蕪菁花葉病毒廣西大化菜心分離物全基因組序列特征分析

摘要

為明確引起廣西大化菜心表現(xiàn)花葉斑駁癥狀的病毒病原，從廣西大化采集4個表現(xiàn)典型癥狀的菜心樣品，采用反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RTPCR）、DNA分段克隆、cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA ends，RACE）和遺傳進化樹構建等方法對樣品進行了檢測鑒定、全基因組序列克隆和遺傳進化分析。結果顯示，利用馬鈴薯Y病毒屬通用簡并引物從4個菜心樣品中均能擴增出目的片段，將所得PCR產(chǎn)物克隆并測序，所得序列與NCBI中報道的蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV）分離物具有較高的核苷酸相似性，結果初步證實所采集的菜心樣品感染了TuMV;利用7對特異引物和5′/3′RACE引物對TuMV廣西菜心分離物的全基因序列進行分段克隆、測序，最終獲得一條大小為9 834 nt的全長基因組序列。BLAST分析發(fā)現(xiàn)，該序列與TuMV其他分離物的基因組序列一致性為77.84%～96.06%，其中與中國云南安寧分離物TuMV_CHN229（登錄號：LC537500.1）的一致性最高（96.06%），依據(jù)上述結果將該分離物命名為TuMV_GXdh1（GenBank登錄號：PP079014）。遺傳進化分析結果顯示，TuMV_GXdh1與中國北京、山東、廣東、臺灣等分離物以及美國、日本等14 個分離物聚集在一個大分支上，分屬于worldB組，其中與中國云南安寧分離物和浙江杭州分離物（TuMV_CHZH33A，GenBank登錄號：LC537526.1）聚集在一個小分支，親緣關系最近。綜上，本研究首次獲得TuMV廣西分離物的全基因序列，并對其遺傳進化等進行了分析。

關鍵詞

廣西; 菜心; 蕪菁花葉病毒; 全基因組序列; worldB組

中圖分類號：

S 432.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024472

Complete genome sequence analysis of turnip mosaic virus isolate from Brassica rapa var. chinensis in Dahua， Guangxi，China

MO Cuiping1， CHEN Jinqing1， LI Youcong1，2， XIE Huiting1， QIN Bixia1， CUI Lixian1，LI Feifei4， TANG Yafei3， CAI Jianhe1*， LI Zhanbiao1*

（1. Plant Protection Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory of Green

Prevention and Control on Fruits and Vegetables in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Key

Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests of Guangxi， Nanning 530007， China; 2. College of

Agriculture，Guangxi University， Nanning 530004， China; 3. Institute of Plant Protection， Guangdong Academy

of Agricultural Sciences， Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection，

Guangzhou 510640， China; 4. Guangxi Vocational University of Agriculture， Nanning 530007， China）

Abstract

To determine the viral pathogen responsible for mosaic and mottling symptoms observed on Brassica rapa var. chinensis in Dahua， Guangxi， China， four samples with typical symptoms were collected for molecular analysis. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction （RTPCR）， DNA fragment cloning， rapid amplification of cDNA ends （RACE） and phylogenetic analysis were performed. Using universal degenerate primers targeting Potyvirus species， PCR amplification yielded expected products from all four samples. Subsequent cloning and sequencing revealed high nucleotide identity with turnip mosaic virus （TuMV）， confirming infection by TuMV. Fulllength genome sequencing of a representative isolate was achieved using seven specific primer pairs along with 5′ and 3′ RACE primers. The complete genome was 9 834 nucleotides in length. BLAST analysis showed that the sequence shared 77.8%-96.06% nucleotide identity with other TuMV isolates in GenBank， with the highest similarity （96.06%） to isolate TuMV_CHN229 from Anning， Yunnan （GenBank accession： LC537500.1）. This isolate was designated TuMV_GXdh1 （GenBank accession： PP079014）. Phylogenetic analysis based on the complete genome showed that TuMV_GXdh1 clustered within the worldB group， forming a subgroup with the Yunnan TuMV_CHN229 and Zhejiang TuMV_CHZH33A isolates （GenBank accession： LC537526.1）， indicating a close evolutionary relationship. This study represents the first report of a full genome sequence of TuMV from Guangxi， providing new insights into its molecular characteristics and phylogenetic placement.

