鄰苯二酚與L-半胱氨酸對酸黃瓜腌制過程中亞硝酸鹽代謝的影響

中圖分類號：TS972.123.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-8730（2025）02-0052-06

酸黃瓜是黃瓜加工品的一種，被消費者普遍喜愛。酸黃瓜也是腌漬菜的一種，是低鹽發(fā)酵型產(chǎn)品，主要的發(fā)酵形式是乳酸發(fā)酵，伴隨輕微的酒精、醋酸發(fā)酵[1]

植物中的硝酸鹽與亞硝酸鹽主要來自對空氣、土壤、化肥中無機與有機氮素的吸收，而未被利用的部分在植物體內(nèi)積累形成硝酸鹽。硝酸鹽在胞質(zhì)硝酸還原酶（NR）的作用下形成亞硝酸鹽，在亞硝酸還原酶（NiR）的催化下形成胺鹽。NR在該轉(zhuǎn)化通路中扮演著啟動并制約整體速率的角色，是氮素代謝中的核心酶。果蔬儲藏與加工期間形成的亞硝酸鹽，與蔬菜本身含有及蔬菜表面附著的微生物所產(chǎn)生的NR作用有關(guān)。目前尚未有研究證明亞硝酸鹽自身具有致癌性，但亞硝酸鹽在酸性環(huán)境中可形成N-亞硝胺類化合物，而N-亞硝胺是國際公認的強致癌物質(zhì)，對哺乳動物具有很強的致癌作用，因此控制亞硝酸鹽的含量是果蔬貯藏與加工過程中的關(guān)注要點[2]

腌漬蔬菜（包括酸黃瓜）在加工過程中亞硝酸鹽積累并下降，形成顯著的亞硝峰。腌漬蔬菜中硝酸鹽與亞硝酸鹽的積累與原料、發(fā)酵菌種、發(fā)酵液pH值等因素密切相關(guān)。實際腌漬生產(chǎn)過程中，可通過添加抗壞血酸、檸檬水、多酚黃酮、益生菌以及植物提取物等物質(zhì)來抑制亞硝峰的形成[1]。研究發(fā)現(xiàn)，L-半胱氨酸能影響發(fā)酵液pH值并可與亞硝酸鹽結(jié)合，鄰苯二酚能抑制NR活性，同時兩者都能增強發(fā)酵體系的抗氧化活性，從而抑制亞硝峰的形成[2]

酸黃瓜在加工過程中應(yīng)避免亞硝峰的形成，而消費過程中應(yīng)避免在亞硝峰時食用。本研究在預實驗的基礎(chǔ)上，嘗試添加抗氧化物質(zhì)（L-半胱氨酸、鄰苯二酚）來抑制亞硝酸鹽的形成與并分析其機理，為酸黃瓜中亞硝酸鹽的代謝研究提供新的信息，同時為酸黃瓜的生產(chǎn)與消費提供理論支撐

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

黃瓜（產(chǎn)地為市廣陵區(qū)，品種為玉秀2號）、洋蔥、白醋、鹽、糖：江蘇省市大潤發(fā)超市；L-半胱氨酸、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、鄰苯二酚、亞鐵氰化鉀、亞硝酸鈉、氯化銨、冰醋酸：國藥集團化學試劑有限公司。

TG1560-WS離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；N4紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司； FE20pH 計：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 制作與處理

在前期預試驗的基礎(chǔ)上，酸黃瓜的加工方法如下：黃瓜、洋蔥粗加工后切塊，將 1000g 黃瓜、150g 洋蔥 ?100g 糖 50g 鹽 .250mL 白醋分別放入泡菜壇里，加入 750mL 水后攪拌均勻，再用水封泡菜壇口，陰涼處自然發(fā)酵 。

根據(jù)預實驗結(jié)果，在上述酸黃瓜制作過程中，于浸泡液中分別加入水（對照組） ，0.5% L-半胱氨酸（L-半胱氨酸處理組） ，3% 鄰苯二酚（鄰苯二酚處理組） 0.5% L-半胱氨酸和 3% 鄰苯二酚（L-半胱氨酸 + 鄰苯二酚處理組），然后再進行發(fā)酵。

1.3 亞硝酸鹽與硝酸鹽含量測定

參照《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB/T5009.33—2016）中的方法進行亞硝酸鹽與硝酸鹽測定。

1.4銨鹽含量測定

銨鹽含量測定按《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB/T5009.33—2016）中的方法進行測定。

