梨火疫病生防菌的篩選及抑菌機(jī)理初探

庫(kù)爾勒香梨是新疆的名優(yōu)特色水果，香梨產(chǎn)業(yè)是新疆重要的支柱產(chǎn)業(yè)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和戰(zhàn)略價(jià)值。然而近年來(lái)梨火疫病在新疆多地大規(guī)模暴發(fā)，對(duì)新疆乃至全國(guó)薔薇科林果業(yè)帶來(lái)了巨大威脅和風(fēng)險(xiǎn)[]。梨火疫病病原菌解淀粉歐文氏菌（Erwiniaamylovora），可以隨風(fēng)雨鳥蟲傳播[2，侵染花、葉片、嫩梢、果實(shí)、枝干，其中花、嫩枝、幼果易出現(xiàn)變黑、褐色、枯萎等癥狀。掉落的病枝、病果導(dǎo)致病原菌在土壤中存留，土壤中的病原菌可隨灌溉水進(jìn)行傳播，從根系侵染[3-4]。因此，有必要從樹(shù)上和土壤著手進(jìn)行梨火疫病防控技術(shù)研究。目前，對(duì)梨火疫病防治以化學(xué)農(nóng)藥為主，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥極易使病原菌產(chǎn)生耐藥性[5]，并造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染。

生物防治具有高效、安全、低毒等特點(diǎn)[6-7]，目前已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)。利用生防微生物進(jìn)行梨火疫病的防治已有報(bào)道。Zeller等從不同火疫病寄主植物（蘋果、梨、山楂等）花和葉分離出39株內(nèi)生細(xì)菌，其中發(fā)現(xiàn)最有效的菌株為E.h.89，該菌株對(duì)花的相對(duì)控制率接近 70% 。王俊等[9測(cè)試了香梨花上分離的1株解淀粉芽胞桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）對(duì)梨火疫病菌的拮抗效果，并利用自行研發(fā)的蜜蜂導(dǎo)向盒進(jìn)行了蜜蜂傳播生防菌防病試驗(yàn)。結(jié)果表明，蜜蜂導(dǎo)向盒 + 生防菌技術(shù)在香梨花期可以有效控制由梨火疫菌引起的花腐和枝枯。

為篩選出更多優(yōu)良的梨火疫病生防菌資源，本試驗(yàn)采集庫(kù)爾勒香梨園枝條，并從伽師縣西梅果園采集土壤樣品，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的2 株具有廣譜抑菌效果的菌株[10]，進(jìn)行梨火疫病生防菌的篩選及盆栽防效測(cè)定，并以防效優(yōu)良的菌株為代表，提取其脂肽粗提物和蛋白粗提物，對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行初步研究，為梨火疫病的生物防控提供優(yōu)良菌種資源與技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

病原菌：梨火疫病菌解淀粉歐文氏菌（ E amylovora）Ea-1，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所從庫(kù)爾勒發(fā)病香梨樹(shù)分離獲得并保存。

供試土壤樣品：采用隨機(jī)取樣法[11]，從新疆喀什伽師縣西梅園土壤（土壤層 5～20cm 采樣，獲得土壤樣品45份。

供試枝條樣品：從新疆庫(kù)爾勒香梨園采集健康香梨樹(shù)枝條，獲得枝條樣品37份。

其他供試菌株：JS6-1、JS3-4菌株為新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期從新疆喀什地區(qū)伽師縣鹽堿地土壤及哈密瓜果實(shí)篩選獲得并保存[10]

供試培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NutrientAgar，NA）培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NutrientBroth，NB）培養(yǎng)基、LB（LBBroth）培養(yǎng)基等，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1生防菌的分離和初篩病原菌的活化：將病原菌Ea-1劃線接種于NA平板， 28^°C 條件下培養(yǎng) 12h ，挑取單菌落接種于 30mL 無(wú)菌NB液體培養(yǎng)基中， 28°C，180r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12h ，梯度稀釋至 10⁵CFU/mL ，取 100μL 涂布于NA平板。

王壤微生物的分離：稱取 5g 王壤樣品置于裝有 45mL 無(wú)菌水的三角瓶中， 35^°C.180r/min 恒溫振蕩培養(yǎng) 30min ，梯度稀釋至 10^-3?10^-4[11] 取 100μL 涂布至上述涂有病原菌Ea-1的NA平板， 28^°C 條件下培養(yǎng) 24～48h ，對(duì)產(chǎn)生抑菌圈的菌株采用三區(qū)劃線法進(jìn)行純化與保藏。

