利用InDel分子標(biāo)記鑒定新鄉(xiāng)小包23大白菜種子純度

The seed purity identification of Chinese cabbage Xinxiangxiaobao 23 by InDel molecular marker

XUShijing'， WANG Xiaoling1， XIAO Yan'， YUANRanghua'， YANG Chen2， JI Keying2 （1.Xiniag Henan，China）

Abstract：Torapidlydetectthepurityofhybridseedsfromfrozendamaged plots intheoverwinteringseed production base of Xinxiangxiaobao23，ensure that the qualityof seeds entering the market meets standards，protect consumers rights，ad improvethe eficiencyofhybridseed screening，specific primers were selectedfrom12 pairsof InDelprimers for Chinesecabbage to distinguish Xinxiangxiaobao 23andits parents，and seed identification wascarriedout.The resultsshowedthatthree pairsof primersexhibitedco-dominance，amongwhichonepaircould effectivelydistinguish Xinxiangxiaobao23fromtheotherthreesimilarvarieties.This primerwas verifiedin108hybrid progenies，andthe purity identification result was 93.5% ，whichwas basically consistentwith the field identification result.In conclusion，the InDelmarkerBrID9ol05selectedinthis studycanbeusedforrapid identificationof seedpurityin Xinxiangxiaobao 23， promoting the healthy development of the seed industry.

Key words：Chinese cabbage;Xinxiangxiaobao 23;InDel molecular marker; Seed purity identification

大白菜（Brassica rapaL.ssp.pekinensis）屬于十字花科蕓臺屬植物，在我國廣泛種植，年種植面積多達180萬 hm² ，北方地區(qū)，如山東、河北、河南等地成為大白菜的主產(chǎn)區(qū)。這些地區(qū)的種植規(guī)模較大，且以連片種植為主，機械化程度較高。南方地區(qū)，如云南、貴州、四川等地憑借獨特的氣候差異，可實現(xiàn)錯季種植，填補市場空白[。大白菜營養(yǎng)價值較高，富含維生素C、胡蘿卜素，鈣、鐵、鉀等礦物質(zhì)，以及膳食纖維等，能增強免疫力，有益健康。大白菜在我國經(jīng)濟體系中具有重要價值，主產(chǎn)區(qū)規(guī)模化種植收益可觀，可有效帶動農(nóng)資、運輸?shù)认嚓P(guān)產(chǎn)業(yè)，為農(nóng)民創(chuàng)造更多就業(yè)與增收機會。同時，其產(chǎn)量大、價格親民，能在蔬菜價格波動時穩(wěn)定市場。在加工領(lǐng)域，大白菜作為原料推動了酸菜、泡菜、脫水蔬菜等產(chǎn)業(yè)發(fā)展，延伸產(chǎn)業(yè)鏈，創(chuàng)造大量就業(yè)崗位，提升產(chǎn)品附加值，促進地方經(jīng)濟繁榮[2]。

種子純度直接影響著大白菜的生長表現(xiàn)、產(chǎn)量以及品質(zhì)。高純度的種子能夠確保大白菜在田間生長整齊一致，植株在形態(tài)、生長周期、抗逆性等諸多方面呈現(xiàn)出較為穩(wěn)定的特征，從而便于進行統(tǒng)一的栽培管理，并且能夠?qū)崿F(xiàn)較為理想的產(chǎn)量和品質(zhì)，滿足市場需求以及種植戶的期望[3。相反，純度較低的種子可能會導(dǎo)致田間出現(xiàn)雜株，這些雜株在生長習(xí)性、外觀特征等方面與目標(biāo)品種存在差異，不僅會破壞田間植株的整齊度，增加管理難度，還會降低其商品價值。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，對于大白菜種子純度的要求也日益提高。因此，制定一套能夠快速鑒定雜交種的方法，對有效提高種子純度，并且大幅縮短雜交種的檢測周期有著極為重要的意義。