Key words

Guangxi; Brassica rapa var. chinensis; turnip mosaic virus; complete genome; worldB group

蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV）是隸屬于馬鈴薯 Y 病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus的一種正單鏈RNA病毒，基因組全長約10 kb。包含 2個開放閱讀框（open reading frame，ORF），大的ORF編碼 1個約360 kD的多聚蛋白，多聚蛋白會被TuMV自身編碼的蛋白酶剪切為10個成熟的蛋白，分別是P1蛋白（first protein）、HCPro蛋白（helper componentprotease）、P3蛋白（third protein）、6K1蛋白（6 kD peptide 1）、圓柱狀內含體蛋白（cylindrical inclusion protein）、6K2蛋白（6 kD peptide 2）、

VPg蛋白（viral protein genomelinked）、NIaPro蛋白（nuclear inclusion aprotease）、NIb蛋白（nuclear inclusion b）

和外殼蛋白（coat protein）;小的ORF被稱作有趣的馬鈴薯Y病毒ORF（pretty interesting Potyviridae ORF，PIPO），PIPO通過G1-2A6-7保守結構域嵌合在P3基因中，通過核糖體移框或轉錄滑移在P3順反子內部轉錄為P3NPIPO，是馬鈴薯Y病毒所有蛋白中唯一僅參與運動的蛋白; 5′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）共價結合病毒基因組連接蛋白VPg，3′UTR為長度不定的多聚腺苷酸（polyA）結構［15］。TuMV是馬鈴薯Y病毒科中寄主范圍最廣、危害最大的病毒，至少能侵染43科156屬300多種植物，其中主要以十字花科蔬菜作物為主。自然條件下，TuMV主要經(jīng)蚜蟲以非持久方式傳播，也可通過病株汁液和機械接觸等方式傳播，但不經(jīng)種子傳播［67］。TuMV基因組極易發(fā)生變異，且具有多種變異類型，根據(jù)其基因組系統(tǒng)進化關系，可將其劃分為basalBrassica（basalB）、basalBrassica/Raphanus（basalBR）、Asian Brassica/Raphanus（AsianBR）、worldBrassica（worldB）、Iranian和Orchis 等6個組［7］。目前，TuMV在我國大部分地區(qū)有分布，已成為危害十字花科蔬菜的優(yōu)勢病毒，在中國已報道的變異類型有AsianBR、basalBR和worldB［810］。

廣西氣候溫潤，冬季積溫充足，適宜蔬菜類作物種植，已成為我國重要的“南菜北運”“西菜東運”和全國最大的秋冬菜基地。菜心Brassica rapa var. chinensis是廣西秋冬季種植的重要十字花科蔬菜作物。2022 年10月，廣西大化縣葉菜種植區(qū)的菜心表現(xiàn)皺縮、花葉、斑駁等癥狀，個別區(qū)域發(fā)病率高達20%以上。為明確其病毒病原，采集了部分菜心樣品，采用分子生物學方法對樣品進行了檢測及病毒基因組序列特征分析，研究結果將為解析廣西菜心病毒病發(fā)生流行規(guī)律及綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2022年10月，廣西壯族自治區(qū)大化縣葉菜種植區(qū)部分菜心呈現(xiàn)花葉、斑駁、皺縮等疑似病毒侵染的癥狀（圖1）。采集疑似感染病毒的菜心樣品4個。

to be infected by TuMV

1.2 感病菜心樣品的病原鑒定

稱取100 mg菜心病葉，參照RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP432H）操作說明提取病葉總RNA，沉淀溶解于50 μL RNasefree水［生工生物工程（上海）股份有限公司］中保存?zhèn)溆谩?/p>

以本實驗室自行設計的馬鈴薯Y病毒屬簡并引物

PotyF（5′GCAATGATTGARGCWTGGGG3′）/PotyR（5′TTTGTTCTTCTCCRTCCATCAT3′）。

對疑似感病的菜心樣品進行RTPCR擴增，以健康菜心葉片總RNA作為陰性對照。RTPCR體系（25 μL）：總RNA 1 μL，2×One Step Mix（Dye Plus） 12.5 μL，One Step Enzyme Mix 1 μL，上、下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），DEPC H2O 14.5 μL。RTPCR反應程序：50℃ 30 min，95℃ 5 min;95℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 30 s，35個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Thermo公司）純化后連接至pEASYBBlunt Zero Cloning Vector （北京全式金生物技術有限公司），將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑選PCR檢測為陽性的3個克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

