本氏煙tsRNAs對(duì)馬鈴薯Y病毒侵染的響應(yīng)

中圖分類號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-5119（2025）03-0070-11

Altered Expression of Transfer-RNA-derived small RNAs after Potato Virus Y Infection in Nicotiana benthamiana

GAO Xinwen， SONG Hongping， WANG Hui， MIAO Pu³ ， JIAO Yubing1， SHEN Lili'， WANG Yujie3*， YANG Jinguang1 （1.Institute ofTobaccoResearchofChinese Academyof Agricultural Sciences，Qingdao 266101，China; 2.YangtzeUniversity Jingzhou434025，Hubei，China; 3.Luoyang CityCompanyofHenan TobaccoCompany，Luoyang 471oo，HenanChina）

Abstract： To explore the molecular mechanismsunderlyingNicotiana benthamiana responses topotato virus Y（PVY）infection， smallRNA sequencing （sRNA-seq）andtranscriptomesequencing （RNA-seq）were employed toanalyze thediferences intsRNAs andtranscriptionalesponsesinN.benthmianafollowingPVYinfection.Teresultsshowedthat39iferentillyexpressdtNAs （tRNAhalves）and119tRFs（tRNA-relatedfragments）wereidentifiedatthe7thdaypost-inoculation.Enrichmentanalysisof diferentiallexpresedtargetgenes （DETGs）demonstratedtat117and60target genesoftFsinleavesandstems，espectively were predominantlyenrichedinpathwayssuchassignaltransductionandenergymetabolism.Notably，theexpresionoft-1：18- His-GTG-1-M3was mostsignificantlydown-regulated iPVY-infectdleaves.SuppressgtheexpresionoftDR-1：18-Hs-G-1- M3 in N. benthamiana markedly increasingthe expresion levels of its target genes，yabDand RNF170.These findings provide a reference forfurtherin-depthresearchontheroleoftsRNAsinPVY-host plant interactionsandthedevelopmentofPVYcontrol strategies.

Keywords： Nicotiana benthamiana; potato virus Y; small RNA sequencing; transcriptome sequencing

馬鈴薯Y病毒（potatovirusY，PVY）作為一種單鏈RNA病毒，具有分布廣[]、進(jìn)化快、種群規(guī)模龐大以及高度宿主依賴性等特點(diǎn)，在生產(chǎn)上尚無(wú)靶向藥劑。相關(guān)研究表明，通過(guò)特定的小非編碼RNAs（sncRNAs），包括微小RNA（miRNAs）、小干擾RNA（siRNAs）、tsRNAs、小核RNA（snRNAs）、小胞質(zhì)RNA（scRNAs）以及皮小RNA（piRNAs）等，能夠?qū)χ参锟共《久庖吣芰M(jìn)行有效調(diào)節(jié)，其中，針對(duì)miRNAs和siRNAs的研究最為深人[2]。利用人工miRNA（amiRNA）技術(shù)可以有效增強(qiáng)植物對(duì)病毒的抗性，例如，以miR159、miR167b和miR171為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)靶向序列，賦予煙草對(duì)PVY和馬鈴薯X 病毒（potato virusX，PVX）的抗性[3]；miR482/2118可以調(diào)控番茄的天然免疫機(jī)制，有助于植株形成針對(duì)病原體攻擊的新型防御層[4]。此外，人工設(shè)計(jì)的siR099序列可靶向熱休克蛋白70（HSP70），增強(qiáng)本氏煙的抗病毒免疫[5]。然而，另一方面，部分病毒利用siRNAs和miRNAs促進(jìn)自身的侵染，例如，番茄叢矮病毒（tomato bushy stuntvirus，TBSV）的沉默抑制因子P19通過(guò)與siRNA結(jié)合，增強(qiáng)TBSV對(duì)本氏煙的侵染[；黃瓜花葉病毒（cucumbermosaicvirus，CMV的2b蛋白可以與AGO1蛋白互作并影響內(nèi)源miRNA途徑，抑制依賴于宿主RDR6/SGS3的次級(jí)siRNA的產(chǎn)生，最終減弱宿主的抗病毒RNA沉默反應(yīng)，為病毒自身的侵染和復(fù)制創(chuàng)造有利條件[7]。

