沙門氏菌噬菌體多克隆抗體制備及其檢測方法

中圖分類號： R378.2⁺2;0939.48 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2025）06-1233-07

Abstract：Phagesare mainly composed of proteinsand nucleic acids.Whenabacteriophage enters ananimal’s body， it mayberecognizedasanantigen，therebytriggering theproductionofantibodies.Inordertofurtherstudytheproductionof antibodies intheanimalbodyafteroraladministrationof phages，purifiedbroad-spectrum lyticSalmonellphage SCBS was usedas theantigen tochallenge theNew Zealand Great WhiteRabit.The polyclonalantibodiesagainstthe phage SCBS were prepared，andthe indirectELISA method was established.The phageantibodies were detected asfolows：phages werecoated at a concentration of 1×10⁹PFU/mL ，blocked with 2% bovine serum albumin（BSA）for 3 h，the hyperimmune serum （ 1：500 ）was incubated for 6O min，then enzyme-labeled secondary antibody（ 1：12000 ）was incubated for 45min，the absorbance （ OD₄₅₀ ）was measured after the substrate solution containing TMB reacted for 15 min.The established ELISA methoddemonstratedgoodspecificity.TepositiveandnegativethresholdvalueswereO.372andO.310.Theintra-assaycoefficientofvariationranged from 2.30% to 7.11% ，andtheinter-assaycoefficient ofvariation ranged from 1.37% to 9.25%

Key words： Salmonella；phage；antibody；indirect ELISA

隨著噬菌體的廣泛使用，噬菌體治療的安全性和免疫原性也廣受關(guān)注。研究結(jié)果表明，噬菌體的特異性抗體能夠中和動物體內(nèi)的噬菌體。Srivastava 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，免疫B細胞可能在噬菌體中和過程中起重要作用，其原理可能是由于噬菌體刺激了B細胞產(chǎn)生免疫球蛋白，導(dǎo)致噬菌體活性喪失。Wang等[2]通過噬菌體體內(nèi)治療的動力學(xué)發(fā)現(xiàn)， 15min 時活性噬菌體的剩余比例為 50.43%±9.68% ，并且其失活速度很快，12h 已經(jīng)無法在血液中檢測到活性噬菌體。本研究以1株廣譜沙門氏菌噬菌體SCBS為對象，制備了其兔源多克隆抗體，并將噬菌體作為包被抗原建立一種檢測動物血清中該類型噬菌體抗體的間接ELISA方法，為后續(xù)研究噬菌體治療過程中動物血清抗體的產(chǎn)生規(guī)律提供一種快速檢測手段。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

沙門氏菌噬菌體SCBS由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所畜產(chǎn)品安全與營養(yǎng)研究室保存。PBS緩沖液購自上海源葉生物科技公司，Tween-20購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，將500μL Tween-20加人 ¹L PBS緩沖液中，搖勻，制成PBST緩沖液（PBS的 ΔpH 為7.4，Tween-20體積分數(shù)為 0.05% ）；牛血清白蛋白（BSA）購自上海源葉生物科技公司;TMB單組分顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；多功能酶標儀為德國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。3＼～4月齡新西蘭大白兔購自江蘇青龍山生物科技有限公司，AA肉仔雞購自特給力種植專業(yè)合作社，飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗動物房。

1.2試驗方法

1.2.1噬菌體SCBS的純化 利用CsCl密度梯度離心法純化噬菌體SCBS。將噬菌體SCBS擴增至 1× 10¹⁰ PFU/mL后加入胰DNaseI和RNase進行酶解，終質(zhì)量濃度均為 1μg/mL ，室溫孵育 30min 。在離心管底部先緩慢加入 3mL 質(zhì)量濃度為 1.6g/cm³ 的CsCl，再依次加入 3mL 質(zhì)量濃度為 1.4g/cm³ 的 CsCl，1.5 mL 的 25% 蔗糖溶液， 3.0mL 的噬菌體裂解液，以30 000r/min 超速離心 2h 。離心管下端（即1.4g/cm³ 與 1.6g/cm³ 之間）可見一層白色條帶，即為純化的噬菌體層，用 1mL 注射器從側(cè)面插入離心管吸取。將吸取的噬菌體樣品置于透析袋中，用SM緩沖液進行透析，透析過程中采用磁力攪拌器攪拌， ^2h 后結(jié)束，更換新的SM緩沖液， 4‰ 靜置過夜，將透析過的樣品取出，加入等體積的氯仿提純，上下顛倒混勻，5000r/min 離心 15min 分離有機相和親水相，回收含噬菌體顆粒的親水相（上層），重復(fù)氯仿提純操作2次。

