基于RT RAA的蘋果壞死花葉病毒快速檢測方法的建立

摘要

蘋果是我國重要的園藝作物，具有較高的經(jīng)濟(jì)地位。病毒是引起蘋果病害的重要因素，蘋果壞死花葉病毒（apple necrotic mosaic virus， ApNMV）是引起蘋果壞死和花葉癥狀的病原之一。為了有效預(yù)防ApNMV的侵染，本研究基于反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增（reverse transcriptionrecombinase aided amplification， RTRAA）技術(shù)，建立ApNMV的快速檢測方法。根據(jù)ApNMV外殼蛋白編碼基因的保守序列設(shè)計4對RAA引物，篩選最佳引物序列，并進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化。結(jié)果表明，RAA的最佳反應(yīng)條件為：引物終濃度0.8 μmol/L，反應(yīng)溫度42℃，反應(yīng)時間20 min。該方法能夠特異性檢測ApNMV。對攜帶ApNMV樣品的RNA進(jìn)行檢測，RTRAA檢測體系的檢測極限為5 pg/μL，普通RTPCR檢測體系的檢測極限為50 pg/μL，RTRAA檢測體系靈敏度是普通RTPCR體系的10倍。該檢測方法具有快速、簡便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞

蘋果壞死花葉病毒（ApNMV）; 反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增; 快速檢測

中圖分類號：

S 436.611.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024499

Establishment of a rapid detection method for apple necrotic mosaic virus based on RTRAA

HOU Yumeng1，2， ZHAO Zhenxing2， WANG Siyuan2， DONG Zheng2， HU Zhongze3，ZHOU Tao1*， ZHANG Yongjiang2*

（1. College of Plant Protection， China Agricultural University， Beijing 100193， China; 2. Chinese Academy of

Inspection and Quarantine， Beijing 100176， China; 3. Taizhou Institute of Agricultural Science， Jiangsu

Academy of Agricultural Sciences， Taizhou 225300， China）

Abstract

Apple is an important horticultural crop in China with high economic value. Viruses are among the primary pathogens affecting apple production， with apple necrotic mosaic virus （ApNMV） known to cause necrosis and mosaic symptoms. In order to effectively prevent the infection of ApNMV， a diagnostic method based on reverse transcriptionrecombinase aided amplification （RTRAA） was developed in this study. Four pairs of RAA primers targeting the conserved regions of the ApNMV coat protein gene were designed， and the optimal pair was selected for further assay optimization. The final RTRAA reaction conditions were set at a primer concentration of 0.8 μmol/L， a reaction temperature of 42℃ and a reaction time of 20 min. The assay showed high specificity for ApNMV， with a detection limit of of 5 pg/μL， compared to 50 pg/μL for conventional RTPCR. Thus， the RTRAA assay was approximately 10 times more sensitive than traditional RTPCR. This method offers a rapid， simple， and highly sensitive approach for ApNMV detection， and holds promise for field diagnosis and quarantine applications.

Key words

apple necrotic mosaic virus （ApNMV）; reverse transcriptionrecombinase aided amplification; rapid detection

蘋果是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其耐貯性好，供應(yīng)周期長，深受大眾喜愛，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值［12］。我國是蘋果生產(chǎn)大國，無論是種植面積還是產(chǎn)量均居世界首位。病毒病是導(dǎo)致蘋果產(chǎn)量損失的重要因素之一［3］。病毒和類病毒侵染蘋果，導(dǎo)致蘋果產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益下降，限制了蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，嚴(yán)重影響農(nóng)民的收入。