枝條內(nèi)生菌的分離：取適量梨樹(shù)枝條分別剪成 3～5cm 小段，于 75% 酒精浸泡 1min ，無(wú)菌水漂洗3次， 1% NaClO溶液中浸泡 3min ，無(wú)菌水漂洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干水分，無(wú)菌剪刀剪成1～2mm 薄片，研磨，加入含有 30mL 無(wú)菌水的三角瓶中，制成植物組織懸浮液。 35^°C，180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng) 30min ，取 100μL 涂布至上述涂有病原菌Ea-1的NA平板， 條件下培養(yǎng) 24～48h ，對(duì)產(chǎn)生抑菌圈的菌株采用三區(qū)劃線法進(jìn)行純化與保藏。

1.2.2 生防菌的復(fù)篩 利用平板對(duì)峙法對(duì)初篩獲得的生防菌及實(shí)驗(yàn)室已有的JS6-1、JS3-4進(jìn)行抑菌穩(wěn)定性檢測(cè)，具體操作如下：挑取生防菌單菌落點(diǎn)接于涂布了 100μL 病原菌 （10⁵CFU/mL） 0的NA平板，每板點(diǎn)接4株生防菌，每個(gè)生防菌重復(fù)接種3塊平板， 培養(yǎng) 24～48h ，測(cè)量抑菌圈直徑和菌落直徑，以抑菌圈直徑（ σ_?D ）與菌落直徑（d）的比值 ?[D/d ）代表抑菌能力。

采用打孔抑菌圈法對(duì)初篩獲得的拮抗效果較好的生防菌進(jìn)行復(fù)篩，測(cè)試發(fā)酵液的抑菌效果，具體操作如下：吸取 100μL Ea-1菌懸液（ 10⁵ CFU/mL ）涂布于NA培養(yǎng)基平板中，用打孔器（直徑 9mm ）在平板上均勻打孔，每孔加入 50μL 發(fā)酵液對(duì)Ea-1進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)， 28^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24～48h ，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.3生防菌的分類鑒定將生防菌接種于NA培養(yǎng)基上， 35°C 培養(yǎng) 12～24h 。挑取單菌落接種至NB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng) 12～24h ，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，采用細(xì)菌 基因通用引物27F（ 5^′ -AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG- ?3^′ ）和 1492R （ 5^′ -CGGTTACCTTGTTAC-GACTTC- 3^′ ）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（2 （50μL）^[12] ：模板DNA 2μL，2×PCR 緩沖液25μL，27F 和1492R （10μmol/L） 各 1μL，ddH₂O 補(bǔ)足 50μL 。PCR反應(yīng)條件： 95^°C5min;95^°C 個(gè)循環(huán)； 72°C 5min 。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，并申請(qǐng)基因登錄號(hào)，采用MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[3]

1.2.4室內(nèi)防效測(cè)定生防菌葉面噴施防效測(cè)定：挑取病原菌Ea ^-1 單菌落接種于 30mL NB液體培養(yǎng)基， 28°C.180Γr/min 振蕩培養(yǎng) 12～ 24h 。挑取生防菌單菌落接種于 30mL NB液體培養(yǎng)基， 35^°C 、 180r/min 振蕩培養(yǎng) ^12h 作為種子液，按 1% 接種量接種至NB液體培養(yǎng)基，35^°C.180r/min 振蕩培養(yǎng) 12h 。將病原菌和生防菌菌液濃度均調(diào)整為 2×10⁸CFU/mL 。采用盆栽杜梨實(shí)生苗進(jìn)行治療性和預(yù)防性試驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

治療性防效測(cè)定：每盆苗接種病原菌菌液0 2×10⁸ CFU/ mL ），3d后接種生防菌發(fā)酵液0 2×10⁸ CFU/ mL ），用手持式壓力噴霧器將菌液噴霧至葉片與枝條完全濕潤(rùn)。

預(yù)防性防效測(cè)定：每盆苗接種生防菌發(fā)酵液（2×10⁸ CFU/mL），3d后接種病原菌菌液 （2x） 10⁸CFU/mL） ，用手持式壓力噴霧器將菌液噴霧至葉片與枝條完全濕潤(rùn)。

CK：僅噴施病原菌菌液 （2×10⁸CFU/mL） ，用手持式壓力噴霧器將菌液噴霧至葉片與枝條完全濕潤(rùn)。

接種病原菌后采用棚布遮蓋保濕 3d 。統(tǒng)計(jì)每盆杜梨苗枝條數(shù)，待枝條出現(xiàn)發(fā)病癥狀，逐一進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。病斑長(zhǎng)度 ?1/3 枝條長(zhǎng)度，計(jì)為1級(jí)；1/3 枝條長(zhǎng)度 lt; 病斑長(zhǎng)度 ?2/3 枝條長(zhǎng)度，計(jì)為3級(jí);病斑長(zhǎng)度 gt;2/3 枝條長(zhǎng)度，計(jì)為5級(jí)[13]。按如下公式計(jì)算病情指數(shù)和防效值：