1.2.2噬菌體SCBS多克隆抗體的制備選用3＼～4月齡的新西蘭大白兔進行多克隆抗體的制備，首次免疫原為純化的噬菌體（ 500μL ）與弗氏完全佐劑按 1：1 體積比混合乳化，采用背部皮下多點注射法進行免疫。2周后以同樣的方法進行二免，二免后2周進行三免，二免和三免的免疫原為噬菌體（500μL ）與弗氏不完全佐劑按 1：1 體積比混合乳化。3次免疫結(jié)束后7d對兔進行心臟采血，分離血清，檢測血清中抗體效價。

1.2.3間接ELISA方法的初步建立以噬菌體SCBS為抗原包被ELISA平板，包被含量為 1×10⁹PFU/mL ，每孔 100μL ，在 4‰ 條件下靜置過夜，用PBST緩沖液洗滌4次，每次洗滌 5min 。用 200μL 含 1% BSA的PBS緩沖液封閉， 37^9C 作用 1.5h ，用PBST緩沖液洗滌4次。用含 1% BSA的PBS緩沖液分別按1：500，1：1000，1：2000，1：4000，1：8000 稀釋兔源高免血清，每孔加入 100μL ，于 37^°C 孵育 1.5h 用PBST緩沖液洗滌4次。按 1：10000 比例稀釋用棘根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔 IgG ，每孔100μL 添加至包被板中， 37^°C 孵育 ¹h 后，用PBST緩沖液洗滌4次，包被板中每孔添加TMB顯色液100μL，37°C 避光顯色 10min ，每孔加人 50μL 終止液終止，酶標儀檢測 OD₄₅₀ 。設(shè)置未進行免疫的兔血清為陰性對照，PBS緩沖液為空白對照。

1.2.4間接ELISA方法的優(yōu)化最佳抗原包被含量和血清稀釋度的確定：利用棋盤法確定最佳抗原包被含量和最佳血清稀釋度。橫排為噬菌體不同包被含量，依次為 1×10¹⁰ 1 PFU/mL，1×10⁹ PFU/mL、1×10⁸PFU/mL?1×10⁷PFU/mL?1×1 1×10⁶ PFU/mL，豎列為血清不同稀釋度，從上到下做2倍稀釋，依次為1：500，1：1000，1：2000，1：4000 ，其余步驟同方法1.2.3。以 P/N 值（ P 表示陽性孔平均 OD₄₅₀ N 表示陰性孔平均 OD₄₅₀ ）最大且抗原包被含量最小時作為最佳。最佳封閉液的確定：在上述已確定的最佳條件的基礎(chǔ)上，將封閉液替換為 1% BSA ，2% BSA 5% 脫脂奶粉，計算此條件下的 P/N 值，確定P/N 值最大時為最佳。最佳封閉時間的確定：在上述已確定的最佳條件的基礎(chǔ)上，分別選擇封閉時間為 1h.2h.3h ，計算不同封閉時間下的 P/N 值，確定 P/N 值最大時的封閉時間為最佳。最佳血清作用時間的確定：在上述已確定的最佳條件的基礎(chǔ)上，分別選擇血清反應(yīng)時間為 45min_60min75min90 min ，計算不同血清反應(yīng)時間下的 P/N 值，確定 P/N 值最大時的血清反應(yīng)時間為最佳。最佳酶標二抗體積比：在上述已確定的最佳條件的基礎(chǔ)上，分別將酶標二抗按照 1：6000…1：8000…1：10000… 1：12000 的比例進行稀釋，計算不同酶標二抗體積比下的 P/N 值，確定 P/N 值最大時為最佳酶標二抗體積比。最佳酶標二抗反應(yīng)時間：在上述已確定的最佳條件的基礎(chǔ)上，分別選擇酶標二抗反應(yīng)時間為 ，計算不同反應(yīng)時間下的 P/N 值，確定 P/N 值最大的為最佳反應(yīng)時間。最佳顯色液反應(yīng)時間的確定：在上述已確定的最佳條件的基礎(chǔ)上，將TMB顯色液的反應(yīng)時間設(shè)置為37C10min.37C15min.37C20min ，計算不同TMB顯色液反應(yīng)時間下的 P/N 值，選擇 P/N 值最大為最佳TMB顯色液反應(yīng)時間。

1.2.5臨界值的確定在上述優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，對25份陰性血清進行檢測，測定其 OD₄₅₀ 值，計算其平均值 與標準差 （s） ；根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理計算陽性臨界值 ，陰性臨界值 。

1.2.6特異性檢測以肺炎克雷伯菌噬菌體、金黃色葡萄球菌噬菌體、弧菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體為抗原，按照上述優(yōu)化反應(yīng)程序進行間接ELISA檢測，鑒定該檢測方法的特異性。

1.2.7靈敏度檢測取3份噬菌體陽性血清分別進行 1：100，1：300，1：500，1：1000，1：2000 1：4 000…1：8 000…1：16 000 和 1：32000 稀釋，利用上述優(yōu)化的ELISA方法對稀釋后的陽性血清進行檢測，評價此方法的靈敏度。

