產(chǎn)物是外消旋丁香脂素（圖9-A），具體是左旋還是右旋還需進(jìn)一步探究。

3 討論與結(jié)論

自21世紀(jì)以來，漆酶因?yàn)楦呋钚院头€(wěn)定性而被廣泛用于各種工業(yè)的大規(guī)模生物技術(shù)中[35]

漆酶在食品、紡織、化妝品、醫(yī)藥和納米生物技術(shù)等領(lǐng)域的催化和電催化特性備受關(guān)注。漆酶的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)展，主要?dú)w功于其廣泛的底物利用性。漆酶能催化四電子底物的氧化，導(dǎo)致過氧鍵的還原性裂解。漆酶內(nèi)的銅金屬原子在氧還原過程中起關(guān)鍵作用，包括4個銅離子結(jié)合位點(diǎn)（HWH、HAH、HLH、HCH）[24]。這些位點(diǎn)使漆酶能催化多種底物作為氧化靶標(biāo)，增強(qiáng)了其催化功能的多樣性，使其成為一種綠色催化劑[36]。例如，杜仲中二聚體木脂素被確定為主要藥用活性成分，具有抗癌、抗氧化和抗生素特性[24]；一種通過漆酶催化合成的聚合蘆丁作為有效抗血栓劑，這種合成方法顯著改善了蘆丁的溶解度，進(jìn)而可增強(qiáng)其生物學(xué)特性[]；有研究表明，鼠李植物純化的漆酶能成功制備抗炎藥物松脂醇，以及用于治療胃腸道疾病的脫氫二異丁香酚[38]

在目前植物研究中漆酶主要與指導(dǎo)蛋白（di-rigentprotein，DIR）協(xié)同作用，專門催化松柏醇僅形成 （+） -松脂醇或（-）-松脂醇中的一種構(gòu)型，并且存在類似的協(xié)同催化過程，即催化半棉酚形成 （+） -棉酚[39-40]，這2種情況均表明，LAC在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的自由基中間體能夠發(fā)生隨機(jī)偶合反應(yīng)，進(jìn)而生成外消旋類化合物，DIR在這一過程中起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用，特別是在氧化偶合反應(yīng)的位置選擇和立體選擇性上。本研究以芥子醇為底物的體外酶活反應(yīng)經(jīng)HPLC檢測到在8.863min 與丁香脂素時間一致，但是在對照也可發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)物的時間一致，考慮到底物是否會發(fā)生自發(fā)反應(yīng)，因此設(shè)計了2個對照，將芥子醇以相同的酶反應(yīng)體系放在 4^°C 與常溫進(jìn)行探究，經(jīng)HPLC也檢測到了與丁香脂素的時間一致（圖9-B），所以產(chǎn)物丁香脂素在位置選擇和立體選擇性上還需進(jìn)一步探究。此外，陳賢情等[41]的一項(xiàng)研究揭示了從厚樸基因組中篩選到LAC具有催化胡椒酚轉(zhuǎn)化為厚樸酚的功能。因此，對于LAC的催化機(jī)制，未來還需進(jìn)行更為深人的探究。

漆酶能夠催化多種二聚體，包括木脂素及其相關(guān)化合物的生物合成。選取以木脂素為主要的活性成分的華中五味子為材料。目前，木脂素的獲取主要依靠植物提取和化學(xué)合成，但存在植物生長周期長及資源成本高昂的問題。鑒于此，計劃利用合成生物學(xué)手段，以實(shí)現(xiàn)更綠色環(huán)保的生產(chǎn)方式。為此，需要進(jìn)一步克隆漆酶基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和原核表達(dá)研究，從而為探究漆酶在華中五味子形成苯酚偶聯(lián)木脂素的過程奠定堅實(shí)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn) Reference：

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志，第三十卷，第一分冊[M.北京：科學(xué)出版社，1996：258-260.

[2] 黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊［M].北京：中國醫(yī)藥科 技出版社，1994：526-547.

[3] 袁昌齊.天然藥物資源開發(fā)利用[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù) 出版社，2000：54-58.

[4]鄭古虎，董澤宏，佘靖.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用（第一 卷）[M.北京：學(xué)苑出版社，1997：148-156.

[5] 肖培根，李天鵬，楊世林.新編中藥志（第二卷）[M].北京： 化學(xué)工業(yè)出版社，2002：119-135.

[6] 李海濤，胡剛.五味子醇甲抑制 6-羥基多巴胺誘導(dǎo) PC12 細(xì)胞凋亡的研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2004，20（2）： 96-98.

[7] 黃家福，周曉東，周山.大孔吸附樹脂純化五味子木脂素 的工藝考察[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014，8（19）：12-16.

[8] 劉海濤.五味子科藥用植物親緣學(xué)初探及兩種五味子科藥 用植物化學(xué)成分的研究［D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)， 2009.