1.3 蕪菁花葉病毒廣西菜心分離物全基因序列擴增

參考PotyF/PotyR擴增序列的比對結果，選取相似性較高的TuMV_CHN229（GenBank登錄號：LC537500.1）和TuMV_CHZH33A（GenBank登錄號：LC537526.1）基因組序列設計7對引物：TuMV1F

（5′GCAGTGCAGATACTAGATAGGTAC3′）/1R

（5′CAATA

TTGCATTTAGCTTGTTGACG3′）、TuMV2F（5′

GCAGTGCAGATACTAGATAGGTAC3′）/2R（5′

AATTCGTTCCATGCTTCGTCCAAG3′）、TuMV

3F（5′AGCTTCTCGCGCATGTAACAGATT3′）/

3R（5′AAAGCGCGTCTACCTCATTGTAGC3′）、

TuMV4F（5′TATCAAAG

TTTCAGCCACACCACC3′）/4R（5′TCCGATAC

CACGTGTCCTACCCTT3′）、TuMV5F（5′TGGTTATTCAACACTTGCGGTCAA3′）/5R（5′GA

TATTTCCTGCTTCGATTGGCGT3′）、TuMV6F（5′ATAGCACACTGCCCTAGCCAAC3′）/6R（5′GCCTTTCTTGAGTGCCAACTGCTT3′）、TuMV7F（5′TTGCGCGACAGCATCATCAAATTC3′）/7R（5′TGTCCCTTGCATCCTATCAAATGT3′）;同時設計用于5′/3′ RACE擴增的4條引物：TuMV5′R1（5′AAGTCGCGCTGTGCTCTCTTC3′），TuMV5′R2（5′CGTCCGTTCTTTTCTGATGA

AATC3′）;TuMV3′F1（5′GAAGCAGTTGGCA

CTCAAGAAAGGC3′）、TuMV3′F2（5′GAAGGTGTAATGGCTGATTACG3′）。利用上述引物克隆TuMV的全長基因組序列，引物委托生工生物工程（上海）有限公司合成。

取3 μL菜心葉片總RNA作為模板，利用反轉錄試劑盒反轉合成cDNA，然后利用上述7對特異引物，分段擴增TuMV的全長基因組序列，25 μL體系：10倍比稀釋的cDNA 1 μL，10×LA PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL， LA Taq酶0.2 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 17.3 μL。反應程序：95℃預變性5 min;95℃變性45 s，52℃ 30 s，72℃ 90 s，35個循環(huán);72℃延伸5 min。5′/3′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）擴增參照5′/3′RACE試劑盒操作說明，利用5′/3′ adaptor引物合成cDNA，然后利用5′/3′RACE outer和TuMV5′R1/TuMV5′R2，TuMV3′F1/TuMV3′F2分別進行兩輪PCR。第一輪PCR：Taq superMix 13.5 μL，cDNA 0.5 μL，5′（或3′）RACE outer 0.5 μL，TuMV5′R1（或TuMV3′F1）0.5 μL，RNasefree水5 μL;反應程序：94℃預變性60 s;94℃變性30 s，70℃ 30 s（前10個循環(huán)為降落PCR，每個循環(huán)降1℃）降至60℃程序為60℃ 30 s 繼續(xù)執(zhí)行25個循環(huán);72℃ 60 s，最后72℃繼續(xù)延伸8 min。第二輪PCR：Taq superMix 13.5 μL，cDNA 0.5 μL，5′（或3′）RACE inner 0.5 μL，TuMV5′R2（或TuMV3′F2）0.5 μL，RNasefree H2O 5 μL。反應程序：94℃預變性60 s；94℃變性30 s，70℃ 30 s（前10個循環(huán)為降落PCR，每個循環(huán)降1℃）降至60℃程序為60℃ 30 s 繼續(xù)執(zhí)行25個循環(huán)，72℃ 60 s；最后72℃繼續(xù)延伸8 min。所得PCR產(chǎn)物均經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 蕪菁花葉病毒廣西菜心分離物全基因序列分析