近年來，與傳統(tǒng)的田間種植鑒定方法相比，In-Del分子標(biāo)記技術(shù)不受環(huán)境因素影響，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，而且檢測速度快，可在較短時間內(nèi)完成大量種子樣本的檢測，大大提高了檢測效率。InDel標(biāo)記因等位基因位點插入或缺失短核苷酸序列，產(chǎn)生長度多態(tài)性變異。目前，InDel標(biāo)記已廣泛應(yīng)用到多種農(nóng)作物種子純度鑒定中[5]。方小雪等利用In-Del標(biāo)記鑒定了青梗菜雜交種純度；潘偉芹等對雜交粘稻中的雜株進行了鑒定；杜曉芬等利用InDel標(biāo)記鑒定了優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)谷子雜交種純度；蘇曉梅等[篩選到了3對可用于鑒定櫻桃番茄雜交種純度的InDel引物；方小雪等[]利用InDel標(biāo)記準(zhǔn)確高效鑒定了蘿卜雜交種的種子純度；梁紫越等利用20對InDel分子標(biāo)記對玉米雜交種純度進行了鑒定；王夢夢等[12]從12對InDel引物中，篩選到了1對引物可用于鑒定花椰菜津品70種子純度。在白菜中，馮健起等[13]從28對InDel引物中篩選到1對可用于大白菜品種汴早九號種子純度的鑒定；王祥等[14]利用3個InDe1分子標(biāo)記分別對2個大白菜新品種雜交種純度進行了鑒定。薛銀鴿等[15]從104對In-Del引物中篩選到3對可用于鑒定大白菜品種豫新四號種子純度的引物；劉栓桃等[從20對InDel標(biāo)記中篩選到了8對在雙親間具有多態(tài)性的引物。雖然眾多研究已表明InDel標(biāo)記在多種作物種子純度鑒定中的有效性，但用于鑒定不同品種種子純度的引物具有特異性，而針對新鄉(xiāng)小包23雜交種純度鑒定的研究尚未見報道，且新鄉(xiāng)小包23在市場上存在相似品種，易造成混淆。基于此，筆者以新鄉(xiāng)小包23為對象，開展特異性InDel引物篩選及純度鑒定。

新鄉(xiāng)小包23為新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的生育期70d左右、矮樁疊抱、結(jié)球緊實、品質(zhì)優(yōu)良、高抗干燒心的大白菜品種[7]。繁種一般于9月下旬進行穴盤育苗，10月下旬移栽到大田，進行露地越冬制種。制種田要求四周 2000m 范圍內(nèi)不能種植其他大白菜品種以及小白菜、蕪菁等親緣關(guān)系近的作物，以防止生物學(xué)混雜。該品種在河南、河北、山西、陜西等多地均有種植。2023年冬季持續(xù)低溫，造成部分制種田塊凍害嚴(yán)重，導(dǎo)致父母本比例失調(diào)。收獲后為快速鑒定制種純度，筆者以新鄉(xiāng)小包23為研究試材，篩選雜交種特異性的InDe1引物，從而建立快速鑒定新鄉(xiāng)小包23雜交種純度的方法，保證生產(chǎn)種子純度。

1 材料與方法

1.1材料

本試驗所用材料大白菜新鄉(xiāng)小包23父本和母本分別是1305和陜5201，雜交種為2023年秋季播種、2024年5月收獲的豫北制種基地受凍害影響的親本比例失調(diào)的部分地塊的種子，相似品種新科小包26、新科佳麗、新科佳美與新鄉(xiāng)小包23含有同一母本陜5201，所用材料均為新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主選育。

2024年8月份種植于新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)中心基地，進行穴盤育苗，待長到3葉1心時進行單株編號及取樣。1305和陜5201各取6株，雜交一代新鄉(xiāng)小包23取108株。取健康嫩葉 100mg 左右放于 2.0mL 的離心管中，保存于 -70^°C 超低溫冰箱備用。9月進行大田定植、單株編號和性狀觀測。

1.2 DNA提取和檢測

將樣品放在上海靜信冷凍研磨儀中研磨成粉末狀，采用Solarbio植物基因組DNA試劑盒進行DNA提取并用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，放于 -20^°C 冰箱備用。