病情指數(shù) =[Σ （每處理各級(jí)病枝數(shù) x 該病級(jí)數(shù)）/該處理總枝數(shù) ×5 （最高病級(jí)） 1×100%

防效 ：=[CK 病情指數(shù)一處理病情指數(shù)]/CK病情指數(shù) ×100%

生防菌灌根防效測(cè)定：挑取病原菌Ea-1單菌落接種于 30mL NB液體培養(yǎng)基， 28^°C 、180r/min 振蕩培養(yǎng) 12～24h 。挑取生防菌單菌落接種于 30mL NB液體培養(yǎng)基， 35^°C.180r/min 振蕩培養(yǎng) ^12h 作為種子液，按 1% 接種量接種至NB液體培養(yǎng)基， 35°C，180r/min 振蕩培養(yǎng) ^12h 后采用盆栽杜梨實(shí)生苗進(jìn)行治療性和預(yù)防性試驗(yàn)，每個(gè)處理3次重復(fù)。

治療性：每盆苗灌根病原菌菌液 （2）×10⁸ CFU/mL）50mL，3 d后灌根生防菌發(fā)酵液（ 2× 10⁸CFU/mL）50mL 。

預(yù)防性：每盆苗灌根生防菌發(fā)酵液 （2×10⁸ CFU/mL）50mL，3c 1后灌根病原菌菌液 （2×10⁸ CFU/mL）50mL 。

CK：僅以 50mL 病原菌菌液（ 2×10⁸ CFU/mL 灌根。

試驗(yàn)于溫室內(nèi)進(jìn)行，接種病原菌后采用棚布遮蓋保濕 3d 。統(tǒng)計(jì)每盆杜梨苗枝條數(shù)，待枝條出現(xiàn)發(fā)病癥狀，逐一進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。病斑長(zhǎng)度 ?1/3 枝條長(zhǎng)度，計(jì)為1級(jí)；1/3枝條長(zhǎng)度 lt; 病斑長(zhǎng)度 ? 2/3枝條長(zhǎng)度，計(jì)為3級(jí)；病斑長(zhǎng)度 gt;2/3 枝條長(zhǎng)度，計(jì)為5級(jí)[13]。病情指數(shù)和防效計(jì)算公式同上。

1.2.5貝萊斯芽胞桿菌JS6-1抑菌機(jī)理初探結(jié)合平板對(duì)峙試驗(yàn)、打孔抑菌試驗(yàn)及盆栽防效測(cè)定結(jié)果，以拮抗效果穩(wěn)定且防效最佳的貝萊斯芽胞桿菌JS6-1為代表進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

JS6-1發(fā)酵液與發(fā)酵上清液抑菌效果對(duì)比：采用打孔抑菌圈法，JS6-1菌株種子液按照 1% 的接種量接種至 100mL LB培養(yǎng)基中，置于 35°C 180r/min ，搖床培養(yǎng) 24h，8000r/min 離心15min。吸取 100μL Ea-1菌懸液 （10⁵CFU/mL） 涂布于NA培養(yǎng)基平板中，用打孔器（直徑 9mm ）在平板上均勻打孔，分別吸取 50μL 無(wú)菌發(fā)酵上清液和發(fā)酵液對(duì)Ea-1進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，重復(fù)3次， 28^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h ，測(cè)量抑菌圈直徑。

貝萊斯芽胞桿菌JS6-1脂肽粗提物抑菌效果測(cè)定：JS6-1菌株種子液按照 1% 的接種量接種至 100mL LB培養(yǎng)基中，于 35°C.180r/min 條件下培養(yǎng) 48h，8000r/min 離心 20min 。取上清液，用 1mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié) pH 至 2.0，4^°C 靜置12h 。收集溶液， 8 000r/min 離心 20min ，棄上清液。所得沉淀加入 5mL 甲醇，用 ΔNaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0，室溫抽提 離心20min ，抽提過(guò)程重復(fù)3次，收集所有抽提液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。濃縮液用 0. 22μm 的濾膜進(jìn)行抽濾，即得到脂肽粗提物（ 50μL 脂肽粗提物相當(dāng)于 1.5mL 的發(fā)酵液濾液）[14]。采用打孔抑菌圈法，以溶劑甲醇為對(duì)照，分別吸取 50μL 甲醇和脂肽粗提物對(duì)Ea-1進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，重復(fù)3次， 28^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h ，測(cè)量抑菌圈直徑。