1.5 發(fā)酵液 pH 值測定

每發(fā)酵1d取 10mL 發(fā)酵液進行pH值測定。

1.6 總酸的測定

根據(jù)《食品安全國家標準食品中總酸的測定》（GB12456—2021）中的方法進行總酸的測定。

1.7 硝酸還原酶（NR）活性測定

取 0.5g 酸黃瓜，用 1mLpH 7.5 濃度為25mmol/L的 PBS 提取液（含3 mmol/L EDTA，5mmol/LCys）研磨，再用 3mL 提取液3次洗滌后移人離心管中， 8000r/min 離心 10min 后取上清液備用。取 0.5mL 上清液至 10mL 玻璃試管，加入 1.5mL 濃度為 0.1mol/L 的 KNO₃、0.5mL 0.2% 的NADH后在 30% 溫度條件下避光反應(yīng)30min ，結(jié)束后，加人 3mL1% 的磺胺混勻，再加入3mL 濃度為 0.02% 的 α -萘胺， 30°C 顯色反應(yīng)15min ，在 540nm 處測定吸光值，減去對照（上清液），得 ΔA₅₄₀^[3] 。發(fā)酵液 NR 活性測定直接取澄清發(fā)酵液為樣液，計算公式如下：

NR 活性

1.8 亞硝酸還原酶（NiR）活性測定

取 _0.5g 酸黃瓜，用 1mLpH 7.5 濃度為50mmol/L的PBS提取液（含1mmol/LEDTA，3mmol/LCys）研磨樣品，再用 3mL 提取液3次洗滌后移人離心管， 10000r/min 離心 10min 后取上清液備用。取 0.2mL 上清液至 2mL 離心管，加入1mL酶活反應(yīng)液（ pH 7.5 濃度為50mmol/L的Tris-HCl緩沖液，包含 0.5mmol?L 亞硝酸鈉， 1mmol/L 甲基紫精），再加入 120μL 濃度為 0.12mol/L 的 Na₂S₂O₄ （用 0.2mol/L 的NaHCO₃ 溶解）啟動反應(yīng)，此時為零點樣， 30^°C 反應(yīng) 30min 后為終點樣，分別取零點樣和終點樣各200μL 置于 10mL 離心管中，加 400μL 純水，漩渦至顏色消失，再加入 1mol/L 的 ZnAc 400μL ）1% 磺胺和 0.02% 的 ∝ -萘胺各 1mL，30^qC 顯色15min ，結(jié)束后在 540nm 獲得零點樣和終點樣的吸光值，以上清液為對照，測定其零點和終點差值[4]。發(fā)酵液 NiR活性測定直接取澄清發(fā)酵液為樣液，計算公式如下：

NiR活性

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS27.0軟件進行方差分析，采用Tukey多重比較法進行差異顯著性分析， Plt; 0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1酸黃瓜發(fā)酵過程中硝酸鹽含量的變化

酸黃瓜發(fā)酵過程中果實中硝酸鹽的變化見圖1。在酸黃瓜腌制過程中，硝酸鹽含量先降后升，從 163.04mg/kg 起始，在第5天達到最低（ 32.96mg/kg ）。添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚的處理組中，硝酸鹽含量變化趨勢與對照基本一致，但整體含量比對照偏低，其中鄰苯二酚處理樣品中的含量低于L-半胱氨酸處理樣品，而混合處理樣品的含量最低，說明添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚能降低酸黃瓜中硝酸鹽含量，且可互為增效。

2.2酸黃瓜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化

酸黃瓜發(fā)酵過程中果實中亞硝酸鹽含量的變化見圖2。亞硝酸鹽含量先升后降 （0.69mg/kg 起始， 1mg/kg 結(jié)束），在第3天達到峰值（2.7mg/kg） 。在亞硝峰形成階段，硝酸鹽含量迅速降低，說明酸黃瓜腌制過程中的亞硝酸鹽是由硝酸鹽還原形成。該結(jié)果與馬延巖[4]的研究結(jié)果一致。

添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚的處理組中，亞硝酸鹽含量整體低于對照組，鄰苯二酚處理樣品中的含量低于L-半胱氨酸處理樣品，而混合處理的樣品含量最低，說明添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚能降低酸黃瓜中亞硝酸鹽含量，且可互為增效。鄰苯二酚能夠抑制雜菌生長，使NR活性降低，對亞硝酸鹽的形成有阻礙作用[5]。同時在酸性條件下，亞硝酸鹽以亞硝酸的形式存在，可以轉(zhuǎn)化為一些硝化物質(zhì)，而鄰苯二酚可以促進反應(yīng)的發(fā)生，使亞硝酸鹽降解[6]。L-半胱氨酸中的巰基能與亞硝酸鹽反應(yīng)生成巰代亞硝酸酯類化合物，從而對亞硝酸鹽的生成起阻礙作用[2]。L-半胱氨酸能夠抑制發(fā)酵菌的活力，還可與亞硝酸鹽作用生成HNO₂ HNO₂ 經(jīng)氧化降解產(chǎn)生NO，進而降低亞硝酸鹽在發(fā)酵中的濃度]

2.3酸黃瓜發(fā)酵過程中銨鹽含量的變化

酸黃瓜發(fā)酵過程中果實中發(fā)酵液銨鹽含量的變化見圖3。發(fā)酵液中銨鹽含量較低，遠低于同時期果實組織中的亞硝酸鹽含量，同時各組發(fā)酵液銨根離子含量平穩(wěn)，說明亞硝酸鹽未經(jīng)銨化作用產(chǎn)生 NH₄⁺ ，發(fā)酵液中的銨根并不是亞硝酸鹽的降解產(chǎn)物。亞硝酸鹽的降解過程為通過反硝化作用變?yōu)?N₂ ，或通過銨化作用變?yōu)?NH₄^+[7] 。穩(wěn)定的發(fā)酵液銨鹽含量說明添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚沒有改變亞硝酸鹽經(jīng)反硝化作用的降解途徑。

2.4酸黃瓜發(fā)酵過程中 ΔpH 值的變化

酸黃瓜發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值的變化見圖4。在酸黃瓜腌制過程中，發(fā)酵液 pH 值較為穩(wěn)定，無明顯差異，說明發(fā)酵液為穩(wěn)定高酸性環(huán)境（ pHlt;4AA^? 。硝酸鹽以酸降解為主，高酸度能促進硝酸鹽降解。劉叢叢等[8]改變發(fā)酵液初始 pH 值能抑制亞硝酸鹽產(chǎn)生，這是因為低 ΔpH 值的發(fā)酵液對有害菌有抑制作用，同時亞硝酸鹽可與酸反應(yīng)，生成亞硝酸，其性質(zhì)不穩(wěn)定并繼續(xù)分解生成NO^[6，9] 。在發(fā)酵初期，添加 L-半胱氨酸、鄰苯二酚使發(fā)酵液 pH 值上升，而后保持穩(wěn)定在 pHlt;4 各處理組差異不顯著。紀淑娟等[0]發(fā)現(xiàn)泡菜在發(fā)酵過程中， pH 值會從初始的7降低到發(fā)酵后期的4，說明泡菜發(fā)酵后期 pH 值會維持在4左右。該現(xiàn)象說明發(fā)酵過程中發(fā)酵液酸度環(huán)境穩(wěn)定，添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚雖稍微提高了 pH 值，但其酸度環(huán)境沒有改變。

2.5酸黃瓜發(fā)酵過程中總酸含量的變化

酸黃瓜發(fā)酵過程中果實總酸含量的變化見圖5。酸黃瓜發(fā)酵過程中，其組織總酸含量先迅速增加，在第5天后上升緩慢，該現(xiàn)象是酸黃瓜發(fā)酵過程中乳酸菌發(fā)酵導致乳酸等酸性物質(zhì)積累[1]，隨著發(fā)酵時間的延長，乙醇等底物含量逐漸減少，同時酸性物質(zhì)積累抑制進一步發(fā)酵[12]。與對照組相比，添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚處理后果實組織的總酸上升速度更快，可更早發(fā)酵成熟，該現(xiàn)象可能是由于添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚抑制了雜菌的生長，促進了乳酸菌、醋酸菌等產(chǎn)酸微生物的生長。在酸黃瓜發(fā)酵進程中，產(chǎn)生了豐富的乳酸，同時伴隨產(chǎn)生少量的乙酸、檸檬酸等多元有機酸[13]。在高酸性環(huán)境中， NO₂^- 能和 H⁺ 反應(yīng)生成HNO₂ ，隨后亞硝酸經(jīng)歷自歧化作用，分解為 NO₂ 和NO[14] O

2.6酸黃瓜發(fā)酵過程中NR活性的變化

酸黃瓜發(fā)酵過程中果實NR活性的變化見圖6。酸黃瓜組織中的NR活性呈逐漸下降的趨勢。在酸黃瓜發(fā)酵過程中添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚后，酸黃瓜組織中的NR活性降低明顯，說明L-半胱氨酸、鄰苯二酚能有效降低果實組織NR活性，進而降低發(fā)酵產(chǎn)物中亞硝酸鹽含量。

酸黃瓜發(fā)酵過程中發(fā)酵液中NR活性的變化見圖7。發(fā)酵液中NR活性呈先升后降的趨勢，該變化趨勢與亞硝酸鹽含量變化相近，說明酸黃瓜中亞硝酸鹽含量的改變是發(fā)酵液中微生物的NR將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽所致，而酸黃瓜中的NR與亞硝酸鹽生成之間并不存在直接的聯(lián)系[4]，該結(jié)果與紀淑娟等[0]的研究結(jié)果一致。添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚后，發(fā)酵液中的NR活性變化趨勢與對照組相同，但NR活性與對照組相比顯著降低，說明L-半胱氨酸、鄰苯二酚能有效降低發(fā)酵液的NR活性，進而降低發(fā)酵產(chǎn)物中的亞硝酸鹽含量。研究表明，鄰苯二酚易被氧化，產(chǎn)生醌類化合物，能夠殺滅細菌、真菌和病毒，直接抑制能夠產(chǎn)生 NR 的發(fā)酵菌的活性[15]。L-半胱氨酸中含有巰基，能與亞硝酸鹽反應(yīng)生成巰代亞硝酸酯類化合物，降低NR活性[2]

2.7 酸黃瓜發(fā)酵過程中NiR活性的變化

酸黃瓜發(fā)酵過程中果實NiR活性的變化見圖8。酸黃瓜組織中NiR活性呈緩慢上升趨勢，發(fā)酵中后期NiR活性無顯著差距。添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚能抑制黃瓜組織NiR活性的上升，但在發(fā)酵中后期與對照差異不明顯。該現(xiàn)象說明果實中NiR并非是處理組酸黃瓜發(fā)酵中亞硝酸鹽含量降低的主要因素。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是在 pHlt;5.0 時，NiR活性急劇下降，而亞硝酸鹽的降解以酸降解為主[6] 。

酸黃瓜發(fā)酵過程中發(fā)酵液中NiR活性的變化見圖9。酸黃瓜發(fā)酵液中NiR活性同樣呈緩慢上升趨勢，發(fā)酵中后期NiR活性無顯著差距，說明在 pHlt;4 的酸性環(huán)境下以酸降解為主，發(fā)酵液NiR活性不是決定產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量的決定性因素。添加L-半胱氨酸、鄰苯二酚能抑制發(fā)酵液NiR活性的上升，但在發(fā)酵中后期與對照差異不明顯。

3 結(jié)論

本研究探究酸黃瓜腌制過程中硝酸鹽與亞硝酸鹽代謝機制，并分析L-半胱氨酸、鄰苯二酚處理對硝酸鹽與亞硝酸鹽積累的抑制作用。結(jié)果顯示，硝酸鹽含量呈持續(xù)下降趨勢，亞硝酸鹽含量在發(fā)酵初期表現(xiàn)為先升后降的趨勢，這與發(fā)酵液NR活性變化趨勢吻合，說明黃瓜中累積的硝酸鹽在發(fā)酵液NR的作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。在酸黃瓜腌制過程中加入L-半胱氨酸和鄰苯二酚，亞硝酸鹽含量及NR活性均降低，表明L-半胱氨酸與鄰苯二酚能夠通過抑制NR的活性，阻礙硝酸還原反應(yīng)的發(fā)生，并促進亞硝酸鹽的分解，進而降低酸黃瓜腌制品中亞硝酸鹽含量。

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Abstract：Using cucumbers as raw materials，this study investigated the metabolic mechanisms of nitrate and nitrite during the pickling process of pickled cucumbers，and analyzed the effects ofL-cysteine and catechol alone and in combination on nitrate and nitrite metabolism in this processThe results showed that the nitrate content in cucumber tissue decreased from 163.04mg/kg at the beginning of fermentation to 32.96mg/kg on day 5.Meanwhile the nitrite content in cucumber tissue increased from an initial 0.69mg/kg to a peak value of 2.7mg/kg on day 3，before declining to 1mg/kg by the end of the 7-day fermentation period。 Nitrate was convertedto nitrite by nitrate reductase in the fermentation broth，resulting inthe nitrite peak.Nitritereductase and organic acids rapidly decomposed nitrite，with organic acid degradation playing the dominant role. BothL-cysteine and catechol inhibited the activity of nitrate reductase during fermentation，thereby reducing nitrite content during the pickling process of pickled cucumbers.The combination of L-cysteine and catechol has the best effect.

Key Words： pickled cucumber; nitrite; nitrate reductase; L-cysteine; catechol; fermentation

（責任編輯：趙 勇）