tsRNAs是一類新型的小非編碼RNA，包括tRFs（tRNA-related fragments）和 tiRNAs（ tRNAhalves）兩種類型，在基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。已有研究表明，在生物或非生物脅迫下，植物中部分特異性tsRNAs的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)顯著變化。例如，在擬南芥中，干旱和氧化應(yīng)激可導(dǎo)致 S^′–tRF^ArgCCT 顯著上調(diào)[8]，鹽脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的 5^′-tRF^GlyGCC 在紫外光處理下表達(dá)量也會(huì)增加[9]。此外，tsRNAs還能對(duì)病毒和真菌的侵染做出響應(yīng)。例如，呼吸道合胞病毒（respiratory syncy-tial virus，RSV）[10-12]和蘋(píng)果莖溝病毒（apple stemgroovingvirus，ASGV）[13]侵染時(shí)，tsRNAs表達(dá)量會(huì)發(fā)生改變。 5^′-tRF^Ala 在真菌侵染時(shí)，能夠響應(yīng)并調(diào)控CYP71A13基因轉(zhuǎn)錄水平[14-15]。在調(diào)控機(jī)制方面，tRFs與miRNAs類似，可在RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complexes， RISC）中形成效應(yīng)元件[16-17]，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平；而tiRNAs則主要作為生物標(biāo)志物發(fā)揮作用，在疾病診斷[18]及治療檢測(cè)[19中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

盡管tsRNAs在諸多生物過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但目前尚未發(fā)現(xiàn)tsRNAs響應(yīng)PVY侵染的相關(guān)報(bào)道。因此，參考已有研究手段，本研究對(duì)PVY侵染本氏煙的tsRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析，并對(duì)tRFs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)；隨后比較分析預(yù)測(cè)靶基因表達(dá)量變化，并對(duì)部分靶基因進(jìn)行初步驗(yàn)證。研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡明PVY侵染機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

冷凍離心機(jī)（10020，德國(guó)Sigma公司）、掌上離心機(jī)（S1010，賽洛捷克公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（7500-Fast，美國(guó)ThermoFisher公司）、紫外分光光度計(jì)（NanoDrop2000，美國(guó)ThermoFisher公司）、PCR儀（Bio-rad，MyCycler公司）。

試劑：總RNA的提取試劑TRIzol、cDNA合成試劑盒購(gòu)自諾唯贊公司。tsRNAs提取試劑盒以及tsRNAscDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Arraystar公司。熒光定量引物及tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制劑以及抑制劑對(duì)照組由上海生工生物有限公司合成。1× PBS（ pH=7.4 ， 0.01mol/L 購(gòu)自德國(guó)Sigma公司。

1.2供試植物、病毒培養(yǎng)

馬鈴薯Y病毒接種至三生煙擴(kuò)繁。本氏煙（Nicotianabenthamiana）植株在人工氣候室中培養(yǎng)，光照 16h/d ，溫度為 25°C ，相對(duì)濕度約為 80% 光合有效輻射為 100μmol/（m²?s）_? 。PVY毒源與本氏煙均保存于本實(shí)驗(yàn)室，栽培基質(zhì)購(gòu)自壽光沃德公司。