貝萊斯芽胞桿菌JS6-1蛋白粗提物抑菌效果測(cè)定：采用硫酸銨沉淀法提取發(fā)酵上清液蛋白粗提物[15]，配制飽和的硫酸銨溶液，用氨水調(diào)節(jié) pH 至7.0，備用。JS6-1菌株種子液按照 1% 的接種量接種至 100mL LB培養(yǎng)基中， 35^°C ，180r/min ，振蕩培養(yǎng) ^48h ， 8000r/min ，離心15min ，收集上清液，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨最終飽和度為 50% ，混勻，于 4^°C 靜置過(guò)夜，8000r/min，4°C 離心 15min ，分別收集上清液和沉淀，沉淀采用5倍體積的PBS緩沖液溶解，0.22μm 濾膜過(guò)濾 （50μL 脂肽粗提物相當(dāng)于0.5mL 的發(fā)酵液濾液）。采用打孔抑菌圈法，分別吸取 50μL 沉淀蛋白PBS重懸液和上清液對(duì)Ea-1進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，重復(fù)3次， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h ，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.6貝萊斯芽胞桿菌JS6-1脂肽粗提物與蛋白粗提物抑菌穩(wěn)定性研究為探究脂肽粗提物與蛋白粗提物在不同環(huán)境下對(duì)Ea-1的抑菌穩(wěn)定性，分別對(duì)脂肽粗提物與蛋白粗提物進(jìn)行高溫、紫外和蛋白酶K消化處理。

高溫對(duì)脂肽粗提物與蛋白粗提物抑菌活性的影響：將 10mL 的脂肽粗提物與蛋白粗提物分別在 40，60，80，100^°C 恒溫水浴鍋處理 ^1h 。高速離心后于 0.22μm 濾膜過(guò)濾，各取 50μL 處理過(guò)的脂肽粗提物與蛋白粗提物用打孔抑菌圈法對(duì)Ea-1進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，以未經(jīng)高溫處理的脂肽粗提物與蛋白粗提物作為對(duì)照，重復(fù)3次， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h ，測(cè)量抑菌圈直徑。

紫外對(duì)脂肽粗提物與蛋白粗提物抑菌活性的影響：取 10mL 脂肽粗提物與蛋白粗提物，分別在距離紫外燈 （19W） 下 10cm 處依次靜置5、10、15，25，30min 。高速離心后于 0. 22μm 濾膜過(guò)濾，各取 50μL 處理過(guò)的脂肽粗提物與蛋白粗提物用打孔抑菌圈法對(duì)Ea-1進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，以未經(jīng)紫外照射的脂肽粗提物與蛋白粗提物為對(duì)照，重復(fù)3次， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h ，測(cè)量抑菌圈直徑。

蛋白酶K對(duì)脂肽粗提物與蛋白粗提物抑菌活性的影響：取 1mL 脂肽粗提物與蛋白粗提物，分別加入蛋白酶K使終濃度為 1mg/mL 、2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，37°C 恒溫水浴鍋處理 ^2h 。高速離心后于 0.22μm 濾膜過(guò)濾，各取 50μL 處理過(guò)的脂肽粗提物與蛋白粗提物用打孔抑菌圈法對(duì)Ea-1進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，以未添加蛋白酶K的脂肽粗提物與蛋白粗提物為對(duì)照，重復(fù)3次， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h ，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用IBMSPSSStatistics2O軟件進(jìn)行單因素方差分析中的Duncan's法進(jìn)行顯著性分析，Origin 2018制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌的分離與篩選

從新疆庫(kù)爾勒香梨園采集枝條樣品以及從喀什伽師縣西梅園采集土壤樣品共82份，采用平板對(duì)峙法，初步篩選獲得對(duì)梨火疫病菌有拮抗效果的菌株65株，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室已有的JS6-1和JS3-4；采用多次反復(fù)試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈直徑 （D ）與菌落直徑大小 （d） 的比值 （D/d ），確定9株拮抗效果較穩(wěn)定的菌種，其中，XM4與JS6-1的抑菌作用最強(qiáng)， D/d 值為3.9，與其他菌株差異顯著（表1）;其次為XM11、XL6、XM10、JS3-4， D/d 值分別為3.5、3.4、3.4、3.2;XM1、XL3、XL7、XM8、XM9的抑菌直徑為 11. 0～23. 5mm，D/d 值均大于1.8（表2）。部分生防菌平板對(duì)峙結(jié)果如圖1所示。