蘋果花葉病是蘋果樹上常見的病害之一，于19世紀(jì)30年代在歐洲首次報道。發(fā)病后蘋果葉片會出現(xiàn)白色或黃色的斑塊、組織壞死、葉綠素含量和光合速率下降、果實減產(chǎn)等癥狀，嚴(yán)重時會出現(xiàn)大片條紋狀或不規(guī)則狀病斑，部分葉片壞死，嚴(yán)重影響蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［47］。我國蘋果花葉病的病原曾被認(rèn)為是蘋果花葉病毒（apple mosaic virus， ApMV）［7］。2017年，日本在從中國引種的具有花葉和壞死癥狀的蘋果樹中，通過高通量測序技術(shù)分離鑒定出一種新病毒，即蘋果壞死花葉病毒（apple necrotic mosaic virus， ApNMV），后在韓國和印度的蘋果樹中也發(fā)現(xiàn)了該病毒［79］，該病毒被認(rèn)為是我國蘋果花葉病的主要病原，而非ApMV［10］。ApNMV是雀麥花葉病毒科Bromoviridae等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬Ilarvirus成員［11］，為三分體病毒。其基因組由3條單鏈RNA組成，包括RNA1、RNA2和RNA3，RNA1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的酶蛋白，RNA2編碼RNA聚合酶，RNA3編碼運(yùn)動蛋白（movement protein， MP）和外殼蛋白（coat protein， CP）［7］。ApNMV主要侵染蘋果，除此之外，在沙果、海紅果和山楂中也發(fā)現(xiàn)該病毒［1214］，傳播方式主要為嫁接傳播［15］。研究表明，ApNMV可以與多種病毒復(fù)合侵染，其中3種隱性病毒：蘋果莖溝病毒（apple stem grooving virus， ASGV）、蘋果莖痘病毒（apple stem pitting virus， ASPV）和蘋果褪綠葉斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus， ACLSV）在單獨(dú)侵染蘋果后不表現(xiàn)明顯癥狀，與ApNMV復(fù)合侵染后會降低植株長勢，造成質(zhì)量產(chǎn)量下降［13］，大大降低蘋果樹對病原物的抵抗力。

目前，檢測ApNMV的方法主要有RTPCR（reverse transcriptionpolymerase chain reaction）、實時定量PCR（quantitative realtime PCR， qPCR）、酶聯(lián)免疫吸附分析（enzymelinked immunosorbent assay， ELISA）技術(shù)等［34，16］。常見的PCR、RTPCR檢測技術(shù)等已被廣泛使用，雖具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但仍有很多局限性：不僅需要昂貴的儀器、嚴(yán)格的溫度把控，還需要較長的擴(kuò)增時間，耗時費(fèi)力，操作人員還需經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練，不適用于現(xiàn)場檢測。重組酶介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增（recombinase aided amplification， RAA）技術(shù)是一種在恒溫條件下指數(shù)擴(kuò)增目的片段的檢測方法［1718］，相比于其他檢測技術(shù)，

反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增（reverse transcriptionrecombinase aided amplification， RTRAA）技術(shù)

不需要精密儀器、對溫度和反應(yīng)時間要求低、操作簡單，具有高效、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于多種病原物的檢測。RTRAA體系主要包括重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶等，其試劑主要以凍干形式存在，在成本、試劑穩(wěn)定性、便攜性等方面具有明顯優(yōu)勢，為病毒檢測提供了良好的保障。

目前有關(guān)ApNMV的檢測研究較少，因此本研究旨在建立一種快速、簡便、靈敏度高的RTRAA核酸檢測方法，以便用于ApNMV的檢測和預(yù)防。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所使用的感染ApNMV的蘋果陽性樣品采自甘肅省白銀市靖遠(yuǎn)縣大蘆鎮(zhèn)小蘆村五營社（104°42′E， 36°27′N），ASGV、ASPV的梨陽性樣品由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)王國平教授實驗室惠贈，ApMV和李屬壞死環(huán)斑病毒（prunus necrotic ringspot virus， PNRSV）陽性蘋果樣品由本實驗室保存。

1.2 核酸提取

取適量陽性樣品和健康蘋果的葉片于不同離心管中，將離心管放入液氮中速凍并研磨成粉末狀，按照天根RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設(shè)計

根據(jù)NCBI中編碼ApNMV外殼蛋白（coat protein， CP）的基因序列，設(shè)計4對RAA引物，使用NCBI網(wǎng)站PrimerBLAST（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/）對設(shè)計的RAA引物進(jìn)行特異性驗證，具體信息見表1。引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

1.4 RTPCR反應(yīng)

參考全式金TransScriptII OneStep RTPCR SuperMix試劑盒說明書，以ApNMV陽性樣品的RNA為模板，使用特異性引物ApNMV640F/R，對模板進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為640 bp。反應(yīng)體系（20 μL）：10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，Taq酶0.4 μL，Mix混合液10 μL，模板4 μL，無酶水4.8 μL。反應(yīng)程序為45℃反轉(zhuǎn)錄30 min;94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s， 35個循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 RTRAA反應(yīng)

參考RNA恒溫擴(kuò)增試劑盒（安普未來生物科技有限公司，WLRB8207KIT）說明書，以ApNMV陽性樣品的RNA為模板，使用RAA引物進(jìn)行恒溫擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL，向凍干粉酶管中加入29.4 μL A buffer、2 μL上、下游引物（10 μmol/L）、12.1 μL無酶水，蓋上蓋子后振蕩直至凍干酶粉溶解，再加入2 μL模板， 2.5 μL B buffer后振蕩離心混勻，隨后放入42℃恒溫反應(yīng)儀中反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50 μL的Tris飽和酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）進(jìn)行純化，12 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 RTRAA體系優(yōu)化

