外源基因插入位點對抗蟲棉Bt蛋白含量的影響

中圖分類號：S562；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）07-0044-10

Effect of Exogenous Gene Insertion Site on Bt Protein Content in Insect-resistantCotton

ZHAO Guiyuan ^1，2 ，WANG Yongqiang2，LIU Jianguang2，GENG Zhao2， ZHANG Hanshuang2 WULiqiang1，WANG Xingfen1*，ZHANG Guiyin1*

（1.StateKeyLaboratoryofNorthChinaCropImprovemenandRegulation，KeyLaboratoryforCropGermplasmResourcesof Hebei，ColegeofAgronomy，Hebei AgriculturalUniversity，HebeiBaodingO7Oo，China;2.KeyLaboratoryofCottonBiology andGeneticBreedinginHuanghuaihaiSemiaridAreaofMinistryofAgricultureandRuralAfairs，InstituteofCoton，Hebei AcademyofAgricultureand forestrySciences，ShijiazhuangO5oO51，China）

Abstract：The insertion sites of exogenous genes can affct the gene expression and character expression of recipient materials.Inorder todeterminetheefectof exogenousgeneinsertionsitesonBtproteincontentof insect-resistant coton，29 insect-resistant coton lines were selected for Bt protein content determination and wholegenome resequencing analysis.The results showed thatthere were significant diferences in Bt protein content among diffrent lines，and the K3 line was the highest.Whole-genome resequencing analysis and PCR identification revealedthat the Btgene wasa single copyin 29 lines，but the insertion sites were different. The Bt gene of K3 line was located in the 2 791 303＼～2 791 335 bp of A02 chromosome，while the Bt gene of other lines were located in D12 chromosome. To further verifytheefectof insertionsiteon Btproteincontent，theK3 line was hybridization withcontrol Xinmian 33B，and F₂ population was constructed. The results showed that the Bt protein content of F₂ individual plants with theinsertion siteof Bt gene in AO2 chromosome was significantly higher than that D12 type individual plants.In summary，the Bt protein content was affected by the insertion site of Bt gene，and its location on chromosome A02 was more conducive to the efficient expression of Bt gene.Above results could provide germplasm resources and theoretical support for breeding new varieties of insect-resistant cotton.

Keywords：insect-resistant cotton；exogenous gene；insertion site；Bt protein

棉花（Gossypium spp.）是集纖維、油料、飼料于一身的重要經(jīng)濟(jì)作物。棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）是棉花生長過程中面臨的主要害蟲之一，每年給我國棉花產(chǎn)業(yè)造成的損失超過總產(chǎn)量的 10%^[2-3] 。近年來，隨著 Bt 基因成功植入棉花，棉鈴蟲危害得到了顯著控制[4-5]。棉花已成為全球第三大轉(zhuǎn)基因作物，2022年轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的種植面積達(dá)到2540萬 hm² ，占棉花總種植面積的 80% 以上。

盡管轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在棉花生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用，但不同品種間Bt蛋白含量的差異導(dǎo)致了抗蟲效果的不一致性，進(jìn)而影響了產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。目前，國內(nèi)外學(xué)者對這一問題進(jìn)行了大量研究，但多集中在外界環(huán)境因素的影響方面，如溫度、王壤鹽度和肥料等。周冬生等和陳源等研究顯示，溫度是影響轉(zhuǎn) Bt 棉抗蟲性的重要環(huán)境因素，尤其是低溫對抗蟲棉葉片Bt蛋白含量的影響最為顯著。同時，土壤鹽度較高也會顯著影響抗蟲棉在不同生長階段的Bt蛋白含量]。氮素代謝與抗蟲棉Bt蛋白含量之間呈顯著正相關(guān)，直接影響抗蟲性的高低]。此外，空氣中的二氧化碳和臭氧含量等環(huán)境因素也會影響轉(zhuǎn) Bt 基因棉的抗蟲性[12-13]