1.3 PCR反應(yīng)體系和擴增程序

12對InDel引物序列來源于文獻[11]，引物序列見表1，引物由上海生工生物有限公司合成，對親本1305和陜5201進行PCR擴增篩選特異性引物。PCR體系總體積為 15μL ，包括TakaraPremixTaq酶 7.5μL ， 5μL ，DNA 模板 1μL ， 正、反向引物各 0.75μL 。PCR擴增程序： 95^°C 預(yù)變性 5min，95°C 變性 退火30s，72^°C 延伸 45s ，共32個循環(huán)， 72^°C 延伸 保存。

1.4 電泳檢測

擴增產(chǎn)物用 8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測。電泳條件為 140V，120mA ，時間 60min 。采用硝酸銀顯色法進行染色，使用北京六一膠片觀察燈（WD-9406）拍照記錄。

表112對InDel引物編號及序列

Table1 12 pairs of InDel primers number and sequence

2 結(jié)果與分析

2.1新鄉(xiāng)小包23多態(tài)性引物的篩選

用12對大白菜InDel引物對新鄉(xiāng)小包23的父本、母本、雜交一代的DNA進行PCR擴增，結(jié)果如圖1所示，有3對引物的擴增產(chǎn)物在雙親間具有多態(tài)性，且?guī)头€(wěn)定、易于辨別，在雜交種中表現(xiàn)共顯性，3對引物分別為BrID90039、BrID90105、BrID90137，編號分別為7、8、10。

2.2新鄉(xiāng)小包23與同類型品種的鑒定

用篩選到的新鄉(xiāng)小包23的3對引物對新科小包26、新科佳麗、新科佳美共3個品種的父母本進行鑒定（圖2），結(jié)果表明，引物BrID90039對新科佳麗父母本的擴增結(jié)果與新鄉(xiāng)小包23一致，對新科小包26和新科佳美父母本的擴增結(jié)果與其不一致，說明該引物也可以區(qū)分新科佳麗的父母本。引物 BrID90105 對新科小包26、新科佳麗、新科佳美父母本的擴增結(jié)果與新鄉(xiāng)小包23的擴增結(jié)果均不一致，說明該引物可以將新鄉(xiāng)小包23與新科小包26、新科佳麗、新科佳美區(qū)分開。引物BrID90137對新科佳美父母本的擴增結(jié)果與新鄉(xiāng)小包23的擴增條帶一致，對新科小包26、新科佳麗的擴增條帶與新鄉(xiāng)小包23的不一致，說明該引物還可以區(qū)分新科佳美的父母本，同時可以將新鄉(xiāng)小包23與新科小包26、新科佳麗區(qū)分開，但不能與新科佳美區(qū)分開。以上結(jié)果表明，引物BrID90105可以特異性將新鄉(xiāng)小包23與相似品種新科小包

圖1新鄉(xiāng)小包23親本鑒定多態(tài)性分子標(biāo)記篩選結(jié)果

Fig.1The results of InDel markersscreening intheparents of Xinxiangxiaobao 23

注：X.新鄉(xiāng)小包23；1新科小包26；2.新科佳麗；3.新科佳美。 Note：X.Xinxiangxiaobao23;1.Xinkexiaobao 26;2.Xinkejiali;3.Xinkejiamei.

圖2利用BrID90039（A）、BrID90105（B）、BrID90137（C）引物鑒定同類型大白菜品種的電泳圖譜Fig.2TheelectrophoresispaternsofotherthreeChinesecabbagevarietiesidentifiedwithBrID9oo39（A），BrID90105（B），BrID90137（C）primers