將1.3所得的PCR產(chǎn)物采用膠回收試劑盒純化，純化后的產(chǎn)物克隆至pMDT載體轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，每個產(chǎn)物均挑選3個檢測為陽性的菌落委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。利用DNASTAR軟件（DNASTAR Inc，Madison，USA）的SeqMan對所獲得的基因序列進行拼接，使用NCBI的ORF finder進行開放閱讀框的預測，利用GenBank中BLASTn程序進行序列相似性比對，進一步用 DNASTAR的MegAlign進行核苷酸和氨基酸序列比較分析;利用RDP v 4.71中的7種方法（RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimarea、SiScan和3Seq）推測本研究所得分離物可能的重組事件［11］，推定的重組事件的概率通過Bonferroni程序校正，設置P小于0.001。采用MEGA 5.0通過鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap值為1 000。

2 結果與分析

2.1 廣西菜心的蕪菁花葉病毒PCR檢測

利用PotyF/PotyR引物對4個疑似染病的菜心樣品進行PCR擴增，以實驗室保存的感染夜來香花葉病毒（Telosma mosaic virus）的西番蓮樣品作為陽性對照，健康的菜心樣品作為陰性對照。結果顯示，4個樣品中均能擴增出與西番蓮樣品同樣大小的目的PCR條帶，陰性樣品無擴增（圖2），說明樣品中含有馬鈴薯Y病毒屬病毒。將所得PCR產(chǎn)物克隆測序并進行BLASTn分析發(fā)現(xiàn)，所得序列與TuMV各分離物具有較高的核苷酸相似性，最高可達96.06%，結果初步證實所采集的菜心樣品感染TuMV。

2.2 TuMV_GXdh1分離物的全基因序列擴增及序列分析

選取一個陽性菜心樣品利用7對特異引物和5′/3′RACE分別擴增，所得產(chǎn)物經(jīng)經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果可見，從疑似感病菜心中均能擴增出目的PCR產(chǎn)物條帶（圖3）。將各PCR產(chǎn)物純化、克隆后進行測序，測序獲得的所有序列進行拼接，獲得全長為9 834 nt 的TuMV全基因組序列，命名為TuMV_GXdh1，GenBank登錄號為PP079014。TuMV_GXdh1包含一個長為9 495 nt 的大開放閱讀框（130-9 426 nt），編碼1個3 165 aa的多聚蛋白。該多聚蛋白在自身蛋白酶的作用下，被水解成 P1蛋白（130-1 215 nt）、HCPro蛋白（1 216-2 589 nt）、P3蛋白（2 590-3 654 nt）、6K1蛋白（3 655-3 810 nt）、圓柱狀內含體蛋白（3 811-5 742）、6K2蛋白（5 743-5 901 nt）、NIa蛋白［由VPg（5 902-6 477 nt）和NIaPro （6 478-7 206 nt）兩個蛋白組成］、 NIb蛋白（7 207-8 757 nt）和外殼蛋白（8 758-9 624 nt）;小開放閱讀框則是通過移碼翻譯在P3順反子中表達一個短多肽（PIPO）;5′UTR為129 nt（1-129 nt），3′UTR為210 nt（9 625-9 834 nt），末端含有 poly （A）尾。

BLAST分析發(fā)現(xiàn)該序列與GenBank登錄的各TuMV 分離物的核苷酸序列相似性在77.84%～96.06%之間，分別將TuMV_GXdh1編碼的 10 個蛋白與已報道的分屬于worldB、AsianBR、basalB、basalBR、Iranian和Orchis的分離物TuMV_CHN229、TuMV_NDJ、TuMV_WFLB06、TuMV_ITA2、TuMV_IRNST、TuMV_OS的基因組全長進行相似性比較，結果表明，TuMV_GXdh1與6個分離物的全基因組序列相似性分別為 96.06%、87.46%、84.21%、82%、81.86%、77.84%;其中與worldB組的中國云南安寧分離物TuMV_CHN229（LC537500.1）的相似性最高，其核苷酸相似性達到96.06%，氨基酸相似性達98.29%。而與Orchis組的TuMV_OS（AB701693.1）的相似性最低，其核苷酸相似性為77.84%，氨基酸相似性為87.52%。其中變異最為明顯的為P3蛋白，除此之外，本研究中的TuMV_GXdh1的編碼蛋白NIaPro、NIb、CP與其他4個不同組的分離物的核苷酸序列的相似性高低不同，但其氨基酸的相似性均在90%以上，說明TuMV不同株系的突變大多為同義突變（表1）。