RAA引物的篩選：按1.5方法對設(shè)計的4對引物進(jìn)行RTRAA恒溫擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察試驗結(jié)果，選擇效果最好的RAA引物。RAA引物濃度的優(yōu)化：將引物ApNMVRAA3F/3R終濃度設(shè)置5個梯度，分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L，在42℃恒溫條件下反應(yīng)20 min，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并觀察試驗結(jié)果。RTRAA溫度優(yōu)化：分別設(shè)置RTRAA體系的反應(yīng)溫度為36、38、40、42、44℃，反應(yīng)時間設(shè)置為20 min，引物濃度設(shè)置0.8 μmol/L，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察試驗結(jié)果。優(yōu)化RTRAA反應(yīng)時間：為獲得最佳RTRAA反應(yīng)時間，分別設(shè)置RTRAA反應(yīng)時間為5、10、15、20、25 min，引物設(shè)置為0.8 μmol/L，溫度為42℃進(jìn)行恒溫擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察試驗結(jié)果。

1.7 RTRAA檢測方法的靈敏度和特異性分析

以ApNMV陽性樣品RNA為模板，用無酶水將模板分別稀釋100～108倍，分別進(jìn)行RTRAA和RTPCR擴(kuò)增，分別確定其靈敏度。

分別以ApNMV、ASGV、ASPV、ApMV、PNRSV、馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（potato spindle tuber viroid， PSTVd）陽性樣品RNA為模板，用優(yōu)化好的RTRAA體系進(jìn)行恒溫擴(kuò)增，確定該檢測體系是否對ApNMV具有特異性。

1.8 實際樣品檢測

在北京、天津、遼寧采集18份疑似蘋果壞死花葉病毒癥狀的蘋果葉片樣品，分別提取這些樣品的總RNA，對其進(jìn)行ApNMV RTRAA檢測和RTPCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RTRAA引物的篩選

為建立最佳RTRAA檢測體系，設(shè)計4對RAA引物，結(jié)果顯示（圖1），4對RAA引物均能從ApNMV中擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，其中引物ApNMVRAA3F/3R的條帶最亮且穩(wěn)定，因此選擇引物ApNMVRAA3F/3R為后續(xù)的RAA引物組合。

2.2 RTRAA體系優(yōu)化

為獲得最佳的RTRAA反應(yīng)條件，對引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示（圖2a），當(dāng)引物濃度為0.4 μmol/L時即可出現(xiàn)條帶，隨著引物濃度增加，條帶亮度逐漸增強(qiáng);當(dāng)引物濃度為0.8 μmol/L時，條帶最亮，且條帶亮度不再隨著引物濃度增加而改變。因此選擇引物濃度0.8 μmol/L進(jìn)行后續(xù)試驗。

RTRAA反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示（圖2b），反應(yīng)5 min時即可現(xiàn)條帶，隨著反應(yīng)時間增加，條帶亮度增強(qiáng);反應(yīng)20 min時，條帶最亮;反應(yīng)時間超過20 min時，條帶亮度不變。因此選擇反應(yīng)時間20 min進(jìn)行后續(xù)試驗。

對RTRAA反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示（圖2c），反應(yīng)溫度為38℃時即可出現(xiàn)明顯條帶，隨著反應(yīng)溫度增加，條帶亮度增強(qiáng);當(dāng)反應(yīng)溫度為42℃時，條帶亮度最強(qiáng);當(dāng)反應(yīng)溫度為44℃時，條帶亮度減弱，擴(kuò)增效率降低。綜合考慮選擇RTRAA反應(yīng)溫度42℃進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3 RTRAA檢測體系的特異性分析

為了檢測RTRAA體系的特異性，使用RAA引物ApNMVRAA3F/3R分別對攜帶ApNMV、ASGV、ASPV、ApMV、PNRSV的陽性樣品RNA進(jìn)行RTRAA恒溫擴(kuò)增，結(jié)果顯示（圖3），攜帶ApNMV的樣品RNA檢測出現(xiàn)特異性條帶，其他4種病毒樣品RNA及陰性對照均未擴(kuò)增出現(xiàn)條帶，說明本研究設(shè)計的RAA引物對ApNMV具有特異性，該檢測體系的特異性較好。