1.2.8重復(fù)性試驗批內(nèi)重復(fù)性試驗：隨機取3份陽性血清和3份陰性血清，用同一批次包被的酶標板，采用上述優(yōu)化步驟進行間接ELISA檢測，計算該方法的批內(nèi)變異系數(shù)。批間重復(fù)性試驗：仍利用上述選出的陽性血清和陰性血清各3份，用不同批次包被的酶標板，采用上述優(yōu)化步驟進行檢測，計算該方法的批間變異系數(shù)。變異系數(shù) （CV）= 標準差/平均值 .×100% 。

1.2.9動物試驗選取1日齡健康A(chǔ)A肉仔雞144只，根據(jù)單因素完全隨機試驗設(shè)計，隨機分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)6只仔雞。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，其他3個試驗組分別在基礎(chǔ)日糧中添加噬菌體SCBS，效價分別為 1×10³ PFU/kg、 1×10⁴ PFU/kgAA.1×10⁵ PFU/kg。在試驗第21d和第 35d 從每個重復(fù)中隨機抽取1只肉雞稱重，采集靜脈血10mL ，靜置 30min 后， 3000r/min 離心 15min ，收集上層血清，通過本研究建立的間接ELISA檢測方法檢測肉雞血清中噬菌體SCBS特異性抗體水平。

2 結(jié)果與分析

2.1間接ELISA方法的建立與優(yōu)化

當(dāng)噬菌體包被含量為 1×10⁹PFU/mL ，血清稀釋度為 1：500 時， P/N 值最大且抗原包被濃度較小，所以 1×10⁹ PFU/ ΔmL 和 1：500 為最佳噬菌體包被含量和最佳血清稀釋度（表1）。

噬菌體SCBS在用 2% BSA作為封閉液時 P/N 值最大，其最佳封閉液為 2% BSA（表2）。

噬菌體SCBS在用 2% BSA為封閉液封閉 3h 時P/N 值最大，所以確定最佳封閉時間為 3h （表3）。

噬菌體SCBS在血清反應(yīng)時間為 60min 時 P/N 值最大，因此噬菌體SCBSELISA檢測的最佳血清反應(yīng)時間為 60min （表4）。

噬菌體SCBS在選擇 1：12000 的酶標二抗體積比時 P/N 值最大，因此確定最佳酶標二抗體積比為1：12000 （表5）。

噬菌體SCBS在酶標二抗反應(yīng) 45min 時 P/N 值最大，因此最佳酶標二抗反應(yīng)時間為 45min （表6）。

噬菌體SCBS在TMB顯色反應(yīng) 15min 時 P/N 值最大，因此噬菌體SCBSELISA檢測的最佳顯色反應(yīng)時間為 15min （表7）。

2.2 噬菌體SCBS間接ELISA方法的臨界值

應(yīng)用優(yōu)化后的間接ELISA方法對25份陰性血清進行試驗（圖1）。計算得到噬菌體SCBS特異性抗體的平均值為0.186，標準差為0.062，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理確定陽性臨界值 0.372，陰性臨界值 0.310。結(jié)果表明，本研究建立的ELISA方法檢測動物血清中噬菌體SCBS的抗體時，待測樣品的檢測值 ?0.372 的為陽性， lt;0.310 的為陰性，介于兩者之間的為可疑。

2.3 間接ELISA方法的特異性

采用肺炎克雷伯菌噬菌體、金黃色葡萄球菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體、弧菌噬菌體作為抗原包被，測試ELISA方法的特異性（表8）。結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌噬菌體、金黃色葡萄球菌噬菌體、弧菌噬菌體均為陰性，表明該檢測方法特異性良好。僅與大腸桿菌噬菌體有較弱的交叉反應(yīng)，有待進一步研究。

2.4 間接ELISA方法的靈敏度

根據(jù)上述最佳反應(yīng)條件，將SCBS陽性血清按照 1：100，1：300，1：500，1：1000，1：2000， 1：4 000，1：8 000，1：16 000 和 1：32000 稀釋，測定 OD₄₅₀ 。結(jié)果如表9所示，噬菌體SCBS陽性血清稀釋到4000倍仍為陽性，表明本檢測方法的靈敏度良好。

2.5 間接ELISA方法的重復(fù)性

根據(jù)上述最佳反應(yīng)條件，驗證批內(nèi)和批間的重復(fù)性，結(jié)果如表10所示，噬菌體SCBS的批內(nèi)變異系數(shù)為 2.30%～7.11% ，批間變系數(shù)在 1.37%? ）9.25% ，噬菌體SCBS批內(nèi)和批間變異系數(shù)均在10.00% 以下，表明該檢測方法的重復(fù)性良好。