[9] 崔銀姬.木脂素對 MCF-7 乳腺癌細(xì)胞抗增殖作用及其機(jī)制 的研究[D].吉林延吉：延邊大學(xué)，2010.

[10] 任麗佳，李林，殷放宙，等.五味子抗腫瘤活性成分及作 用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報，2012，28（1）：140- 142.

[11] 劉珊，韓艷秋.五味子對乳腺癌細(xì)胞抑制作用的體外研 究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22（7）：1530-1534.

[12] 胡竟一，白筱璐，雷玲，等.南五味子總木脂素的催眠作 用及對腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響［J].中藥藥理與臨床， 2016，32（2）：110-113.

[13]DAVIN L B，LEWIS N G. Dirigent proteins and dirigent sites explain the mystery of specificity of radical precursor coupling in lignan and lignin biosynthesis[J].Plant Physiology，2000，123（2） ：453-62.

[14] KUDANGA T，BURTON S，NYANHONGO G S，et . al. Versatility of oxidoreductases in the remediation of environmental pollutants[J].Frontiers in Bioscience（Elite edition），2012，4（3）：1127-49.

[15]KUDANGA T，NYANHONOGO S G，GUEBITZ M G， et.al.Potential applications of laccase-mediated coupling and grafting reactions：a review[J]. Enzyme and Microbial Technology，2011，48（3）：195-208.

[16] MAYER M A，STAPLES C R. Laccase： new functions for anold enzyme[J].Phytochemistry，2002，60（6）：551-565.

[17] WANG G D，LI QJ，LUO B，et al. Ex plantaphytoremediation of trichlorophenol and phenolic allelochemicals via an engineered secretory laccase[J]. Nature Biotechnology， 2004，（22）：893-897.

[18]LI Q，F(xiàn)ENG J，CHEN L，et al. Genome-wide identification and characterization of Saluia miltiorrhiza laccases reveal potential targets for salvianolic acid B biosynthesis[J]. Frontiers in Plant Science，2019，10：435.

[19]CHO H Y，LEE C，HWANG S G，et al. Overxpression of the OsChIl gene，encoding a putative laccase precursor，increases tolerance to drought and salinity stress in transgenic Arabidopsis[J].Gene，2014，552（1）：98-105.

LZ0」 FANG F，ZHANG XL，LUO HH，et al.An intracellular laccase is responsible for epicatechin-mediated anthocyanin degradation in litchi fruit pericarp[J].Plant Physiology， 2015，169（4）：2391-408.

[21]陳亮，李卿，陳軍峰，等.催化菘藍(lán)活性木脂素生物合 成的漆酶基因家族生物信息學(xué)分析[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志， 2017，35（3）：208-214.

[22]WAN Y，LU R，AKIYAMA K.et al. Enzymatic synthesis of bioactive compounds byRhus laccase from Chinese Rhus vernicifera[J]. Science in China Series B：Chemistry， 2007，50（2）;179-182.

[23]ZWANE RE，PARKER A，KUDANG T，et al.Novel， biocatalyticallyproduced hydroxytyrosol dimer protects against ultraviolet- induced cell death in human immortalizedkeratinocytes[J].JournalofAgricultural and Food Chemistry，2012，60（46）：11509-17.

[24] KUDANGA T，NEMADZIVA B，LE ROSE M. Laccase catalysis for the synthesis of bioactive compounds[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2ol7，1ol（1）：13- 33.

[25]鄒灝嵐.丹參漆酶基因 SmLAC26 功能的初步研究[D].西 安：陜西師范大學(xué)，2022.

[26]ZHAO Q，NAKASHIMA J，CHEN F，et al. Laccase is necessary and nonredundant with peroxidase for lignin polymerization during vascular development in Arabidopsis [J].The Plant Cell，2013，25（10）：3976-3987.

[27]HU Q，MIN L，YANG X Y，et al. Laccase GhLacl modulates broad-spectrum biotic stress tolerance via manipulatingphenylpropanoid pathway and jasmonic acid synthesis [J].Plant Physiology，2018，176（2）：1808-1823，

[28]ROJASMURCIA N，HEMATY K，LEE Y，et a. High-ordermutants reveal an essential requirement for peroxidasesbut not laccases in Casparian strip lignification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences ，2020， 117（46）：29166-29177.

[29]LIANG M X，HAROLDSEN V，CAI X，et al. Expression of aputative laccase gene，ZmLACl，in maize primary rootsunder stress[J].Plant Cell and Enuironment，2006， 29（5）：746-753

[30] POURCEL L，ROUTABOUL J M，KERHOAS L，et al. TRANSPARENT TESTA10 encodes a laccase-like enzyme invoivea in oxiaative polymerization ol Ilavonoias in Arabidopsis seed coat[J].ThePlant Cell，2005，17（11）： 2966-2980.

[31]CAI N N，WANG Z Z，ZHU X C，et al.Schisandrin A and B enhance the dentate gyrus neurogenesis in mouse hippocampus[J]. Journal of Chemical Neuroanatomy，2020， 105：101751.