26、新科佳麗、新科佳美區(qū)分開。

2.3新鄉(xiāng)小包23雜一代純度的鑒定

用特異性引物BrID90105對108株新鄉(xiāng)小包23雜交種（ 1305× 陜5201）DNA進行擴增。結(jié)果表明（圖3），在新鄉(xiāng)小包23雜交種中，鑒定出了母本5株（編號2、32、38、66、96），父本2株（編號25、49），新鄉(xiāng)小包23雜交種的雜交率為 93.5% ，田間表型鑒定有6株雜株，純度為 94.4% ，其中分子鑒定為母本（編號38）的植株，田間表型鑒定為雜交種，其他植株的檢測結(jié)果與分子鑒定結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，種子是整個農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈中最前端也是極為重要的一環(huán)。優(yōu)質(zhì)的種子是獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的關(guān)鍵前提。而種子純度是衡量種子品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，對保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物繁育以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展都至關(guān)重要。鑒定種子純度的方法主要有田間種植鑒定法和DNA分子標(biāo)記鑒定法，田間種植鑒定法優(yōu)點是最接近種子實際生長表現(xiàn)，結(jié)果直觀可靠，能綜合考察多個農(nóng)藝性狀，是一種被廣泛認可的鑒定方法。缺點是鑒定周期長，往往需要經(jīng)歷一個完整的生長季節(jié)，耗時費力，并且受環(huán)境因素如氣候、土壤等影響較大。而利用分子標(biāo)記可在苗期進行種子純度檢測，多態(tài)性高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高。

分子標(biāo)記作為一種常用的遺傳標(biāo)記，在櫻桃番茄[、黃瓜[18]、南瓜[9等眾多蔬菜作物品種鑒定研究中被廣泛應(yīng)用。在本研究中，與馮健起等[3]、王祥等[14]、薛銀鴿等[15]一樣，均采用InDe1標(biāo)記，而唐昊等[20]采用的是KASP標(biāo)記，管志坤等[21]、劉小愿等[2、Zhang等[23采用的是SSR標(biāo)記。筆者從12對InDel引物中篩選出3對能夠快速區(qū)分新鄉(xiāng)小包23雜種一代與父母本，這3對引物對新鄉(xiāng)小包23的雜交育種工作具有重要意義。

開展同類型品種種子鑒定研究，能有效防正品種混雜，保障種子純度，維護市場秩序，讓農(nóng)民免受假種子侵害。與劉小愿等22的研究相似，用新鄉(xiāng)小包23的3對特異擴增引物對同類型的其他3個品種進行了鑒定，結(jié)果表明，其中1對引物BrID90105展現(xiàn)出了良好的特異性，能夠?qū)⑿锣l(xiāng)小包23與新科小包26、新科佳麗、新科佳美3個品種明確區(qū)分開，有效避免了新鄉(xiāng)小包23與其他同類型品種混淆而導(dǎo)致的種子質(zhì)量問題，保障種子的真實性。但只對3個相似品種新科小包26、新科佳麗、新科佳美進行了鑒定，對于市場上眾多可能與新鄉(xiāng)小包23混淆的大白菜品種而言，覆蓋范圍較窄。

InDel分子標(biāo)記已在青梗菜[24]、烏菜[2]、花椰菜[]、甘藍[2等十字花科作物中用于種子純度鑒定，筆者從12對InDe1引物中篩選出1對具有明顯共顯性分離的引物，對新鄉(xiāng)小包23的108株單株In-Del分子純度檢測結(jié)果比田間鑒定結(jié)果稍低，這與何鳥飛等對春油菜、馮健起等對汴早九號大白菜的研究結(jié)果相似，而劉小愿22對定陜秋白2號大白菜、方小雪等對典湖1號青梗菜的研究中分子純度檢測結(jié)果和田間鑒定結(jié)果一致。分子鑒定和田間鑒定結(jié)果不一致可能是因為田間鑒定結(jié)果易受環(huán)境條件影響，如土壤肥力、氣候、病蟲害等，這些因素可能導(dǎo)致植株性狀表現(xiàn)不穩(wěn)定，使一些性狀不能正常表達，從而與不受環(huán)境干擾的分子鑒定結(jié)果產(chǎn)生差異。

筆者從12對大白菜InDe1引物中，篩選出3對在新鄉(xiāng)小包23雜交種及其親本間呈共顯性的引物。其中，BrID90105引物能有效區(qū)分新鄉(xiāng)小包23與3個相似品種，對108株雜交1代純度鑒定為93.5% 。以上結(jié)果表明該引物可用于新鄉(xiāng)小包23種子純度鑒定，能夠縮短鑒定周期、提高效率。

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