轉(zhuǎn)基因作物的分子特征包括外源基因的表達(dá)載體、T-DNA片段特征、拷貝數(shù)、插入位點和穩(wěn)定性等遺傳信息[4]，其中拷貝數(shù)和插入位點尤為關(guān)鍵[15]。郭旺珍等研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲棉品系中 Bt 基因拷貝數(shù)的增多并沒有使其抗性增強，反而使外源基因的表達(dá)受到一定抑制。但也有研究發(fā)現(xiàn)，擁有多拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因作物能夠持續(xù)的表達(dá)和遺傳[17]。夏蘭芹等[18]利用轉(zhuǎn)基因方法以多拷貝方式將 Bt 基因整合并轉(zhuǎn)入相關(guān)植物體中，并且檢測到穩(wěn)定的蛋白含量，從而說明外源基因能夠在受體植株中持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。外源基因隨機(jī)插入宿主基因組，其整合位置可能是染色體的特定位點或染色體上的任意位置[9]。外源基因的表達(dá)水平受其插入位點的影響，從而在植物體上產(chǎn)生特定的外在表現(xiàn)。研究表明，轉(zhuǎn)基因植株間外源基因表達(dá)的顯著差異往往由其在宿主基因組中的不同插入位點引起[20-21]。Pedersen等[22]探討了不同麥類轉(zhuǎn)化體的插入整合規(guī)律，并強調(diào)了外源基因插入位點對其穩(wěn)定表達(dá)的重要性。李亞麗等[23]對轉(zhuǎn)基因水稻的插入位點分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA表現(xiàn)出一定的位置效應(yīng)。

盡管關(guān)于外源基因插入位點的研究較多，但關(guān)于不同插入位點對受體材料影響的研究卻相對較少。本研究團(tuán)隊前期培育出一個Bt蛋白含量極高的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉純合品系K3，其平均蛋白含量是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B的1.8倍以上。因此，本研究對不同轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品系的Bt蛋白含量進(jìn)行比較，并通過全基因組重測序技術(shù)分析了不同抗蟲棉品系的 Bt 基因插入位點；利用Bt蛋白含量超高但 Bt 基因插入位點不同的K3品系與對照新棉33B構(gòu)建雜交群體，鑒定分析F群體中不同類型單株的Bt蛋白含量差異規(guī)律，從而進(jìn)一步驗證插入位點對抗蟲棉Bt蛋白含量的影響，旨在從外源基因分子水平揭示抗蟲棉Bt蛋白差異機(jī)制，研究結(jié)果將為轉(zhuǎn)基因棉高抗蟲育種研究提供重要參考。

1材料與方法

1.1供試材料

試驗材料分為品系材料和群體材料。品系材料包括29個轉(zhuǎn) Bt 基因抗蟲棉品系，均為高代純合品系，由來源不同的優(yōu)勢非轉(zhuǎn) Bt 基因ND系列材料與新棉33B（33B）雜交獲得，以新棉33B為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中棉所12（CCRI12）為陰性對照（表1）。群體材料為品系K3與新棉33B雜交后的 F₁ 和 F₂ 群體。品系材料用于分析不同品系間Bt蛋白含量和 Bt 基因插入位點差異；群體材料用于鑒定不同插入位點群體Bt蛋白含量差異。所涉及的 Bt 基因均為 CryIAc 基因。所有供試材料均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳育種研究室選育與創(chuàng)制。

試驗于2019—2023年在河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所小安舍試驗站（石家莊市新華區(qū)，38^°05^′N，114^°25^′E） 進(jìn)行。試驗地為中壤土，土壤肥力中等，有嚴(yán)格的轉(zhuǎn)基因隔離防護(hù)帶。于2019—2022年種植29份品系材料，采用隨機(jī)區(qū)組排列，每個品系種植4行區(qū)，3次重復(fù)，兩邊設(shè)保護(hù)行。于2021年配置品系K3與新棉33B雜交組合，2022年種植 F_r 群體，2023年種植 F₂ 群體及父母本。所有材料均為4月下旬田間播種，等行距種植，行距 76cm ，行長 7m ，株距 20cm 。采用常規(guī)棉花田間栽培水肥管理，整個生育期不施用防治棉鈴蟲的藥劑。