[32]YU H Y，HAO C，MENG F Y，et al. Neuroprotective lignansfrom the stems of Schisandra glaucescens[J].Planta Medica，2012，78（18）：1962-1966.

[33]DAVINLB，WANG HB，CROWELL AL，et al.Stereoselective bimolecular phenoxy radical coupling by an auxiliary（dirigent） protein without an active center[J]. Science，1997，275（5298）;362-366.

[34]陳瑞兵.Dirigent蛋白催化菘藍(lán)有效成分木脂素生物合成 的機(jī)制研究[D].重慶：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)， 2018.

[35]MATE D M，ALCALDE M. Laccase engineering：from rational design to directed evolution[J]. Biotechnology Advances，2015，33（1） ：25-40.

[36]CARDULLO N，MUCCILLI V， TRINGAL C. Laccasemediated synthesis of bioactive natural products and their analogues[J].RSC Chemical Biology，2022，3（6）：614- 647.

[37]JASUJA R，PASSAMF H，Kennedy D R，et al.Protein disulfide isomerase inhibitors constitute a new class of antithrombotic agents[J]. Journal of Clinical Investigation，2012，122（6）：2104-2113.

[38]LI F，YANG X W.Analysis of anti-inflammatory dehydrodiisoeugenol and metabolites excreted in rat feces and urine using HPLC- UV[J]. Biomedical Chromatography，2012，26（6）：703-707.

[39]陳煜，劉久石，穆新路，等.藥用植物中木脂素生物合成 DIR 基因研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2022，47（11）： 2890-2898.

[40]LINJ L，F(xiàn)ANG X，LI J X，et al.Dirigent gene editing of gossypol enantiomers for toxicity-depleted cotton seeds [J].Nature Plants，2023，9（4） ：605-615.

[41]陳賢情，王筱，賴長龍，等.一種漆酶及其制備方法、厚樸 酚的制備方法[P].浙江?。篊N202211610939.0，2023-05- 02.

Cloning and Prokaryotic Expression of Laccase Gene SsphLAC19 in Schisandra sphenantheras

TAN Fengling1，2.3，4 ，DUAN Meiyu1，2，3，4 ，F(xiàn)ENG Lei1.2.3，4， XIANG Guisheng ^{2，3，4} and ZHANG Guanghui1，2，3，4

（1.CollegeofAgronomyandBiotechnology，YunnanAgriculturalUniversityKunming65ool，China;2.National-Local

JointEngineringResearch CenteronGermplasm Innovationamp;UtilizationofChineseMedicinalMaterialsinSouthwestern China，YunnanAgriculturalUniversityKunming6502ol，China;3.TheKeyLaboratoryofMedicinalPlantBiologyof Yunnan Province，Yunnan Agricultural University，Kunming 65o2o1，China;4.Yunnan Characteristic Plant Extraction Laboratory，Kunming 65o1o6，China）

Abstract In this study，the cDNA of Schisandra sphenanthera was used as a template to perform bioinformatics analysis and clone the laccase gene of Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils. SsphLACl9 was inserted into the expression vector pET-28a via homologous recombination and transformed into BL21（DE3） competent cells for protein expression induction. This lays a foundation for further investigation of Schisandra sphenanthera laccase，which plays a critical role in catalyzing phenol coupling compounds in the lignan biosynthesis pathway. The results showed that the laccase gene located in the stem of Schisandra sphenanthera and was designated SsphLACl9 . Its open reading frame spans 1 704 bp，encoding a protein of 567 amino acids，with a molecular mass of 63.69ku and a theoretical isoelectric point of 6.28. The gene has a complete laccase copper ion domain and four copper ion binding sites. Phylogenetic analysis showed that it was clustered in the same branch as AtLAC14 and AtLAC15. Through IPTG induction at 16^°C and SDS-PAGE detection，soluble proteins were achieved in 50mmol/L and 250mmol/L imidazole eluents. Finally，pET28a-SsphLAC19 expression system was successfully constructed，and soluble proteins were stably expressed in Escherichia coli.The size of the expressed proteins was consistent with the predicted value. Enzyme activity assays using HPLC-MS confirmed that the protein can catalyze the conversion of sinapyl alcohol to racemic syringaresinol.

Key words Schisandra sphenanthera ; Laccase; Gene cloning; Prokaryotic expression; Enzyme activity reaction

Received 2024-07-06 Returned 2024-10-02

Foundation item Independent Research Fund of Yunnan Characteristic Plant Extraction Laboratory （No.2022YKZY001）.

First authorTAN Fengling，female，master student. Research area： synthetic biology of medicinal plants，functional components.E-mail：tanfenglingl03o@163.com

Corresponding authorZHANG Guanghui， male，professor. Research area： medicinal plant breeding and molecular biology，functional components.E-mail： zgh7310731o@163.com

（責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsibleeditor：PANXueyan）