1.3 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)與方法

1.3.1試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)試驗(yàn)于2023年6月在病毒實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.3.2病毒接種當(dāng)本氏煙長(zhǎng)至5＼～6片葉時(shí)，采用摩擦接種法接種PVY，接種至本氏煙兩片最大展開(kāi)葉上。1.3.3樣品采集及RNA提取對(duì)接種PVY7d的本氏煙（PVY，處理組）以及未接種PVY的本氏煙（NC，對(duì)照組）進(jìn)行取樣，取頂部?jī)善到y(tǒng)葉片及系統(tǒng)葉片所連接的莖。本試驗(yàn)包括12個(gè)樣品（PVY_Leaf_1、PVY_Leaf_2、PVY_Leaf_3以及NC_Leaf_1、NC_Leaf_2、NC_Leaf_3;PVY_Stem_1、PVY_Stem_2、PVY_Stem_3以及NC_Stem_1、NC_Stem_2、NC_Stem_3）。每個(gè)樣品6株本氏煙，3個(gè)重復(fù)。分別對(duì)以上樣品進(jìn)行總RNA的提取，提取到的RNA用于SmallRNA及RNA測(cè)序。

1.3.4SmallRNA、RNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析對(duì)

1.3.3提取的12個(gè)RNA樣本進(jìn)行sRNA及mRNA建庫(kù)。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。質(zhì)量控制sRNA測(cè)序讀數(shù)步驟如圖1。首先，使用cutadapt[20]對(duì)接頭序列進(jìn)行去除，并過(guò)濾掉小于 15bp 、大于 35bp 的序列。使用fastx_toolkit （version 0.0.13）[21]軟件，對(duì)序列進(jìn)行Q20質(zhì)量控制（PhredQuality Score20），保留Phred質(zhì)量分?jǐn)?shù) 20（Q20）?80% 的序列。隨后使用NGSQCToolkit （version2.3.2）[22]過(guò)濾掉含有N堿基的讀數(shù)。最終得到高質(zhì)量的可用于后續(xù)分析的cleanreads。對(duì)cleanreads的長(zhǎng)度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以初步評(píng)估樣本的小RNA分布情況。根據(jù)本氏煙基因組中的tRNAs序列，將cleanreads與tRNAs序列進(jìn)行比對(duì)（基于0堿基錯(cuò)配的原則），從tRNAs的5端或3端精確匹配讀數(shù)，并根據(jù)長(zhǎng)度預(yù)測(cè)tiRNAs和tRFs的分類。統(tǒng)計(jì)與本氏煙基因組中tRNAs序列精確匹配的cleanreads百分比。接下來(lái)使用RepeatMasker[23]軟件，將過(guò)濾后的序列同repeat數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定可能的重復(fù)序列。針對(duì)鑒定出的重復(fù)序列進(jìn)行過(guò)濾去除。分析tiRNAs和tRFs的表達(dá)情況。根據(jù)已確定的tiRNAs和tRFs 的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，使用transcript permillion（TPM）評(píng)估tiRNAs和tRFs的表達(dá)量。分析tiRNAs和tRFs之間的差異。對(duì)于有生物重復(fù)的配對(duì)樣本，使用R軟件中的DESeq2軟件包[24進(jìn)行差異tiRNAs和tRFs篩選。

1.3.5RNA樣品前處理、cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）從總RNA中提取tsRNAs，并將其反轉(zhuǎn)成cDNA用于接下來(lái)的tsRNAs實(shí)時(shí)熒光定量PCR，U6作為內(nèi)參基因。mRNAs實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需對(duì)總RNA進(jìn)行前處理， β -Actin作為內(nèi)參基因。qRT-PCR引物見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)條件： 95^°C ， 10min ；40個(gè)PCR循環(huán) [95^°C 10s ； 60°C ， 60s （收集熒光）]。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的熔解曲線分析，反應(yīng)程序?yàn)椋?95^°C 10s ， 60°60s ， 95°15s ，其中降溫速度為2.2^°C/s ，升溫速度為 0.15^°C/s 。

1.3.6tRFs靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析對(duì)于差異表達(dá)的tRFs使用targetfinder軟件[25]進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。此外，使用基于超幾何分布的R軟件對(duì)篩選后的tRFs預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析 值小于0.05為顯著）。