選取上述抑菌作用較強(qiáng)的生防菌 （D/dgt; 2.50）XM1、XM4、XL6、XM9、XM10、XM11及實(shí)驗(yàn)室已有的JS6-1和JS3-4，采用打孔抑菌圈法對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果如表2所示，以抑菌圈直徑代表發(fā)酵液抑菌效果。其中，實(shí)驗(yàn)室已有的JS6-1抑菌效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑為 23.13mm ，與其他菌株差異顯著；其次為伽師縣西梅果園土壤篩出的XM4，抑菌圈直徑為20.87mm ；其他菌株的抑菌能力依次為 XM10gt; （24號(hào) JS3-4gt;XL6gt;XM11gt;XM9gt;XM1 。部分生防菌發(fā)酵液抑制梨火疫病菌的結(jié)果如圖1所示。

2.2 生防菌的分類鑒定

對(duì)上述拮抗效果較好的11株生防菌進(jìn)行16SrRNA基因PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，所得序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，并申請(qǐng)基因登錄號(hào)，采用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。結(jié)果表明：XM1、XL3、XM4、XL7、JS6-1均為貝萊斯芽胞桿菌（B．velezensis），XM8、JS3-4為暹羅芽胞桿菌（B.siamensis），XL6、XM11為枯草芽胞桿菌（B．subtilis），XM9為多粘類芽胞桿菌（Paenibacilluspolymyxa），XM10為解淀粉芽胞桿菌（B．a(chǎn)myloliquefa-ciens）。

2.3生防菌的室內(nèi)防效測(cè)定

2.3.1葉面噴施選取上述11株菌株進(jìn)行盆栽葉噴防效測(cè)定，盆栽防效測(cè)定結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，貝萊斯芽胞桿菌JS6-1、XM4防效均在70% 以上，與其他菌株防效差異顯著，其中JS6-1防效最佳，預(yù)防性防效達(dá)到 79.56% ，治療性防效達(dá)到 74.09% 。其次，預(yù)防性和治療性防效均大于 60% 的菌株有貝萊斯芽胞桿菌XL7、解淀粉芽胞桿菌XM10、枯草芽胞桿菌XM11和暹羅芽胞桿菌JS3-4。所測(cè)菌株中，同一菌株預(yù)防性防效優(yōu)于治療性防效，說(shuō)明在實(shí)際生產(chǎn)中，提前進(jìn)行病害預(yù)防十分必要。

2.3.2灌根選取上述XM1、XM4、XL6、XL7、XM10、XM11、JS6-1、JS3-4（主要選取預(yù)防性防效大于 50% 的芽胞桿菌）進(jìn)行灌根防效測(cè)定。結(jié)果表明（表4），貝萊斯芽胞桿菌XM4、JS6-1和解淀粉芽胞桿菌XM10防效均在 60% 以上，與其他菌株防效差異顯著，其中JS6-1預(yù)防性防效最佳，達(dá)74.4% ；XM10治療性防效最佳，達(dá) 61.55% 。其次，預(yù)防性和治療性防效均大于 50% 的菌株有貝萊斯芽胞桿菌XL7、枯草芽胞桿菌XM11和暹羅芽胞桿菌JS3-4。

2.4貝萊斯芽胞桿菌JS6-1抑菌機(jī)理初探

2.4.1發(fā)酵液與上清液抑菌效果對(duì)比據(jù)“1.2.5\"節(jié)方法進(jìn)行試驗(yàn)，其抑菌結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，JS6-1發(fā)酵液和上清液均產(chǎn)生抑菌圈，其中發(fā)酵液抑菌圈直徑為 22.5mm ，上清液抑菌圈直徑為 18.2mm ，說(shuō)明抑菌物質(zhì)可以分泌到細(xì)胞外，JS6-1發(fā)酵液和上清液均對(duì)梨火疫病菌有較好的抑制效果，但發(fā)酵液抑菌效果優(yōu)于上清液抑菌效果。

2.4.2脂肽粗提物抑菌效果測(cè)定據(jù)\"1.2.5\"節(jié)方法進(jìn)行試驗(yàn)，其抑菌結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，右孔未產(chǎn)生抑菌圈，說(shuō)明溶劑甲醇對(duì)梨火疫病原菌無(wú)抑制效果，左孔抑菌圈直徑達(dá) 30.11mm ，說(shuō)明貝萊斯芽胞桿菌JS6-1可產(chǎn)生T 為模式菌株；分支上的數(shù)字為 Botstrap值，表示構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)時(shí)計(jì)算1000次時(shí)形成該節(jié)點(diǎn)的百分比，只顯示大于 50% 的值；括號(hào)內(nèi)字母與數(shù)值為GenBank登錄號(hào)；標(biāo)尺0.02代表 2% 的16SrRNA基因序列的進(jìn)化差異.

