果蔬中15種農(nóng)藥殘留快速檢測膠體金免疫層析多聯(lián)卡的研制

Development of A Multiplex Colloidal Gold Immunochromatographic Multicard for Rapid Detection of 15 Pesticide Residues in Fruits and Vegetables

NI Weihong'， YIN Danhan’，LI Gaotian1， XIAO Hailong1，LU Huajin2， SHEN Guofang' （1.Hangzhou Institute for Food and Drug Control Science，Hangzhou 31oo18， China; 2.Hangzhou Aomin Biotechnology Co.， Ltd.， Hangzhou 310019， China）

Abstract： In order to meet the needs of rapid detection of a variety of specific pesticide residues in fruits and vegetables，based oncoloidal gold immunochromatography technology，this paper developed acolloidal gold immunochromatographic multicard for the simultaneous rapid detection of 15 pesticide residues，such ascarbofuran， methocarb and profenofos，by optimizing the key factors such as coloidal gold-monoclonal antibody conjugate concentration and artificial antigen coating concentration.The test results showed that the detection limit of 15 pesticide residues was 0.01mg?kg^-1 to 0.3mg?kg^-1 ， no 1 negatives were found， the 1 positive rate was less than （20 5% ，and the specificity and accuracy were greater than 95% .A total of2 516 batches of samples were tested， and 6 batches of positive samples were detected.This method has good accuracy and simple operation，and is suitable for high-throughput rapid screening and detection of pesticide residues in vegetables and fruits.

Keywords： fruits and vegetables; pesticide residues; rapid detection; coloidal gold immunochromatographic multicard

我國各大農(nóng)貿(mào)市場的果蔬農(nóng)殘監(jiān)測以快速檢測為主，其中膠體金免疫層析技術(shù)（GoldImmuneChromatographicAssay，GICA）因其便捷性成為主流方法[1-5]。由于抗原與抗體一一對應(yīng)特性，單個(gè)抗體的檢測卡僅能檢測一種目標(biāo)物，難以滿足多種特定農(nóng)藥殘留同時(shí)篩查檢測的需求，而個(gè)性化定制的多聯(lián)卡則可解決這個(gè)問題[6-7]。目前，可同時(shí)檢測果蔬中多種農(nóng)殘的多聯(lián)卡技術(shù)報(bào)道較少[8]。本文基于競爭性GICA法，研制出15種常見農(nóng)藥殘留（克百威、滅多威、丙溴磷、甲基異柳磷、辛硫磷、多菌靈、吡蟲啉、吡唑醚菌酯、甲霜靈、噻蟲嗪、氯蟲苯甲酰胺、水胺硫磷、百草枯、三唑磷和蠅毒磷）同步快速檢測多聯(lián)卡，并對檢測卡的主要性能指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，旨在為我國蔬果中多農(nóng)藥殘留的個(gè)性化、高通量快速檢測以及食品安全提供科技支撐和技術(shù)保障。

1材料與方法

1.1材料與試劑

水果、蔬菜樣品，購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；抗體及抗原，江南大學(xué)；牛血清白蛋白、檸檬酸三鈉、氯金酸溶液，美國Sigma公司；羊抗鼠二抗，北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；聚乙二醇20000、聚乙烯吡咯烷酮、吐溫-20，上海Aladdin公司；硝酸纖維素膜，德國Sartorius公司。

1.2儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）；單通道及多通道可調(diào)移液器（德國Eppendorf公司）；超純水儀（美國Pall公司）；Allegra64R臺式高速離心機(jī)（美國Beckman公司）；SpectraMax@i3多功能酶標(biāo)儀（美國MolcularDevices公司）；Mastersizer2000激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；WEF-100噴金劃膜一體機(jī)（威爾芬）；WEF-200可編程自動(dòng)切條機(jī)（威爾芬）；AMYQ-MR智能讀卡儀（傲敏生物）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膠體金溶液制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，主要步驟如下：取 247.5mL 蒸餾水，加熱至沸騰，加入2.5mLl% 的 HAuCl₄ ，加速攪拌，取 7.5mL 檸檬酸三鈉，迅速加入沸騰的金溶液中，繼續(xù)攪拌煮沸30min 即可。

1.3.2 標(biāo)記抗體濃度及pH值優(yōu)化

采用棋盤法優(yōu)化標(biāo)記抗體濃度和pH值。用0.01mol?L^-1 的PB緩沖液（ pH=7.4 ）分別將15種農(nóng)藥單克隆抗體配制成 1.0mg?mL^-1 溶液。取多只小試管，各加入 1mL 膠體金，分別加入2、4、6、 8μL 和 10μL 單克隆抗體，再分別加入 碳酸鉀（ 0.1molL^-1 ）使各個(gè)小管的pH值在 8～9 ，渦旋混勻，靜置 10min 。每只小試管加人 牛血清白蛋白（BovineAlbumin，BSA），渦旋靜置 10min 向每只小試管中加入1mL 10%NaCl 溶液， 5min 后觀察各管溶液顏色變化。選擇不變色、 pH 值較高、抗體添加量最小的組合作為最佳體系。

1.3.3 T/C線包被濃度優(yōu)化

T線上分別包被克百威等15種抗原，抗原濃度分別設(shè)置為0.35、0.50、0.65、 0.80mg^.mL^-1 和0.95mg?mL^-15 個(gè)濃度。C線包被羊抗鼠二抗，濃度分別設(shè)置為 0.1，0.2，0.3，0.4mgmL^-1 和 0.5mgmL^-1 5個(gè)濃度。PB緩沖液（ （0.01mol?L^-1 ）作為空白對照溶液，利用金標(biāo)抗體溶液進(jìn)行顯示反應(yīng)，選擇T和C線顯色清晰且讀卡儀測量后讀數(shù)基本一致、包被濃度最低的作為最優(yōu)濃度。

1.3.4 多聯(lián)卡的組裝

將硝酸纖維素膜（NC膜）貼在聚氯乙烯（PolyvinylChloride，PVC）底板上，用噴金劃膜一體機(jī)噴捕獲線（T/C線）。多聯(lián)卡的組裝采用物理拼接方式，即每個(gè)檢測通道可以檢測1個(gè)項(xiàng)目，通過增加檢測通道實(shí)現(xiàn)二聯(lián)、三聯(lián)、四聯(lián)、五聯(lián)等多聯(lián)卡組裝。拼裝好的15種農(nóng)藥殘留檢測卡見圖1。

1＼～15依次為克百威、滅多威、丙溴磷、甲基異柳磷、辛硫磷、多菌靈、吡蟲啉、吡唑醚菌酯、甲霜靈、噻蟲嗪、氯蟲苯甲酰胺、水胺硫磷、百草枯、三唑磷和蠅毒磷。

2 結(jié)果與分析

2.1 工作溶液參數(shù)

由于各農(nóng)藥單克隆抗體及相應(yīng)人工抗原的蛋白活性有所差異，且所需的工作條件與試劑具體參數(shù)不一，故對工作溶液參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到最佳效果。按照1.3.2項(xiàng)方法，采用鹽沉淀法進(jìn)行膠體金標(biāo)記單克隆抗體最適標(biāo)記量優(yōu)化，通過棋盤法測試發(fā)現(xiàn)，15種農(nóng)藥殘留檢測體系的工作溶液最佳標(biāo)記 pH 值在8.0～8.7 ，最適抗體添加濃度在 2.0～8.0mg?L^-1 。

按1.3.3項(xiàng)方法，通過棋盤法試驗(yàn)，調(diào)節(jié)包被在T線和C線的競爭抗原和二抗的工作濃度，根據(jù)T、C線的顯色情況，篩選出包被試劑最優(yōu)的工作濃度條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各農(nóng)藥的T線包被抗原最佳工作濃度在 0.35～0.95mg?mL^-1 ，而C線包被二抗工作濃度則在 0.1～0.5mg?mL^-1 。各農(nóng)藥殘留檢測卡的最佳標(biāo)記pH值、抗體添加濃度、T線和C線包被工作濃度詳見表1。

2.2 對標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限

采用不同濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液對試劑卡檢出限進(jìn)行測試，以獲得試劑卡在不受干擾的理想狀態(tài)下的檢出限，即在經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果為陰性的樣品中，在適量范圍內(nèi)從高濃度到低濃度分別加入農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，使其在測試中肉眼可觀察到T線顯色逐漸變深，重復(fù)10次，當(dāng)T線顯色的深淺接近C線且可明顯區(qū)分時(shí)的濃度即為試劑卡對標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限。各農(nóng)藥殘留檢測卡對標(biāo)準(zhǔn)溶液檢出限見表1。

2.3樣品前處理參數(shù)

分別稱取樣品 1、2、3、4g 和 s_g ，采用攪碎、剪碎兩種破碎方式，分別用Tris-HC1緩沖液和PB 緩沖液進(jìn)行提取，比較篩選合適的前處理方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攪碎方式處理的樣品農(nóng)藥提取效果欠佳，故選用剪碎方式。此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)當(dāng)稱樣量大于2g 時(shí)，樣品中農(nóng)藥量達(dá)到飽和，這時(shí)T/C值不再隨稱樣量增加而減小，因此本文選擇 2g 作為最優(yōu)取樣量。在此取樣量基礎(chǔ)上，加入 5mL 提取液時(shí)，T/C值最小，故確定提取液用量為 5mL 。比較兩種緩沖液的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PB緩沖液T/C值明顯低于Tris-HC1緩沖液，表明PB緩沖液提取效果更佳。

2.4多聯(lián)卡性能驗(yàn)證

每種農(nóng)藥殘留檢測卡采用200個(gè)樣品進(jìn)行驗(yàn)證，其中陰性樣品50個(gè)（生姜、甘藍(lán)、菠菜、火龍果、番茄各10個(gè)，陽性樣品同）；陽性樣品按低、中、高3個(gè)水平加標(biāo)濃度開展實(shí)驗(yàn)（各50個(gè)），其中低濃度設(shè)置為試劑卡對標(biāo)準(zhǔn)溶液檢出限，低、中、高濃度按3倍左右遞增。考察多聯(lián)卡靈敏度、準(zhǔn)確性、特異性等，所得結(jié)果見表2。

靈敏度為檢測陽性的樣品數(shù)量占理論上總陽性樣品數(shù)的百分比，取靈敏度為 100% 時(shí)的濃度為實(shí)際樣品檢測限。驗(yàn)證結(jié)果表明，部分農(nóng)藥殘留檢測卡的檢測限與其對標(biāo)準(zhǔn)溶液檢出限一致，反映出該檢測體系不受樣品的干擾，如克百威、辛硫磷等；但大部分農(nóng)藥殘留檢測卡在實(shí)際樣品測試時(shí)受到一定的干擾。15種農(nóng)藥殘留檢測卡實(shí)際樣品檢測限在（204號 0.01～0.3mg^.kg^-1 。

在實(shí)際樣品檢測限水平測試多聯(lián)卡的假陰性率、假陽性率、特異性和準(zhǔn)確率，假陰性率為理論上總陽性樣品數(shù)中檢測為陰性樣品數(shù)的百分比；假陽性率為理論上總陰性樣品數(shù)中檢測為陽性樣品數(shù)的百分比；特異性實(shí)驗(yàn)采用15種農(nóng)藥與檢測卡互相交叉檢測，即測試特定農(nóng)藥的檢測卡對其余14種農(nóng)藥的抗干擾性，用檢測出陰性樣品數(shù)占理論上總陰性樣品數(shù)的百分比表示；準(zhǔn)確率為檢測結(jié)果符合理論結(jié)果的百分比。測試結(jié)果顯示，15種農(nóng)藥殘留檢測卡的假陰性率均為 0% ；假陽性率大部分為 0% ，其余幾種均 lt;5% ；農(nóng)藥殘留的特異性和準(zhǔn)確性均 gt;95% 。以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)制備的15種農(nóng)藥殘留檢測多聯(lián)卡的性能優(yōu)良。

2.5 實(shí)際檢測應(yīng)用

在某大型賽事活動(dòng)中，采用本文開發(fā)的膠體金快檢多聯(lián)卡共檢測2516批次果蔬樣品，共發(fā)現(xiàn)6批次果蔬農(nóng)藥殘留陽性，分別為1批紅椒絲（多菌靈）、2批黑布林（噻蟲嗪）、2批黃瓜（甲霜靈）、1批草莓（吡唑醚菌酯）。將6批次陽性送至實(shí)驗(yàn)室，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法進(jìn)行確認(rèn)，與膠體金判斷結(jié)果一致。

3結(jié)論與討論

農(nóng)藥殘留快速檢測卡的準(zhǔn)確度和檢測限與所用的抗體質(zhì)量直接相關(guān)。此外，樣品的破碎方式也是重要影響因素。部分農(nóng)藥具有內(nèi)吸性，而過度破碎導(dǎo)致樣品呈膠狀，該狀態(tài)容易吸附農(nóng)藥，同時(shí)也會(huì)釋放出細(xì)胞內(nèi)容物，干擾檢測結(jié)果，影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。故選擇破壞程度較輕的剪碎方式，這不僅可使農(nóng)藥殘留充分析出，還能避免對樣品組織的過度破壞。

對于快速檢測卡而言，檢測限過高或過低均不利于實(shí)際應(yīng)用，過低會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，過高則會(huì)使在國家安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最大殘留限量范圍內(nèi)的果蔬產(chǎn)品也檢出陽性結(jié)果，不利于安全果蔬產(chǎn)品的快速通行。故本文在方法開發(fā)時(shí)經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，使15種農(nóng)藥殘留檢測卡的檢出限數(shù)值與國標(biāo)要求基本一致或略高，大大提高了檢測卡的應(yīng)用性能。

經(jīng)樣品加標(biāo)測試，大部分農(nóng)藥殘留檢測的準(zhǔn)確率為 100% ，少數(shù)幾種準(zhǔn)確率在 95% 以上，可滿足快速檢測要求。該多聯(lián)卡在某大型賽事活動(dòng)中得到了實(shí)際應(yīng)用，檢測情況良好。

綜上，本文研發(fā)的果蔬中15種農(nóng)藥殘留快速檢測膠體金免疫層析多聯(lián)卡準(zhǔn)確性好、可靠性高、操作簡單，具有極高的應(yīng)用和推廣價(jià)值。

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