1.3.7瞬時(shí)浸潤(rùn)tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制劑tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制劑通過(guò)合成與其序列反向互補(bǔ)的RNA鏈實(shí)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而有效干擾目標(biāo)RNA，抑制tDR-1：18-His-GTG-1-M3的表達(dá)水平和功能。為提高抑制劑在植物體內(nèi)的穩(wěn)定性，對(duì)合成的RNA進(jìn)行了甲氧修飾，以防止快速降解。此外，采用 1×PBS 作為浸潤(rùn)劑，以確保抑制劑順利滲透植物組織。使用 100nmol/L tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制劑對(duì)本氏煙葉片進(jìn)行瞬時(shí)浸潤(rùn)，以便評(píng)估其對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的影響。

1.3.8數(shù)據(jù)處理與分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用MicrosoftofficeExcel2016、GraphPadPrism8.0.1、R語(yǔ)言4.3.1進(jìn)行處理，基因及tsRNAs相對(duì)表達(dá)量的組間差異分析采用 t 檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1PVY侵染后本氏煙葉片和莖中的tsRNAs表達(dá)譜

各樣本cleanreads比對(duì)率 ≥86.68% ，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高（表2），讀數(shù)計(jì)數(shù)主要分布在 21～24nt 長(zhǎng)度范圍內(nèi)，其中長(zhǎng)度為24nt時(shí)的讀數(shù)數(shù)量最高（圖2A）。對(duì)tsRNAs進(jìn)行鑒定及分類，在本氏煙的葉片和莖中， 5^′ -tRFs的比例最高 43.26% ，接下來(lái)依次是 、 5^′ -tiRNAs（ 17.61% 0和 3^′. -tiRNAs（ 5.55% （圖2B）。對(duì)PVY處理前后本氏煙中的tsRNAs表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，PVY侵染導(dǎo)致39個(gè)tiRNAs和119個(gè)tRFs的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，其中有2個(gè)tiRNAs、6個(gè)tRFs在本氏煙葉片和莖中均發(fā)生顯著差異表達(dá)（圖2C）。在本氏煙葉片中，76個(gè)tsRNAs的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，其中29個(gè)tRFs上調(diào)，24個(gè)下調(diào)；15個(gè)tiRNAs上調(diào)，8個(gè)下調(diào)。在莖中90個(gè)tsRNAs的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，有37個(gè)tRFs上調(diào)、35個(gè)下調(diào)，6個(gè)tiRNAs上調(diào)、12個(gè)tiRNAs下調(diào)（圖2D）。對(duì)tsRNAs類型進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示（圖3），在本氏煙的葉片和莖中，源自 tRNAMet_CAT的tsRNAs數(shù)量最多。

2.2 tsRNAs的差異表達(dá)分析

分別從葉片和莖中選取差異顯著并且重復(fù)性較好的17、18個(gè)tsRNAs進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類分析，PVY處理前后本氏煙葉片、莖tsRNAs表達(dá)量存在明顯的分群現(xiàn)象。在PVY處理后葉片中差異表達(dá)的17個(gè)tsRNAs中，7個(gè)下調(diào)tsRNAs為一類，10個(gè)上調(diào)為一類（圖4A）。在PVY處理后莖中的18個(gè)tsRNAs中，11個(gè)下調(diào)為一類，7個(gè)上調(diào)為一類（圖4B）。為進(jìn)一步驗(yàn)證sRNA-seq結(jié)果的準(zhǔn)確性，從葉片和莖中各選取5個(gè)顯著差異表達(dá)的tsRNAs進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)（圖4C），葉片中的5個(gè)tsRNAs在PVY侵染后的差異表達(dá)情況與sRNA-seq結(jié)果一致，tDR-1：18-His-GTG-1-M3、tDR-1：20-Arg-TCG-1-M2、tDR-1：25-Cys-GCA-3-M2顯著下調(diào)，tDR-1：26-Glu-TTC-5、tDR-1：23-Tyr-GTA-1-M10顯著上調(diào)。莖中有3個(gè)tsRNAs在PVY侵染后的差異表達(dá)情況與sRNA測(cè)序結(jié)果一致，tDR-59：73-Phe-GAA-1-M2、tDR-1：20-Arg-CCG-2表達(dá)量顯著下調(diào)，tDR-1：32-Glu-TTC-5表達(dá)量顯著上調(diào)。因此，該測(cè)序結(jié)果具有一定的可靠性，可用于后續(xù)的研究。值得注意的是，tDR-1：18-His-GTG-1-M3是一種未被表征的 5^′"-tRF，其表達(dá)量在PVY侵染后下調(diào)最顯著 （109₂FC=-7.28）