2.4.3蛋白粗提物抑菌效果測(cè)定據(jù)\"1.2.5\"節(jié)方法進(jìn)行試驗(yàn)，其抑菌結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，上清液無(wú)抑菌活性，用PBS溶解的粗提物有抑菌活性。說(shuō)明蛋白粗提物具有抑菌活性，且用硫酸銨沉淀蛋白的方法能夠使抑菌物質(zhì)完全沉淀。

2.5貝萊斯芽胞桿菌JS6-1脂肽粗提物與蛋白粗提物抑菌穩(wěn)定性研究

對(duì)提取的脂肽粗提物與蛋白粗提物分別進(jìn)行高溫、紫外照射和蛋白酶K處理。結(jié)果如下。

熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，與對(duì)照相比，40^°C，60^°C，80^°C 處理對(duì)JS6-1脂肽粗提物的抑菌活性無(wú)顯著影響 （Pgt;0.05），100% 處理使脂肽粗提物的抑菌圈直徑下降 7.95% ，存在顯著差異（ .Plt;0. 05 ，但仍具有較強(qiáng)的抑菌活性；蛋白粗提物在不同溫度下處理 30min 后的抑菌圈直徑隨著溫度的升高呈下降趨勢(shì)，在 100°C 條件處理下的抑菌圈大小為 12.85mm ，抑菌活性較室溫條件下降 29.59% ，表明脂肽粗提物熱穩(wěn)定性優(yōu)于蛋白粗提物。紫外輻射穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明，抑菌圈直徑隨著紫外燈照射時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照相比，紫外照射 30min 后，脂肽粗提物抑菌圈直徑下降 10.97% ，存在顯著差異（ $P { lt; } 0 . 0 5 ＼dot$ ，其他處理時(shí)間脂肽粗提物抑菌圈

直徑無(wú)顯著性差異（ Pgt;0.05） ；而蛋白粗提物的抑菌圈直徑下降 23.87% ，存在顯著差異（ Plt; 0.05），表明與蛋白粗提物相比，脂肽粗提物更耐紫外線照射。圖8顯示與對(duì)照相比，經(jīng)不同蛋白酶K濃度處理，脂肽粗提物存在一定程度變化，抑菌圈直徑最高下降 9.31% ；在 3mg/mL 、4mg/mL 濃度蛋白酶K處理下，蛋白粗提物抑菌圈存在顯著差異（ Plt;0.05） ，抑菌圈直徑最高下降 15.94% ，說(shuō)明脂肽粗提物在蛋白酶K消化處理下穩(wěn)定性更好。

3討論

由于新疆特殊的地理位置，氣候高溫干燥、土壤鹽堿度較高，在多種逆境脅迫下，該地區(qū)土壤等環(huán)境中蘊(yùn)含豐富的功能性微生物資源。為進(jìn)一步獲得高適應(yīng)性和定殖能力強(qiáng)的菌種，本試驗(yàn)選擇庫(kù)爾勒香梨園和喀什地區(qū)同為薔薇科的西梅園采集樣品，進(jìn)行生防菌篩選，以期為梨火疫病的防控提供更多優(yōu)良的微生物資源。

芽胞桿菌能分泌產(chǎn)生多種對(duì)病原菌具有顯著抑菌作用的脂肽類抗生素、抗菌蛋白、細(xì)菌素和聚酮化合物等活性代謝產(chǎn)物[16-17]，是其生防作用的重要機(jī)制。但目前關(guān)于貝萊斯芽胞桿菌對(duì)梨火疫病原菌抑制機(jī)理的報(bào)道相對(duì)較少，賀旭等[18]采用酸沉淀法、硫酸銨飽和沉淀法、正丁醇萃取法對(duì)FX1菌株除菌發(fā)酵濾液中的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行了粗提及抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果表明，酸沉淀法和硫酸銨飽和沉淀法得到的粗提物具有顯著的抑菌作用，酸沉淀法提取物抑菌活性更強(qiáng)。本研究通過(guò)酸沉淀法、硫酸銨飽和沉淀法分別對(duì)貝萊斯芽胞桿菌JS6-1的脂肽粗提物、蛋白粗提物進(jìn)行提取，結(jié)果表明，脂肽粗提物和蛋白粗提物均具有顯著抑菌效果，再次明確貝萊斯芽胞桿菌脂肽類和蛋白類抑菌物質(zhì)均具有顯著的抑菌效果。