2.4 RTRAA檢測體系的靈敏度分析

以ApNMV陽性樣品RNA為模板，用ddH2O以10倍梯度分別將ApNMV的RNA稀釋為50 ng/μL、5 ng/μL、500 pg/μL、50 pg/μL、5 pg/μL、500 fg/μL、50 fg/μL、5 fg/μL、500 ag/μL，分別進(jìn)行RTRAA恒溫擴(kuò)增和RTPCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示（圖4），本研究所建立的RTRAA檢測體系的檢測極限為5 pg/μL，普通RTPCR檢測體系的檢測極限為50 pg/μL，RTRAA檢測體系靈敏度比普通RTPCR檢測體系的靈敏度高10倍。

2.5 ApNMV實際樣品檢測

18份疑似蘋果壞死花葉病毒癥狀的蘋果葉片樣品分別采自北京、天津、遼寧3個不同地區(qū)，分別對其總RNA進(jìn)行RTPCR、RTRAA檢測。RTPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)8份陽性樣品，而RTRAA方法中有11份陽性樣品（表2）。3、4、10編號樣品僅在RTRAA方法中被檢出，說明其中病毒含量相對較低，超出RTPCR方法的檢測極限。由此可看出，RTRAA檢測方法靈敏度高于RTPCR。

3 結(jié)論與討論

蘋果是我國的一種重要經(jīng)濟(jì)作物，深受大眾喜愛。目前，不少果園受病毒危害嚴(yán)重。蘋果壞死花葉病是常見的病毒病之一，ApMV、PNRSV、ApNMV均與我國蘋果花葉病密切相關(guān)［4， 7，1920］。因此，開發(fā)一種快速、便捷病毒檢測方法尤為重要。

RAA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后可通過瓊脂糖凝膠電泳來觀察擴(kuò)增結(jié)果，也可結(jié)合熒光法、側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l等方法進(jìn)行分析。若結(jié)合熒光法，在10～20 min內(nèi)即可通過實時熒光檢測器觀察擴(kuò)增結(jié)果;若結(jié)合試紙條法，在插入試紙條后2～3 min內(nèi)即可分析檢測結(jié)果。2020年，重組酶恒溫擴(kuò)增技術(shù)曾與CRISPR/Cas12a（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas protein 12a）體系相結(jié)合，并通過實時熒光檢測和可視化檢測顯示結(jié)果，建立了一種可以特異性檢測ApNMV的方法［21］。該檢測方法比RTRAA靈敏度更高，操作簡單，其最大的優(yōu)點(diǎn)是對環(huán)境的要求低，不需進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳即可檢測出相應(yīng)結(jié)果，適用于田間以及現(xiàn)場檢測。但是，該種檢測方法靈敏度和特異性較高，但無法達(dá)到恒溫擴(kuò)增的最大效率。本研究優(yōu)化了恒溫擴(kuò)增的條件，引物濃度、反應(yīng)時間和溫度均達(dá)到最優(yōu)，有效節(jié)約了試劑成本和時間成本，同時使指數(shù)擴(kuò)增達(dá)到了最高效率。在本研究中，設(shè)計的4對RAA引物均能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，選擇條帶最亮且最穩(wěn)定的一對進(jìn)一步進(jìn)行引物濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度的優(yōu)化，結(jié)果顯示，當(dāng)RAA引物濃度為0.8 μmol/L時擴(kuò)增效率最高;RTRAA反應(yīng)時間在20 min時擴(kuò)增效果最好;RTRAA反應(yīng)溫度為42℃時條帶最亮。優(yōu)化完成的RTRAA體系可以特異性檢測到ApNMV，靈敏度高于RTPCR。該檢測技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，非常符合現(xiàn)場快速檢測技術(shù)的要求。本研究為我國蘋果壞死花葉病毒的檢測和診斷等提供了新思路，對我國蘋果壞死花葉病毒的防控有重要意義。

下一步可嘗試將RTRAA試劑和CRISPR/Cas12a試劑集于同一個離心管中，避免試驗中開蓋環(huán)節(jié)，以有效避免交叉污染問題;除此之外還可以考慮將RTRAA檢測技術(shù)與側(cè)向流動試紙條（lateral flow dipstick， LFD）相結(jié)合，該檢測方法耗時短、操作簡單、不需要復(fù)雜的精密儀器，從樣品制備到檢測出相應(yīng)結(jié)果僅需1 h，檢測結(jié)果直觀，應(yīng)用前景廣泛。

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（責(zé)任編輯：張 雪）