注：A，sRNA的長(zhǎng)度分布；B，tsRNAs的類型分布；C，PVY侵染后本氏煙葉片和莖中差異表達(dá)的tsRNAs數(shù)量；D，PVY侵染后本氏煙葉片和莖中差異表達(dá)的tsRNAs表達(dá)量上下調(diào)情況。

Note：Aeg bentis of Nicotiana benthamiana after PVY infection.

Fig.2tsRNAs expression profile in PVY-infected Nicotiana benthamiana leaves and stems

Fig. 4Differential expresson levels of tsRNAs in Nicotiana benthamiana after PVY infection

2.3PVY侵染后本氏煙的mRNAs表達(dá)譜

RNA-seq結(jié)果顯示，每個(gè)RNA文庫(kù)大約有5000萬(wàn)個(gè)cleanreads， 85.29% 的cleanreads可以映射到本氏煙基因組上，其中，38657個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因至少在一個(gè)樣本中表達(dá)。為了確定候選的免疫相關(guān)基因，對(duì)PVY侵染和未侵染的本氏煙進(jìn)行了RNA-seq比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PVY侵染后，在 plt;0.05 且 |og₂FC|gt;1 條件下，本氏煙葉片中有1496個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs，differential expressedgenes），包括883個(gè)上調(diào)DEGs和613個(gè)下調(diào)DEGs（圖5A）。莖中有3427個(gè)DEGs，包括1454個(gè)上調(diào)DEGs和1973個(gè)下調(diào)DEGs（圖5B）。進(jìn)一步利用基因組百科全書(shū)（KEGG，KyotoEncycgan-ranlopediaofGenesandGenomes）對(duì)DEGs進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示，本氏煙葉片中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集到的DEGs最多，有83個(gè)；其次是碳水化合物代謝通路（51個(gè)）（表3）。莖中在能量代謝通路中富集到的DEGs最多，有175個(gè)；其次是碳水化合物代謝通路（170個(gè)）（表3）。

注：A、B熱圖分別顯示PVY侵染后本氏煙葉片和莖中顯著差異表達(dá)的mRNAs（ plt;0.05 ，紅色和藍(lán)色分別表示高表達(dá)和低表達(dá)，顏色越深，代表該mRNA在PVY侵染前后的相對(duì)表達(dá)量變化越顯著。下同。

Note：A，aasoatlielpdsisfoeeio （plt;0.05） ; red and blueepsentdsilaiep mRNA beforeand after PVY infection.The sameas below.

Fig.5DiferentialexpresionprofilesofmRNAsintheleaves （A）andstems （B）ofNicotiana benthamianaafterPVYinfection