2.3 TuMVGXdh1遺傳進化和基因重組分析

為了明確TuMV_GXdh1分離物的遺傳進化關系，構建TuMV_GXdh1和GenBank登錄的不同組別的TuMV全基因組序列的進化樹，PVY_GXnd1（GenBank登錄號：OP131591）作為外群。分析結果（圖4）顯示，不同組別的分離物分別聚集為一個大的分支，其中TuMV_GXdh1與包括中國北京、山東、廣東、臺灣等分離物，以及美國、日本等地的14個分離物聚集在一個大分支上，屬于worldB組;與其他5個組別的其他TuMV不同分離物的關系較遠，尤其與Orchis組的關系最遠;而通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，TuMV_GXdh1與中國云南安寧分離物TuMV_CHN229和杭州分離物TuMV_CHZH33A聚集在一個小分支，說明其親緣關系最近，TuMV_GXdh1可能與這兩個分離物的進化來源相近。

利用RDP v4.71 中的7種方法（RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimarea、SiScan和3Seq）對本研究獲得的TuMV_GXdh1基因序列進行重組分析，結果未發(fā)現(xiàn)重組事件。

3 結論與討論

TuMV在我國的山東、廣東、陜西、重慶、天津、江蘇、湖北和福建等省市均有報道，危害較為廣泛［910， 1214］。本研究通過檢測和序列分析，從呈現(xiàn)斑駁、花葉等癥狀的菜心中檢測到TuMV，利用分段克隆、RACE技術獲得TuMV_GXdh1廣西分離物基因組全長序列。本研究獲得的TuMV全基因序列是從廣西分離到的第一條TuMV全基因序列，為研究TuMV的種群遺傳提供了資料。

基因重組是馬鈴薯Y病毒屬病毒變異的重要因素，本研究通過分析TuMV_GXdh1分離物的全基因序列發(fā)現(xiàn)，TuMV_GXdh1與其他各分離物變異最為明顯的是P3蛋白，NIaPro、NIb、CP也存在變異，但均為同義突變，暫未發(fā)現(xiàn)重組事件發(fā)生。遺傳進化分析表明，TuMV_GXdh1廣西菜心分離物與中國云南和杭州分離物具有較近的親緣關系。TuMV依據(jù)基因組進化關系可分為6個組，中國已報道的分離物類型有AsianBR、basalBR和worldB［810］，各地區(qū)的優(yōu)勢株系并不相同。如吉林省存在basalBR組和worldB組，basalBR組為優(yōu)勢株系［15］;四川省僅發(fā)現(xiàn)worldB組分離物［16］，侵染重慶市蘿卜的TuMV有basalBR和worldB組，worldB組為優(yōu)勢株系［10］;貴州省basalBR為侵染甘藍的優(yōu)勢株系［14］，山東則存在AsianBR、basalBR和worldB 3個株系［8］。通過分析，本研究獲得的TuMV_GXdh1廣西菜心分離物屬于worldB組。

廣西地處熱帶亞熱帶地區(qū)，菜心、蘿卜等蔬菜作物及十字花科雜草可全年生長，而溫潤的氣候則適宜傳毒蚜蟲的繼代繁殖，存在災變流行的風險。本文僅對為害菜心的TuMV 的分子特征進行研究和分析，取樣地點和取樣量均有所限制，不排除存在其他組分分離物侵染廣西十字花科作物的可能。今后應加強監(jiān)測，加大采樣范圍，明確TuMV在廣西的發(fā)生危害特點、基因組結構以及分類特征，為TuMV的防控提供幫助。

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（責任編輯：楊明麗）