1.2試驗方法

1.2.1Bt蛋白含量檢測試驗材料種植期間于蕾期取頂部第1片完全展開葉片測定Bt蛋白含量。樣品用液氮速凍后放入干冰中，迅速帶回實驗室檢測或放入 -80^°C 超低溫冰箱中保存并盡快檢測。

采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（enzymes linked immuno sorbent assays，ELISA）測定Bt蛋白 含量[]

1.2.2全基因組重測序采用Paterson等24方法提取各品系葉片DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop檢測DNA質(zhì)量；將質(zhì)量檢測合格的DNA樣品用于建庫，送至安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司進(jìn)行測序。

建庫流程如下：檢驗合格的DNA樣品通過Covaris破碎機(jī)隨機(jī)打斷成長度為 350bp 的片段[25]。采用 TruSeq Library Construction Kit進(jìn)行建庫，嚴(yán)格使用說明書推薦的試劑和耗材。DNA片段經(jīng)末端修復(fù)、加ployA尾、加測序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個文庫制備。文庫構(gòu)建完成后進(jìn)行illumina NovaSeq 600O 測序[26]。

1.2.3插入位點分析與鑒定方法將所測序列與TM-1基因組序列進(jìn)行合并得到參考文件ref.fa。將過濾后cleanreads通過BWA比對到ref.fa基因組得到bam文件[27]。用SAMtools對比對結(jié)果進(jìn)行排序；再用Picard標(biāo)記重復(fù)序列（markduplicatereads）[28]。從bam文件中篩選出比對到的外源序列reads。將篩選出的reads與TM-1基因組進(jìn)行比對，預(yù)測插入位點。

根據(jù)預(yù)測出的插入位點側(cè)翼序列和 Bt 基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異擴(kuò)增側(cè)翼序列的PCR引物（表2），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物設(shè)計的原則是跨拼接區(qū)域：左側(cè)鑒定引物的上游位于參考基因組上，下游位于載體序列上（LeftBorder，即LB引物）；右側(cè)鑒定引物的上游位于載體序列，下游位于參考基因組（RightBorder，RB引物）29。通過瓊脂糖凝膠電泳，能擴(kuò)增到目的長度片段的即可驗證插入位點。

PCR體系： 2× SuperPfxMasterMix 12.5μL ，正引物 1μL ，反引物 1μL ，DNA 1μL μL，ddH₂O9.5μL_c PCR程序： 98^°C 預(yù)變性 5min;98^°C 變性 30s，55～ 65^°C 退火 30s，72° 延伸30s，34個循環(huán)； 72^°C 終延伸 10min 。PCR產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4群體純合型單株鑒定于2023年5月苗期取 F₂ 群體單株上部 1cm² 鮮嫩葉片置于 2mL 離心管，冰上保存帶回實驗室。采用Paterson等24方法提取DNA，根據(jù)表2引物序列對其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對 F₂ 單株鑒定過程中，擴(kuò)增到A02型條帶且未擴(kuò)增到D12型條帶的稱為A02型單株；擴(kuò)增到D12型條帶且未擴(kuò)增到A02型條帶的稱為D12型單株。盡快鑒定完并標(biāo)記純合型單株，用于蕾期不同類型單株Bt蛋白含量的檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的整理與分析，采用Origin軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1不同抗蟲棉品系Bt蛋白含量差異

對29份抗蟲棉品系的Bt蛋白含量比較（圖1）表明，不同品系的平均Bt蛋白含量存在差異。盡管同一品系在不同年份會因氣候條件、栽培措施等因素出現(xiàn)波動，但整體趨勢保持一致，表明Bt蛋白含量主要受品系自身的遺傳背景和內(nèi)在分子機(jī)制影響。