另外，有研究表明，抑菌活性物質(zhì)的抑菌效果易受外界環(huán)境如溫度、紫外光等因素的影響[19]由于新疆環(huán)境較特殊，具有高溫、強(qiáng)紫外線等環(huán)境，因此本研究增加了對(duì)脂肽粗提物、蛋白粗提物抑菌穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明JS6-1脂肽粗提物經(jīng)不同溫度、紫外光、蛋白酶K等不同條件處理后，均有一定程度的變化，這與吳艷清等[19]研究結(jié)果比較相似。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng) 60^°C 處理后，脂肽粗提物抑菌活性無(wú)顯著性差異（ Pgt;0.05? ，而蛋白粗提物的抑菌圈直徑下降 26.31% ，存在顯著差異（ Plt;0. 05） 。與對(duì)照相比，經(jīng)紫外照射25min ，脂肽粗提物抑菌活性無(wú)顯著性差異0 ?Pgt;0.05） ，而蛋白粗提物的抑菌圈直徑下降20.42% ，存在顯著差異（ Plt;0.05） 。在3mg/mL.4mg/mL 濃度蛋白酶K處理下，脂肽粗提物抑菌圈直徑最高下降 9.31% ，存在顯著差異（ ?Plt;0.05） ，蛋白粗提物抑菌圈存在顯著差異（ ?Plt;0.05） ，抑菌圈直徑最高下降 15.94% 。由此可見(jiàn)，本研究JS6-1脂肽粗提物相比蛋白粗提物對(duì)溫度、紫外線和蛋白酶處理具有更強(qiáng)的耐受能力。推測(cè)脂肽類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在的肽環(huán)（peptidering）結(jié)構(gòu)可能是脂肽類物質(zhì)保持較高穩(wěn)定性的重要原因之一[20]。

綜上，本研究篩選獲得11株較優(yōu)良的梨火疫病生防菌，結(jié)果表明XM4、XL7、XM10、XM11、JS6-1、JS3-4菌株對(duì)梨火疫病均具有較好的防效，在梨火疫病的病害防治中具有較好的應(yīng)用前景。其中貝萊斯芽胞桿菌JS6-1菌株脂肽和蛋白粗提物均具有顯著的抑菌效果，脂肽粗提物抑菌穩(wěn)定性優(yōu)于蛋白粗提物，在田間應(yīng)用中具有較大的應(yīng)用潛力，相關(guān)機(jī)制有待深人研究。

參考文獻(xiàn) Reference：

[1]陳春利.春雷霉素 @ ZIF-93納米材料的制備及其在防治梨火疫病中的應(yīng)用[D].新疆阿克蘇：塔里木大學(xué)，2023.

[2]EASTGATEJA.Erwinia amylovora ：the molecular basisoffireblightdisease[J].MolecularPlantPathology，2000，1（6）：325-329.

[3] 魯晏宏，郝金輝，羅明，等.梨火疫病拮抗菌篩選及溫室防效測(cè)定[J].微生物學(xué)通報(bào)，2021，48（10）：3690-3699.

[4] SANTANDERRD，CATALA-SENENTJF，F(xiàn)IGAS-SE-GURA A，et al.From the roots to the stem：unveiling pearroot colonization and infection pathways by Erwinia am y-lovora[J].FEMS Microbiology Ecology，2020，96（12）： fi-aa210.

[5] SHOLBERG，PETERL，KATHLEEN B，et al. Survey ofErwinia amylovora isolates from British Columbia for re-sistance to bactericides and virulence on apple[J]. CanadianJournal of Plant Pathology，2001，23（1） ：60-67.

[6]TANCOS K A，COX K D. Effects of consecutive strepto-mycin and kasugamycin applications on epiphytic bacteria inthe apple phyllosphere[J].Plant Disease，2017，101（1）：158-164.

[7]MCGHEE G C，GUASCO J，BELLOMO L M，et al.Genet-ic analysis of streptomycin-resistant （SmR） strains of Er-winia amylovora suggests that dissemination of two geno-typesisresponsible for thecurrent distribution of SmR E ：amylovora in Michigan[J].Phytopathology，2o11，101（2）：182-191.

[8] ZELLER W，WOLF B. Studies on biological control of fireblight[J].ActaHorticulturae，1996，（411）：341-346.

[9]王俊，高建誠(chéng)，巴音克西克，等.利用蜜蜂傳播生防菌防治梨火疫病[J].植物檢疫，2022（1）：9-12.

[10] 何亞芳，包慧芳，王寧，等.甜瓜鐮刀菌果腐病菌拮抗菌篩選及其拮抗性研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2023，50（10）：2257-2270.

[11］耿源濛，孫權(quán)，顧欣，等.干旱區(qū)土壤中西瓜?；图怄哏牭毒卓咕暮Y選及分類[J].河南理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，35（4）：526-532，567.

[12] 程睿君.煙草黑脛病拮抗菌ZY-11-2的篩選、鑒定及其生物防治效果研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2019.

[13] 李洪濤，張靜文，盛強(qiáng)，等.我國(guó) 20 個(gè)梨品種（種質(zhì)））對(duì)國(guó)外梨火疫病菌的抗病性評(píng)價(jià)[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2019，36（5）：629-637.