2.6噬菌體SCBS在肉雞體內(nèi)的抗體水平

分別采集飼喂至第21d和第 35d 的肉雞血清，用本研究建立的間接ELISA方法檢測血清中噬菌

體SCBS的抗體（圖2），根據(jù)本研究確定的臨界值（ OD₄₅₀lt;0.310 為陰性）可知，通過在日糧中添加噬菌體飼喂肉雞并沒有引起肉雞的體液免疫。

3討論

致病性細菌感染是全球公共衛(wèi)生面臨的嚴峻挑戰(zhàn)[3-4]，由于抗生素的濫用和耐藥細菌的出現(xiàn)，導(dǎo)致抗菌治療更加困難。噬菌體療法被認為是治療多重耐藥細菌感染的重要抗生素替代品之一。宿主動物的免疫狀態(tài)很大程度上決定了宿主體內(nèi)噬菌體的持續(xù)時間及含量[5-6]，已有研究結(jié)果表明，肝臟和脾臟中免疫細胞的吞噬作用能夠中和動物體內(nèi)的噬菌體。因此，吞噬細胞可能是限制體內(nèi)噬菌體作用的最重要的部分。但同時也有一些試驗結(jié)果表明，噬菌體可以與吞噬細胞之間通過相互作用來消除細菌。Jonczyk-Matysiak等7通過對51名慢性革蘭陰性細菌和革蘭陽性細菌感染患病動物進行噬菌體治療，發(fā)現(xiàn)噬菌體治療不會降低患病動物吞噬細胞殺死細菌的能力，并且噬菌體進入吞噬細胞后能夠顯著減少細菌對吞噬細胞的毒性作用。

有研究人員提出這些免疫反應(yīng)可能會對噬菌體療法的療效產(chǎn)生影響，但不一定會影響噬菌體治療的成敗。Zaczek等8通過對葡萄球菌噬菌體混合物治療的患病動物的體液免疫反應(yīng)進行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患病動物在噬菌體治療期間血清中沒有表現(xiàn)出明顯增高的抗噬菌體抗體水平，并且一些患病動物在治療前和治療過程中產(chǎn)生的抗體相對較少，因此在噬菌體治療過程中產(chǎn)生的噬菌體抗體可能不會影響噬菌體治療的效果。

間接ELISA方法依據(jù)抗原與抗體之間特異性結(jié)合的原理能夠快速準確地進行抗體檢測，其靈敏度比直接ELISA檢測方法更高。并且抗原固定法沒有特異性，樣本中的一些非特異性蛋白可能會附著在微孔板上影響試驗結(jié)果[9]。本研究利用CsCl密度梯度離心和氯仿抽提的方法去除了噬菌體擴增液中的宿主細菌殘留碎片，從而使試驗結(jié)果更加準確。

目前有研究結(jié)果表明，口服噬菌體在胃中停留時，胃酸作用可能會導(dǎo)致大量噬菌體失活[10]。并且腸道中存在的消化液也會導(dǎo)致噬菌體失活，因此最終在腸道黏膜中存活的噬菌體可能只占添加量的一小部分。本試驗通過在肉雞日糧中添加 1×10³ PFU/kg，1×10⁴ PFU/kg和 1×10⁵ PFU/kg的噬菌體飼喂一段時間后，檢測發(fā)現(xiàn)在雞腸道黏膜中存活的噬菌體量大大降低，這與劉燕坤等[1的研究結(jié)果一致。

隨著噬菌體治療的廣泛應(yīng)用，有研究結(jié)果表明，噬菌體的特異性抗體能夠中和體內(nèi)的噬菌體。Wang等[2]通過噬菌體動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， 15min 時活性噬菌體的剩余比例為 50.43%±9.68% ，并且其失活速度很快， ^12h 時便無法在血液中檢測到活性噬菌體。本試驗通過在肉雞日糧中添加一定量的噬菌體，使噬菌體通過口服的方式進入肉雞體內(nèi)后，利用本研究建立的檢測方法檢測肉雞血清特異性抗體，結(jié)果在肉雞血清中沒有檢測到噬菌體的特異性抗體，這與Gembara等[12]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果為后續(xù)進行噬菌體的安全性評價提供了一定的參考依據(jù)。

4結(jié)論

本研究以沙門氏菌噬菌體SCBS為對象，制備了其兔源高免血清，進而建立了噬菌體SCBS血清抗體的間接ELISA檢測方法。該檢測方法特異性好，靈敏度低，陽性臨界值為0.372，陰性臨界值為0.310;重復(fù)性好，批內(nèi)變異系數(shù)為 2.30%～7.11% ，批間變系數(shù)為 1.37%～9.25% 。該檢測方法的建立為后續(xù)評價噬菌體治療的動物體內(nèi)血清抗體水平提供了參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：黃克玲）