進(jìn)一步分析表明，Bt蛋白含量在 以上的只有K3品系，極顯著高于其他品系；含量在 1000～2000ng^?g^-1 有2個，為K12品系和陽性對照新棉33B（K26）；其余品系的Bt蛋白含量低于 1 000ng?g^-1 。29個品系中，K3品系的Bt蛋白含量極顯著高于對照新棉33B，K12品系與新棉33B差異不顯著，有7個品系顯著低于新棉33B，有19個品系極顯著低于新棉 33B 。綜上表明，各品系間Bt蛋白含量存在顯著差異。

2.2 插入位點分析和PCR鑒定

對29個品系進(jìn)行全基因組重測序，共獲得總堿基數(shù)超 700Gb 的數(shù)據(jù)，測序深度超過 10×，Q30 值均超過 92%，Q20 值均為 100% 。其中品系K3的原始reads數(shù)為 145 574 824 條，原始Bases為23.7G，Q30為 95.69% ，其中測序深度 10× 的比例為76.75% 。新棉33B的原始reads數(shù)為158525832條，原始Bases為23.6G，Q30為 93.75% ，其中測序深度 10× 的比例為 76.69% 。

對全基因組重測序數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析表明，29個品系中 Bt 基因的拷貝數(shù)均為1，但插入位點有2種，分別位于A02染色體和D12染色體（表3）。K3品系中 Bt 基因插入到A02染色體2791303＼～2791335處，插入位點處有 32bp 的堿基缺失，將這種類型稱為A02型；其余品系均插入到D12染色體，除K13和K23外的26份品系均插入49127447＼～49127527bp處，且插入位點處有80bp 的堿基缺失，將這種類型稱為D12型。

為進(jìn)一步明確各品系 Bt 基因插入位點，分別利用D12和A02染色體特異性引物對其進(jìn)行PCR鑒定。D12染色體特異性引物PCR鑒定表明，除K3外的其他品系都擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶（圖2）；A02染色體特異性引物PCR鑒定表明，只有K3品系擴(kuò)增出目的條帶，其他品系均未擴(kuò)增出條帶（圖3）。綜合重測序結(jié)果表明， Bt 基因插入到K3品系A(chǔ)02染色體相應(yīng)位置，而其余品系則插入到D12染色體相應(yīng)位置。

2.3群體純合型單株鑒定與Bt蛋白含量比較

由圖4可知，K3品系的Bt蛋白含量極顯著高于新棉 33B 。2019—2023年新棉33B的Bt蛋白含量為 1151.00～1543.70ng?g^-1， ，而K3的蛋白含量為 2140.93～2765.84ng^?g^-1 ，較新棉33B顯著提高65.17%～96.76% ，二者差異達(dá)極顯著水平。

因K3品系的Bt蛋白含量極顯著高于對照新棉33B，且二者Bt基因插入位點亦不相同，故利用K3與新棉33B雜交后的 F₁ 和 F₂ 群體單株Bt蛋白含量分布規(guī)律進(jìn)一步驗證插入位點對Bt蛋白含量的影響。2022年獲得K3與新棉33B的 F₁ 單株369株，2023年獲得 F₂ 單株921株。通過特異性引物對其進(jìn)行基因型鑒定表明，A02型和D12型單株的數(shù)量分別為42和53株。

2022年部分 F₁ 代單株Bt蛋白含量測定（表4）表明，其含量為 1567.73～2762.57ng^?g^-1. ，不同單株間差異較大，但介于2個親本之間。通過對A02型和D12型2種純合型 F₂ 單株Bt蛋白含量研究（圖5）表明，A02純合型單株的蛋白含量為2311.40～2771.43ng^?g^-1， ，均極顯著高于D12型。由此表明， Bt 基因插入位點位于A02染色體的 F₂ 單株的蛋白含量顯著高于D12型單株。綜合分析表明，Bt蛋白含量受 Bt 基因插入位點影響，當(dāng)其插入A02染色體時更利于 Bt 基因的高效表達(dá)。