[14]XIN Z，ZHI J Z，YE H，et al. Isolation and identification ofantifungal peptides from Bacillus BHo72，a novel bacteri-umisolated from honey[J].Microbiological Research，2013，168：598-606.

[15]王全，王占利，高同國(guó)，等.響應(yīng)面法對(duì)解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）12-7產(chǎn)抗菌蛋白條件的優(yōu)化[J].棉花學(xué)報(bào)，2016，28（3）：283-290.

[16] FAN B，WANG C，SONG X，et al. Bacillus velezensisFZB42 in 2018：the gram-positive model strain for plantgrowth promotion and biocontrol[J]. Frontiers in Micro-biology，2019，10：1279-1280.

[17]任建雯，羅云艷，馮印印，等.貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5的分離鑒定及細(xì)菌素、抗菌肽基因簇挖掘[J].微生物學(xué)通報(bào)，2021，48（3）：742-754.

[18] 賀旭，韓劍，盛強(qiáng)，等.梨火疫病拮抗細(xì)菌 FX1及其抑菌物質(zhì)的防病作用[J].園藝學(xué)報(bào)，2023，50（5）：1118-1129.

[19]吳艷清，王游游，王暢，等.枯草芽孢桿菌WL2 脂肽粗提物對(duì)致病疫霉的抑制作用及其分離鑒定［J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，38（6）：632-639.

[20] 王鑫.柑橘潰瘍病菌拮抗菌的篩選及F9 菌株抑菌物質(zhì)的探究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

Screening of Biocontrol Bacteria against Fire Blight and Preliminary Study on Its Biocontrol Mechanism

LIN Shengnan ^1，2 ，WU Zifei1·2，WANG Ning1，2，GUO Wenchao3，HE Tianming ⁴ ，

SHI Yingwu2， ZHAN Faqiang2，YANG Rong2，BAO Huifang2 and LUO Mingl

（1.CollegeofAgronomy，XinjiangAgricultural University，Urumqi830o52，China；2.InstituteofMicrobiologyXinjiang AcademofAgricultural Sciences，Xinjiang KeyLaboratoryof Special Enviromental Microbiology，Urumqi830091， China；3.Plant Protection Research Institute，Xinjiang Academyof Agricultural Sciences，Urumqi830o91，China; 4.College of Horticulture，Xinjiang Agricultural University，Urumqi83oo52，China）

AbstractTo screen and obtain excellent strain resources，the biocontrol bacteria were isolated from the branches of Korla pear orchard and soil samples of Gashi County，Kashgar. The antibacterial effect was rescreened by the plate confrontation method，inhibition zone method and the control effects were tested on potted Pyrus betulaefolia seedlings. The crude liptide and protein were extracted from the representative strain with good bacteriostatic effect and treated with temperature，UV and proteinase K to explore the effects of diferent factors on the stability of bacterial inhibition.By this study，11 strains with significant bacteriostatic ability were obtained through rescreening from 67 strains. The results of confrontation plate test showed that Bacillus velezensis XM4 and JS6-1，B. subtilis XL6 and XM11，B. amyloliquefaciens XM10 and B . siamensis JS3-4 had strong antagonistic effect. The results of potted control test showed that the control effect of B . velezensis JS6-1 was the best，which reached 79.56% . The crude lipopeptide and protein of JS6-1 had significant bacterial inhibitory effect， and the diameter of the crude lipopeptide reached 30.11mm . The bacteriostatic ability of the crude lipopeptide changed slightly after treated by high temperature，ultraviolet irradiation and proteinase K digestion. While the inhibitory activity of the crude protein decreased significantly.

Key words Fire blight;Erwinia am ylovora ; Bacillus ；Biocontrol mechanism

Received 2023-10-24 Returned 2023-11-19

Foundation item Science Fund for Distinguished Young Scholars of Xinjiang（No.2O22DolE63）； Independent Cultivation Project of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences （No. xjnkycxzx-2022- 003）;Project of Fund for Stable Support to Agricultural Sci-Tech Renovation （No. xjnkywdzc2023005）； Xinjiang Forest and Fruit Industry Technology System （No. XJLGCYJSTX05-2024-11）; Major Science and Technology Projects in Xinjiang（No.2023A0200604-03）.

First authorLIN Shengnan，female，master student. Research area： plant pathology. E-mail： 1825879102@qq. com

Corresponding authorBAO Huifang，female，research fellow. Research area： plant pathology. E-mail：bbhf777 xaas. ac. cn

LUO Ming，female，professor. Research area： plant pathology. E-mail： luomingxjau@sina. com

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUOBaishou）