油茶暹羅炭疽菌的遺傳轉(zhuǎn)化及其侵染進(jìn)程研究

摘要

暹羅炭疽菌Colletotrichum siamense（菌株CA17）是引起云南省油茶炭疽病的強(qiáng)致病力菌株，但其與油茶互作的機(jī)制尚不十分清楚。本研究建立了高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系并利用熒光顯微鏡探究其分生孢子發(fā)育和侵染進(jìn)程。首先構(gòu)建了含有潮霉素抗性基因HygR和綠色熒光蛋白基因GFP的表達(dá)載體pCAMBIA1301∷GFP。同時(shí)優(yōu)化了CA17原生質(zhì)體的制備方法，并通過(guò)CaCl2/PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化CA17原生質(zhì)體。本研究共篩選出6株穩(wěn)定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子在菌落形態(tài)、產(chǎn)孢量和致病力上與野生型菌株無(wú)顯著差異。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子CA17GFP6的分生孢子培養(yǎng)4 h開始萌發(fā)，6 h附著胞開始發(fā)育并逐漸黑化，整個(gè)階段均可見綠色熒光信號(hào)。CA17GFP6接種擬南芥24 h可見分生孢子和少量菌絲的熒光信號(hào)，接種后48～72 h在葉片內(nèi)部可見大量菌絲的綠色熒光，接種油茶葉片后24～48 h綠色熒光信號(hào)較弱，主要分布在表皮和氣孔附近，接種72 h后，隨著菌絲的擴(kuò)張，綠色熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。綜上所述，本研究成功建立了PEG介導(dǎo)的油茶暹羅炭疽菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并利用陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子CA17GFP6探究了暹羅炭疽菌侵染擬南芥和油茶的途徑與進(jìn)程，為油茶炭疽菌致病的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

油茶暹羅炭疽菌; 遺傳轉(zhuǎn)化體系; 綠色熒光蛋白; 侵染進(jìn)程

中圖分類號(hào)：

S 435.65

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024360

Genetic transformation and infection process of Colletotrichum siamense in Camellia oleifera

CHEN Jianxin1， ZHU Youjiao1， WU Fengjinglin1， WEI Yuqian1， MA Huancheng2，YANG Hongyu3*， WU Jianrong1，2*

（1. Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Universities， College of Forestry， Southwest Forestry

University， Kunming 650224， China; 2. Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China， State Forestry

and Grassland Administration， College of Forestry， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China;

3. College of Agronomy and Life Sciences， Kunming University， Kunming 650214， China）

Abstract

Colletotrichum siamense （strain CA17） is a highly virulent pathogen causing anthracnose in Camellia oleifera in Yunnan province， but its interaction mechanism with the host remains poorly understood. In this study， an efficient genetic transformation system was developed to facilitate visualization of conidial development and infection process using fluorescence microscopy. An expression vector pCAMBIA1301∷GFP， harboring the hygromycin resistance gene HygR and the green fluorescent protein gene GFP， was constructed. The protoplast preparation protocol for CA17 was optimized， and transformation was achieved via CaCl2/PEGmediated delivery. Six stable GFPpositive transformants were obtained， exhibiting no significant differences from the wildtype strain in colony morphology， sporulation or pathogenicity. In the selected transformant CA17GFP6， conidia began germinating 4 h postinoculation， with appressoria forming and darkening by 6 h， and persistent green fluorescence observed throughout development. Green fluorescence from conidia and limited hyphae was visible 24 hours after inoculating CA17GFP6 into Arabidopsis thaliana， while extensive hyphal fluorescence was observed within leaf tissue 48-72 h after inoculation. In contrast， on C.oleifera leaves， weak GFP signals were localized near the epidermis and stomata between 24-48 hours， intensifying by 72 h as hyphae expanded. This study successfully established a PEGmediated protoplast transformation system for C.siamense， and utilized the GFPtagged transformant CA17GFP6 to track infection progression in A.thaliana and C.oleifera， providing a basis for elucidating the molecular mechanism of anthracnose pathogenicity in oil tea.

Key words

Colletotrichum siamense; genetic transformation system; green fluorescent protein; infection process

炭疽菌Colletotrichum作為一類常見的病原真菌，能引起多種植物的炭疽病，其中瓜類、葡萄、蘋果和大豆等農(nóng)作物的炭疽病已被廣泛關(guān)注［13］。油茶Camellia oleifera作為我國(guó)一種重要的木本油料作物，被廣泛栽植于我國(guó)14個(gè)省份，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［4］。近年來(lái)，油茶炭疽病嚴(yán)重制約著云南省油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［5］。油茶各個(gè)生長(zhǎng)階段均會(huì)受到炭疽菌的侵染，尤其以各生長(zhǎng)階段的幼嫩組織為主，侵染初期組織表面出現(xiàn)較小的褐色斑點(diǎn)，隨后出現(xiàn)輪紋狀枯斑，空氣濕度大時(shí)病斑處可見橙黃色至粉色分生孢子堆，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)葉片早落、枝梢枯死、果皮開裂及茶果早落等癥狀［67］。

炭疽菌屬的大多數(shù)成員屬于半活體營(yíng)養(yǎng)型真菌，根據(jù)炭疽菌利用寄主的營(yíng)養(yǎng)情況，其侵染過(guò)程大致可分為3個(gè)過(guò)程，即前期活體營(yíng)養(yǎng)階段、中期兼性營(yíng)養(yǎng)階段以及后期死體營(yíng)養(yǎng)階段［8］。炭疽菌分生孢子與植物接觸，產(chǎn)生芽管并分化出附著胞與侵染釘開始侵染寄主植物，進(jìn)入植物后產(chǎn)生活體營(yíng)養(yǎng)的初生菌絲，此階段即為無(wú)病斑的活體營(yíng)養(yǎng)階段。隨著病程發(fā)展，初生菌絲發(fā)展為細(xì)長(zhǎng)的次生菌絲穿透相鄰的細(xì)胞壁從而侵染其他細(xì)胞，造成寄主細(xì)胞死亡，這一進(jìn)程即為死體營(yíng)養(yǎng)階段［910］。

隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，暹羅炭疽菌基因組已完成測(cè)序組裝和注釋，為炭疽菌功能基因的深入研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［11］。高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是開展真菌分子生物學(xué)和功能基因研究的重要前提條件，絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系主要包括氯化鈣/聚乙二醇（CaCl2/PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、限制酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（restriction enzymemediated integration， REMI）和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation， ATMT）。其中，PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、隨機(jī)插入多個(gè)拷貝等優(yōu)點(diǎn)，在建立絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系中具有重要意義且應(yīng)用廣泛［12］。

熒光蛋白是分子生物學(xué)研究中的重要工具，同時(shí)也是一種可以監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路行為的理想蛋白，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白，來(lái)源于維多利亞多管發(fā)光水母Aequorea victoria，GFP分子量約為27 kD，是一個(gè)由238個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，最大激發(fā)波長(zhǎng)395 nm，發(fā)射峰509 nm，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，作為熒光標(biāo)記廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究［13］。GFP蛋白在植物病原菌的檢測(cè)、侵染與定殖及致病基因表達(dá)等研究中得到十分廣泛應(yīng)用，同時(shí)作為報(bào)告基因被應(yīng)用到絲狀菌研究中，在宿主中可利用熒光計(jì)量化GFP基因表達(dá)，也可利用激光共聚焦顯微鏡在單個(gè)細(xì)胞或亞細(xì)胞內(nèi)量化GFP基因表達(dá)［1415］。

在前期研究中，從云南省德宏州油茶種植基地分離到一株暹羅炭疽菌（C.siamense，CA17），經(jīng)過(guò)致病力分析驗(yàn)證其為強(qiáng)致病力菌株，并建立了擬南芥暹羅炭疽菌的互作體系［5， 16］。但在觀察暹羅炭疽菌侵染進(jìn)程時(shí)，需要對(duì)植物組織進(jìn)行脫色和染色等處理，加之缺乏適合該菌株的遺傳轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)錄組篩選出的差異功能基因無(wú)法得到準(zhǔn)確的驗(yàn)證。本研究旨在建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系和構(gòu)建GFP熒光標(biāo)記菌株并觀察其侵染進(jìn)程，為探究油茶暹羅炭疽菌的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料和試劑

供試菌株：油茶暹羅炭疽菌CA17分離自云南省德宏州翁冷村（23°50′-25°20′N，97°31′-98°43′E）染病油茶植株，分生孢子甘油懸浮液凍存于西南林業(yè)大學(xué)森林病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室-80℃超低溫冰箱。

供試質(zhì)粒：以含有潮霉素B抗性基因（HygR）和β葡萄糖苷酸酶基因（GUS）的雙元載體pCAMBIA1301作為骨架，且CaMV 35S啟動(dòng)子已由構(gòu)巢曲霉gpdA基因啟動(dòng)子（gpdA promoter）所替代。攜帶GFP基因的載體pMDGH由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，上述質(zhì)粒DNA均保存于西南林業(yè)大學(xué)森林病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室-80℃超低溫冰箱。

供試植物：野生型擬南芥Arabidopsis thaliana購(gòu)自美國(guó)Lehle seeds公司，為Columbia（Col0）生態(tài)型;油茶品種為‘云油茶3號(hào)’，一年生苗種植于溫室大棚。

試劑：2×Phanta Flash Master Mix和ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit購(gòu)自諾唯贊（南京）;Ezup柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒、1×TAE、核酸染料（GelView）、DNA ladder及引物購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司;其余無(wú)機(jī)、有機(jī)化學(xué)試劑（分析純）及抗生素購(gòu)自昆明盤龍華森有限公司。

培養(yǎng)基：1）PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯 200 g，無(wú)水葡萄糖20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水定容至1 000 mL;2）PD液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯 200 g，無(wú)水葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 000 mL;3）TB3液體培養(yǎng)基：酵母膏 3 g，酸水解酪蛋白 3 g，蔗糖 200 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

緩沖液：1）原生質(zhì)體裂解液Ⅰ（Lysis Ⅰ）：1% Lysing enzyme溶解于 0.7 mol/L NaCl溶液;2）原生質(zhì)體裂解液Ⅱ（Lysis Ⅱ）：0.5% Lysing enzyme和0.5% Snailase溶解于 0.7 mol/L NaCl溶液;3）原生質(zhì)體裂解液Ⅲ（Lysis Ⅲ）：0.3% Lysing enzyme、0.3% Snailase和0.3% Chitinase溶解于 0.7 mol/L NaCl溶液;4）STC和PTC緩沖液：參照黃麟等［17］的方法配制，以上緩沖液用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后備用。

1.2 GFP標(biāo)記載體的構(gòu)建

采用InFusion同源重組的方法構(gòu)建GFP表達(dá)載體：通過(guò)含同源臂的引物GFPF1/GFPR1（表1）從質(zhì)粒pMDGH中擴(kuò)增GFP基因的編碼序列;利用BgI Ⅱ/BstE Ⅱ?qū)|(zhì)粒pCAMBIA1301進(jìn)行雙酶切線性化;利用同源重組原理將GFP基因編碼序列連入pCAMBIA1301質(zhì)粒中，形成表達(dá)載體pCAMBIA1301∷GFP，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5（感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，序列正確的重組質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNA。

1.3 油茶炭疽菌培養(yǎng)及潮霉素敏感性測(cè)定

吸取100 μL暹羅炭疽菌CA17分生孢子甘油懸浮液涂布于PDA培養(yǎng)基，于25℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d，挑取菌絲用新的PDA平板重復(fù)純化3次，以此獲得CA17純培養(yǎng)菌株。

將菌株CA17的菌絲塊（d=0.6 cm）接種在含有潮霉素（質(zhì)量濃度梯度為0、100、200、300 mg/L和400 mg/L）的PDA平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況并通過(guò)十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4 原生質(zhì)體制備及條件優(yōu)化

切取等量的CA17菌絲塊，放入PD液體培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫?fù)u床中180 r/min分別振蕩培養(yǎng)6、12、18、24、48 h和72 h。用單層Miracloth濾布過(guò)濾培養(yǎng)液并收集菌絲，用無(wú)菌水和0.7 mol/L NaCl溶液依次洗滌菌絲，并用無(wú)菌濾紙吸干水分。將0.1 g菌絲分別放入10 mL Lysis Ⅰ、Lysis Ⅱ和Lysis Ⅲ緩沖液中，置于28℃恒溫?fù)u床中70 r/min分別酶解0.5、1、2 h和3 h。用雙層Miracloth濾布過(guò)濾菌絲收集酶液， 4℃ 2 000 r/min離心5 min，棄上清收集原生質(zhì)體，經(jīng)預(yù)冷的0.7 mol/L NaCl溶液洗滌后用預(yù)冷的STC緩沖液重懸原生質(zhì)體，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整濃度至1×106個(gè)/mL備用。

1.5 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子鑒定

在15 mL無(wú)菌離心管中加入100 μL原生質(zhì)體和2 μg質(zhì)粒DNA，輕柔混勻后室溫放置30 min，加入1 mL PTC緩沖液并輕柔混勻，室溫放置30 min。反應(yīng)結(jié)束后向離心管內(nèi)加入15 mL 45℃左右的TB3培養(yǎng)基（含400 mg/L潮霉素），混勻后倒平板，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光倒置培養(yǎng)3 d，直至出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落接種于含潮霉素的PDA平板上繼代培養(yǎng)5代，能在抗性平板上穩(wěn)定生長(zhǎng)的單菌落即為候選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

參照試劑盒說(shuō)明書提取候選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子總DNA，通過(guò)引物HygF1/HygR1（表1）擴(kuò)增HygR基因部分片段。設(shè)置CA17野生型菌株（CA17WT）和ddH2O為陰性對(duì)照，質(zhì)粒DNA模板為陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

利用NP40裂解液提取等量候選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子和野生型菌株的總蛋白，經(jīng)SDSPAGE電泳并轉(zhuǎn)膜至PDVF膜上。室溫封閉1 h后用GFP抗體4℃過(guò)夜孵育，洗膜后用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，洗膜后進(jìn)行曝光。

1.6 轉(zhuǎn)化子孢子萌發(fā)及侵染進(jìn)程的熒光觀察

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌絲塊接種于PD液體培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫?fù)u床中180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后收集分生孢子，并調(diào)整濃度為1×105個(gè)/mL。吸取10 μL孢子懸浮液至載玻片中央25℃黑暗保濕培養(yǎng)2～24 h，在Leica熒光顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)及附著胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的進(jìn)程。

對(duì)擬南芥和油茶幼嫩葉片進(jìn)行表面消毒，油茶葉片用無(wú)菌移液槍槍頭輕壓產(chǎn)生傷口，擬南芥葉片無(wú)需刺傷。吸取10 μL轉(zhuǎn)化子孢子懸浮液接種于葉片表面，接種后保濕培養(yǎng)5 d，測(cè)量病斑直徑。接種試驗(yàn)分別以野生型菌株和無(wú)菌水為對(duì)照，設(shè)5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在接種試驗(yàn)中，分別于24、48 h和72 h取樣通過(guò)普通熒光顯微鏡觀察其侵染進(jìn)程。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)集至少?gòu)?個(gè)獨(dú)立生物重復(fù)中收集，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，對(duì)于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，兩組間比較采用雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較則采用單因素方差分析（oneway ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFP標(biāo)記載體的構(gòu)建

為獲得GFP基因片段，首先以pMDGH質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)引物GFPF1/GFPR1擴(kuò)增得到762 bp含有同源臂的GFP基因片段，同時(shí)以雙酶切線性化后的pCAMBIA1301為骨架進(jìn)行同源重組（圖1a）。GFP基因在gpdA組成啟動(dòng)子下表達(dá)，HygR基因作為選擇標(biāo)記在trpC啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)（圖1b），雙向測(cè)序成功的陽(yáng)性克隆子菌株及其質(zhì)粒DNA保存于-80℃冰箱。

2.2 油茶炭疽菌對(duì)潮霉素的敏感性

通過(guò)含不同濃度梯度潮霉素的PDA平板分析CA17對(duì)潮霉素的敏感程度，結(jié)果顯示，在無(wú)抗平板上，CA17生長(zhǎng)良好，氣生菌絲發(fā)達(dá)，隨著潮霉素濃度的提高，菌落直徑遞減，無(wú)氣生菌絲。當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到300 mg/mL時(shí)，菌落生長(zhǎng)受到明顯抑制，當(dāng)濃度達(dá)到400 mg/mL時(shí)，菌株完全停止生長(zhǎng)（圖2）。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇400 mg/mL潮霉素作為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選用量。

2.3 原生質(zhì)體的制備及條件優(yōu)化

為探究振蕩培養(yǎng)時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體數(shù)量的影響，對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的幼嫩菌絲使用Lysis Ⅰ緩沖液酶解2 h，結(jié)果表明，培養(yǎng)6 h無(wú)法獲得足量的幼嫩菌絲，酶解所獲得的原生質(zhì)體數(shù)量最少，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，獲得原生質(zhì)體的數(shù)量遞增，至18 h達(dá)到最大值，達(dá)8.67×105個(gè)/mL。此后，菌絲趨于成熟，細(xì)胞壁增厚，不利于酶解，所獲得的原生質(zhì)體的數(shù)量開始遞減（圖3a）。因此，菌絲培養(yǎng)18 h為制備原生質(zhì)體的最適培養(yǎng)時(shí)間。

為探究不同裂解緩沖液對(duì)原生質(zhì)體釋放效果的影響，將振蕩培養(yǎng)18 h的幼嫩菌絲分別用Lysis Ⅰ～Ⅲ緩沖液進(jìn)行酶解，并在酶解后0.5、1、2 h和3 h對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，3種裂解緩沖液對(duì)菌絲均具有裂解效果，在裂解1～3 h的范圍內(nèi)，Lysis Ⅰ緩沖液的裂解效果弱于Lysis Ⅱ和Lysis Ⅲ，Lysis Ⅱ和Lysis Ⅲ之間在裂解2 h時(shí)存在差異（圖3b）。此外，隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體釋放的數(shù)量逐漸增加，酶解2 h和3 h獲得原生質(zhì)體的數(shù)量最多（圖3c），但裂解3 h后可見部分原生質(zhì)體破裂。因此，基于經(jīng)濟(jì)成本與時(shí)間成本，選擇Lysis Ⅱ作為原生質(zhì)體制備的最佳緩沖液，裂解2 h作為最適裂解時(shí)間。

2.4 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子鑒定

在含400 mg/mL潮霉素B的抗性培養(yǎng)基平板上獲得了37株轉(zhuǎn)化子，其中31株在熒光顯微鏡下可產(chǎn)生明顯的綠色熒光信號(hào)（圖4a，b），野生型菌株無(wú)熒光信號(hào)（圖4c，d），初篩陽(yáng)性率達(dá)84%。隨機(jī)挑選6株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，能獲得750 bp的HygR基因片段，而野生型菌株未獲得擴(kuò)增片段（圖4e），即表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化至CA17菌株中。

將上述6株轉(zhuǎn)化子在抗性平板上繼代培養(yǎng)5代，收集菌絲利用Western blot檢測(cè)GFP蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，在蛋白上樣量一致的條件下，轉(zhuǎn)化子可檢測(cè)到GFP蛋白的表達(dá)，而野生型菌株無(wú)GFP蛋白的表達(dá)（圖4f）。

選擇經(jīng)PCR和Western blot驗(yàn)證為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子CA17GFP6菌株分析其生物學(xué)特性和致病力。結(jié)果表明，CA17GFP6在菌落培養(yǎng)形態(tài)、產(chǎn)孢量和致病力方面與野生型菌株無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)化子和野生型菌株同樣在培養(yǎng)7 d后能長(zhǎng)滿PDA平板，生長(zhǎng)速率基本一致，且氣生菌絲正常（圖5a～c）。在PD液體培養(yǎng)基中接種等量菌絲塊振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化子和野生型菌株均能正常產(chǎn)孢，培養(yǎng)第5天產(chǎn)孢量約4.3×106個(gè)/mL，二者無(wú)顯著性差異（圖5d）。將轉(zhuǎn)化子與野生型菌株的分生孢子懸浮液接種于油茶葉片，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子和野生型菌株均能正常侵染油茶，接種后24 h開始產(chǎn)生水漬狀病斑，接種后5 d可在接種點(diǎn)附近產(chǎn)生產(chǎn)孢體結(jié)構(gòu)，接種無(wú)菌水的葉片不產(chǎn)生病斑，表明轉(zhuǎn)化子和野生型菌株致病力無(wú)差異（圖5e～h）。

2.5 轉(zhuǎn)化子孢子萌發(fā)及侵染進(jìn)程的觀察

陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子CA17GFP6分生孢子萌發(fā)及附著胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)果表明，分生孢子在0～2 h不萌發(fā)（圖6a，b），保濕培養(yǎng)4 h開始萌發(fā)長(zhǎng)出芽管（圖6c），6 h后分生孢子繼續(xù)萌發(fā)，少數(shù)芽管頂端膨大，開始形成透明的附著胞（圖6d），8 h后附著胞頂端開始逐漸黑化（圖6e），10～12 h后附著胞黑化程度繼續(xù)增加，可見初生菌絲出現(xiàn)（圖6f～g），培養(yǎng)后24 h可見大量菌絲糾結(jié)交錯(cuò)，附著胞黑化程度較高（圖6h）。轉(zhuǎn)化子的整個(gè)發(fā)育階段均可觀察到GFP熒光信號(hào)，表明GFP表達(dá)載體已轉(zhuǎn)化成功，且能被成功轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定表達(dá)。

陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子CA17GFP6接種擬南芥和油茶后，在熒光顯微鏡下均可見分生孢子或菌絲的綠色熒光信號(hào)，證實(shí)轉(zhuǎn)化子能正常侵染擬南芥和油茶。接種擬南芥葉片24 h后可見分生孢子和少量菌絲附著在葉片表面，隨著病程發(fā)展，接種48～72 h在葉片內(nèi)部可見菌絲的綠色熒光（圖7a～c）。由于油茶葉片較厚且木質(zhì)化程度高于擬南芥，因此，在接種24～48 h內(nèi)綠色熒光信號(hào)較弱，熒光信號(hào)主要集中在葉片表皮和氣孔附近，接種72 h后，隨著菌絲的擴(kuò)張，綠色熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，在接種點(diǎn)附近的葉肉細(xì)胞清晰可見熒光信號(hào)（圖7d～f）。

3 結(jié)論與討論

本研究將GFP編碼序列插入前期改造后的雙元載體pCAMBIA1301中，通過(guò)gpdA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP基因表達(dá)，而篩選標(biāo)記潮霉素抗性基因HygR通過(guò)trpC啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。通過(guò)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化暹羅炭疽菌CA17原生質(zhì)體，建立了高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。同時(shí)，利用GFP基因表達(dá)所產(chǎn)生的綠色熒光信號(hào)，探究了CA17分生孢子萌發(fā)、附著胞發(fā)育和侵染擬南芥和油茶的進(jìn)程。本研究為研究油茶暹羅炭疽菌的功能基因及其與寄主植物的互作機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

近年來(lái)，油茶炭疽菌的嚴(yán)重發(fā)生制約著油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，本課題組前期對(duì)云南省主要的油茶栽植地進(jìn)行了系統(tǒng)的觀察與記錄，闡明了云南省油茶炭疽病的發(fā)生規(guī)律［7］，但對(duì)于油茶炭疽菌的侵染特性和致病機(jī)理的研究還未開展。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和炭疽菌屬多個(gè)成員基因組完成測(cè)序［1819］，從分子水平研究炭疽菌效應(yīng)蛋白、致病基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其與寄主植物的互作成為一個(gè)研究切入點(diǎn)，因此建立高效的油茶炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系至關(guān)重要。李志偉［20］利用ATAM介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法建立了茶樹膠孢炭疽菌C.gloeosporioides的遺傳轉(zhuǎn)化體系，構(gòu)建了GFP標(biāo)記的熒光菌株。韓萌萌［21］和韓小路［22］分別通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了膠孢炭疽菌C.gloeosporioides和果生炭疽菌C.fructicola的遺傳轉(zhuǎn)化體系。兩種轉(zhuǎn)化方法各有優(yōu)勢(shì)，ATAM介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率較高，不同生長(zhǎng)時(shí)期的真菌均可作為受體，選擇單核的分生孢子作為轉(zhuǎn)化受體，可得到后代不發(fā)生性狀分離的轉(zhuǎn)化子，由此避免了多核菌絲作為受體出現(xiàn)后代分離而轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定的問題。但ATAM遺傳轉(zhuǎn)化需考慮農(nóng)桿菌濃度和與受體共培養(yǎng)的條件，這對(duì)于菌株的高效轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵問題［11］。與之相比，PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是通過(guò)PEG誘導(dǎo)外源DNA直接被原生質(zhì)體吸收，該方法操作簡(jiǎn)單，試劑價(jià)廉且易獲得，但使用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化需要獲得數(shù)量充足且質(zhì)量較高的原生質(zhì)體，且PEG對(duì)細(xì)胞具有一定毒性，因此PEG的濃度對(duì)于成功的轉(zhuǎn)化也不可忽視［12］。本研究?jī)?yōu)化了CA17原生質(zhì)體裂解緩沖液成分的配比，在2～3 h內(nèi)可獲得大量飽滿的原生質(zhì)體用于轉(zhuǎn)化，在CaCl2/PEG介導(dǎo)下成功完成轉(zhuǎn)化。

在真菌中表達(dá)熒光蛋白在病原菌的檢測(cè)、侵染及定殖的研究中應(yīng)用廣泛，外源GFP基因的正常表達(dá)在這一過(guò)程中至關(guān)重要。本研究使用的骨架pCAMBIA1301屬于植物雙元表達(dá)載體，外源基因由35S組成型強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，但35S啟動(dòng)子在絲狀真菌中能否正常驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因表達(dá)，還有待研究。因此，在前期研究中我們將骨架中的35S強(qiáng)啟動(dòng)子替換為構(gòu)巢曲霉gpdA基因的啟動(dòng)子，以此驅(qū)動(dòng)GFP基因的表達(dá)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)化子之間存在熒光強(qiáng)度的差異，這可能是GFP基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平存在差異。在后續(xù)的研究中，根據(jù)待轉(zhuǎn)化物種的密碼子偏好對(duì)目標(biāo)基因CDS進(jìn)行優(yōu)化，或者在CDS序列前端加入有助于mRNA翻譯的Kozak序列可能對(duì)增強(qiáng)GFP的表達(dá)是有幫助的［23］。值得關(guān)注的是，利用含GFP的載體轉(zhuǎn)化真菌來(lái)標(biāo)記目標(biāo)菌往往存在不確定性，GFP基因若插入某些重要功能基因的外顯子區(qū)域，則會(huì)破壞這些功能基因的正常表達(dá)，因此定點(diǎn)插入外源基因片段可避免隨機(jī)插入帶來(lái)的不利影響。劉曉妹等［24］將GFP和HygB編碼序列插入多主棒孢Corynespora cassiicola ITS序列中，成功獲得了GFP標(biāo)記的陽(yáng)性菌株，且轉(zhuǎn)化菌株在培養(yǎng)形態(tài)和致病力上與野生型菌株無(wú)明顯差異。ITS是真菌中高拷貝且功能冗余的序列，利用同源重組的方法將GFP重組到ITS序列上，降低和避免了GFP隨機(jī)插入帶來(lái)的不良影響。劉娜等［25］通過(guò)在膠孢炭疽菌β微管蛋白基因CgTUB1基因的3′端原位敲入GFP基因， CgTUB1EGFP順利地通過(guò)同源重組的方式整合到菌株的基因組，一方面通過(guò)定點(diǎn)插入外源GFP基因片段并整合到染色體上穩(wěn)定遺傳，另一方面清晰地標(biāo)記微管骨架，對(duì)研究微管蛋白的分布及動(dòng)態(tài)變化具有重要的意義。隨著功能基因研究的深入，越來(lái)越多的炭疽菌效應(yīng)子被報(bào)道，這些效應(yīng)子是炭疽菌發(fā)揮毒力所必需的［2627］。然而，在蛋白水平研究效應(yīng)子參與病程的作用機(jī)制尚缺少可用的抗體，因此，將效應(yīng)子蛋白編碼序列和GFP基因序列進(jìn)行融合表達(dá)，利用GFP蛋白標(biāo)簽抗體在體內(nèi)和體外水平對(duì)效應(yīng)子進(jìn)行研究是一種有效的方法。本研究用GFP標(biāo)記菌株接種擬南芥和油茶觀察其侵染進(jìn)程時(shí)，發(fā)現(xiàn)藍(lán)光激發(fā)下真菌顯示出GFP綠色熒光信號(hào)的同時(shí)，葉片中葉綠體也被激發(fā)，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光，對(duì)GFP熒光信號(hào)的觀察具有一定的干擾，特別在較厚的油茶葉片中，重疊的紅色熒光使GFP綠色熒光信號(hào)難以觀察。隨著研究的深入，較多的報(bào)告系統(tǒng)被用于微生物植物的互作研究中，紅色熒光蛋白mCherry標(biāo)記的菌株在互作研究中具有更低的背景［28］，此外，一些新穎的報(bào)告系統(tǒng)也開始受到關(guān)注，如RUBY報(bào)告系統(tǒng)將酪氨酸轉(zhuǎn)化為鮮艷的紅色甜菜堿，無(wú)需使用熒光顯微鏡或化學(xué)處理，即用肉眼便可清楚觀察［29］，這對(duì)于今后研究微生物與植物互作提供了重要的支持。

參考文獻(xiàn)

［1］ DA SILVA L L， MORENO H L A， CORREIA H L N， et al. Colletotrichum： species complexes， lifestyle， and peculiarities of some sources of genetic variability ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2020， 104（5）： 18911904.

［2］ MOREIRA R R， PERES N A， MAY DE MIO L L. Colletotrichum acutatum and C.gloeosporioides species complexes associated with apple in Brazil ［J］. Plant Disease， 2019， 103（2）： 268275.

［3］ BOUFLEUR T R， CIAMPIGUILLARDI M， TIKAMI ， et al. Soybean anthracnose caused by Colletotrichum species： Current status and future prospects ［J］. Molecular Plant Pathology， 2021， 22（4）： 393409.

［4］ YU Xinjin， ZHAO Zhimei， YAN Xiaoli， et al. Extraction optimization of tea saponins from Camellia oleifera seed meal with deep eutectic solvents： Composition identification and properties evaluation ［J/OL］. Food Chemistry， 2023， 427： 136681. DOI： 10.1016/j.foodchem.2023.136681.

［5］ 陳健鑫， 魏玉倩， 劉麗， 等. 云南油茶炭疽病菌的鑒定及生防菌篩選［J］. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 43（5）： 4353.

［6］ WANG Pushuang， HAI Du， LI Qili， et al. Characterization of a novel hypovirus isolated from the phytopathogenic fungus Colletotrichum camelliae ［J/OL］. Archives of Virology， 2023， 168（10）： 250. DOI： 10.1007/s00705023058784.

［7］ 吳峰婧琳， 陳健鑫， 王芳， 等. 云南油茶炭疽病病原鑒定及發(fā)病規(guī)律研究［J］. 西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2023， 59（2）： 118127.

［8］ O’CONNELL R J， THON M R， HACQUARD S， et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses ［J］. Nature Genetics， 2012， 44（9）： 10601065.

［9］ O’CONNELL R J， HERBERT C， SREENIVASAPRASAD S， et al. A novel ArabidopsisColletotrichum pathosystem for the molecular dissection of plantfungal interactions ［J］. Molecular PlantMicrobe Interactions， 2004， 17（3）： 272282.

［10］SHEN S， GOODWIN P H， HSIANG T. Infection of Nicotiana species by the anthracnose fungus， Colletotrichum orbiculare ［J］. European Journal of Plant Pathology， 2001， 107（8）： 767773.

［11］MENG Yanan， GLEASON M L， ZHANG Rong， et al. Genome sequence resource of the widehostrange anthracnose pathogen Colletotrichum siamense ［J］. Molecular Plantmicrobe Interactions， 2019， 32 （8）： 931934.

［12］DATTA K， DATTA S K. Transformation of rice via PEGmediated DNA uptake into protoplasts ［J］. Methods in Molecular Biology， 1999， 111： 335347.

［13］PRASHER D C. Using GFP to see the light ［J］. Trends in Genetics， 1995， 11（8）： 320323.

［14］WAHLFORS J， LOIMAS S， PASANEN T， et al. Green fluorescent protein （GFP） fusion constructs in gene therapy research ［J］. Histochemistry and Cell Biology， 2001， 115（1）： 5965.

［15］KARPENKO D， KAPRANOV N， BIGILDEEV A. NestinGFP transgene labels immunoprivileged bone marrow mesenchymal stem cells in the model of ectopic foci formation ［J/OL］. Frontiers in Cell and Developmental Biology， 2022， 10： 993056. DOI： 10.3389/fcell.2022.993056.

［16］陳健鑫， 魏玉倩， 于德嘉， 等. 擬南芥對(duì)暹羅炭疽菌侵染的抗性響應(yīng)機(jī)制［J］. 植物病理學(xué)報(bào)， 2023， 53（5）： 890904.

［17］黃麟， 楊濟(jì)云， 方玉蘭， 等. 杉木炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化及附著胞發(fā)育過(guò)程的細(xì)胞核行為觀察［J］. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2017， 41（6）： 6872.

［18］WANG Haoming， HUANG Rong， REN Jingyi， et al. The evolution of minichromosomes in the fungal genus Colletotrichum ［J/OL］. mBio， 2023， 14（4）： e0062923. DOI： 10.1128/mbio.0062923.