3討論

隨著對轉(zhuǎn)基因作物的不斷研究，外源基因的不穩(wěn)定性和表達(dá)多樣性等因素增加了基因高效表達(dá)的難度，從而制約了轉(zhuǎn)基因育種的研究與利用。因此，尋找和創(chuàng)制高表達(dá)且穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因材料就顯得尤為迫切。本研究發(fā)現(xiàn)，K3品系的 Bt 基因插入到A02染色體后極大地提高了抗蟲棉的Bt蛋白含量，是其他品系的1.8＼～5.3倍，且通過K3品系構(gòu)建的后代群體實現(xiàn)了超高Bt蛋白的遺傳和表達(dá)。研究結(jié)果為培育高效抗蟲棉新品種提供了優(yōu)異種質(zhì)資源。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中發(fā)展較快、應(yīng)用較廣泛的新技術(shù)之一，已成為打破物種間隔離障礙的有效手段[30]。外源基因在受體植物基因組中的插入具有隨機(jī)性，因此，明確外源基因的插入位點對于轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境釋放和安全評估至關(guān)重要3]。隨著下一代測序技術(shù)（next-generationsequencing，NGS）的成熟發(fā)展和廣泛商業(yè)化運用，利用全基因組測序技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因作物的插入位點已成為可能，這種方法不僅精準(zhǔn)而且便捷[32]。研究證實，傳統(tǒng)的Southern雜交與NGS檢測結(jié)果之間具有較高的一致性[33]。利用重測序分析鑒定插入位點的方法已在多種轉(zhuǎn)基因動植物基因組中成功應(yīng)用，實現(xiàn)了對外源基因的精確定位[26.3436]

本研究表明，不同抗蟲棉品系的Bt蛋白含量顯示出不同程度差異。其中，K3品系由于Bt基因插人位點的不同，Bt蛋白含量顯著提高。而在插入位點相同的情況下，關(guān)于外源基因表達(dá)差異的研究多集中在甲基化方面。甲基化包括DNA甲基化和RNA甲基化，是植物體內(nèi)重要的表觀遺傳修飾方式，能夠顯著調(diào)控基因的表達(dá)和系統(tǒng)發(fā)育[37-40]。DNA甲基化對基因的調(diào)控多發(fā)生在分子水平上，在一定程度上影響植物的生長和發(fā)育[4u]。DNA甲基化常常與啟動子區(qū)的甲基化聯(lián)系在一起[42]。研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲棉在生殖生長階段發(fā)生的甲基化能夠直接影響B(tài)t蛋白的表達(dá)，從而降低抗蟲棉的抗蟲性；并且Bt蛋白含量的高低跟35S啟動子甲基化直接相關(guān)43]。涉及啟動子的DNA甲基化可發(fā)生在植物的多種代謝途徑中，對基因的不表達(dá)或高效表達(dá)起關(guān)鍵作用44。作為轉(zhuǎn)錄后水平的一種調(diào)控方式，RNA甲基化對真核生物基因的表達(dá)同樣起著重要的調(diào)節(jié)作用。RNA轉(zhuǎn)錄后修飾已成為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[45]。 N⁶. 甲基腺苷 （ N⁶ -methyladenosine， m⁶A 是RNA腺嘌呤核苷酸在第6位氮原子上發(fā)生的甲基化修飾現(xiàn)象。這種修飾在mRNA中極為常見，并具有重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能。從哺乳動物到病毒再到植物， m⁶A 修飾都發(fā)揮著不可忽視的作用[46-47]。對于具有相同插入位點的品系間Bt蛋白含量差異的分子機(jī)制，未來可進(jìn)一步利用DNA和RNA甲基化相關(guān)分子技術(shù)進(jìn)行探究。

將外源基因成功插入受體材料并且實現(xiàn)高效表達(dá)，意味著該區(qū)域是理想的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，可以作為候選的轉(zhuǎn)基因友好位點。因此，未來通過多種方式的外源基因轉(zhuǎn)化事件，結(jié)合基因編輯技術(shù)，能夠?qū)⒏信d趣的特定基因精確地插入這些友好位點，從而獲得穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的轉(zhuǎn)基因材料，這將避免隨機(jī)整合所引發(fā)的諸多問題[35]。

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