2.4tRFs靶基因預(yù)測(cè)與RNA-seq聯(lián)合分析

為了更好地解析PVY侵染本氏煙后tRFs發(fā)揮的調(diào)控作用，對(duì)其進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)與RNA-seq聯(lián)合分析。在PVY侵染的本氏煙葉片中共鑒定出53個(gè)差異表達(dá)的tRFs，預(yù)測(cè)得到2635個(gè)靶基因。在莖中共鑒定出72個(gè)差異表達(dá)的tRFs，預(yù)測(cè)得到6315個(gè)靶基因。進(jìn)一步將預(yù)測(cè)靶基因結(jié)果與DEGs結(jié)果取交集，得到差異表達(dá)靶基因（DETGs，Differen-tiallyExpressedTargetGenes）集合，結(jié)果顯示，莖和葉片中分別有602、117個(gè)DETGs。為進(jìn)一步驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇了8個(gè)DETGs進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，PVY侵染后的本氏煙葉片中，yabD（Niben101Scf01413g00003， plt;0.01 ）、RNF170（Niben101Scf03827g01009， plt;0.0001 表達(dá)量顯著下調(diào)；XTH23（Niben101Ctg13782g00003，plt;0.0001 ）、TOR1L2（Niben101Scf10157g01024， plt;0.05）、BnaC07g23050D（Niben101Scf00577g07003，plt;0.01 ）表達(dá)量顯著上調(diào)（圖6A）。其中，yabD、RNF170、XTH23和TOR1L2的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與RNA-seq結(jié)果保持一致（圖6C），認(rèn)為該測(cè)序結(jié)果具有一定的可靠性，可用于后續(xù)的研究。由圖6B可見(jiàn)，RNA-seq測(cè)序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果。

注：A，qRT-PCR檢測(cè)葉片中8個(gè)基因mRNAs的相對(duì)表達(dá)量；B，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相關(guān)性分析；C，RNA-seq 檢測(cè)PVY侵染后本氏煙葉中8個(gè)基因mRNAs的表達(dá)情況 （plt;0.05）。相關(guān)性極顯著 （plt;0.0001） 。

Note：Aeliee expression levels of 8 gene mRNAs in Nicotiana benthamiana leavesafter PVY infection detected by RNA-seq （plt;0.05）

進(jìn)一步對(duì)DETGs進(jìn)行GO富集分析，并篩選出3個(gè)分類中的前三個(gè)通路。結(jié)果顯示，在本氏煙葉片中，生物學(xué)過(guò)程中明顯富集的類別依次為氧化還原反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控-DNA模板和代謝過(guò)程；細(xì)胞組分方面富集的類別依次為細(xì)胞核、膜和膜的組成成分；分子功能方面富集的類別依次為DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合和ATP結(jié)合（圖7A）。在本氏煙莖中，生物學(xué)過(guò)程中富集的類別依次為氧化還原反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控-DNA模板和蛋白質(zhì)磷酸化；細(xì)胞組分富集的類別依次為膜、細(xì)胞核和膜的組成成分；在分子功能方面，依次為蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合和DNA結(jié)合（圖7B）。

2.5tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)靶基因表達(dá)量的影響

sRNA-seq測(cè)序結(jié)果顯示，tDR-1：18-His-GTG-1-M3在PVY侵染后的本氏煙葉片中顯著下調(diào)（圖4A），tDR-1：18-His-GTG-1-M3是一個(gè)長(zhǎng)度為17nt未被表征的 5^′ -tRF，可以和tRNA（Niben101Scf01866t02014.1）實(shí)現(xiàn)0堿基錯(cuò)配（圖8A）。瞬時(shí)浸潤(rùn)抑制劑能夠極顯著降低tDR-1：18-His-GTG-1-M3在本氏煙葉片中的表達(dá)量（圖8B）。qRT-PCR檢測(cè)tDR-1：18-His-GTG-1-M3預(yù)測(cè)靶基因yabD、RNF-170、Eif2s3y的表達(dá)量（圖8C），結(jié)果顯示yabD和RNF170表達(dá)量顯著上調(diào)，表明抑制tDR-1：18-His-GTG-1-M3的表達(dá)量可以顯著提高yabD和RNF170的表達(dá)水平。

注：A，tDR-1：18-His-GTG-1-M3模型圖；B，tDR-1：18-His-GTG-1-M3抑制效率；C，tDR-1：18-His-GTG-1-M3預(yù)測(cè)靶基因表達(dá)水平。 Note：Ad tDR-1：18-His-GTG-1-M3.

3討論

植物病毒具有宿主特異，傳播途徑廣泛，以及潛伏期癥狀不顯著或無(wú)癥狀等特點(diǎn)，防治困難[1]，目前生產(chǎn)上尚無(wú)有效化學(xué)藥劑，主要依賴于植物自身的免疫反應(yīng)。植物與病原微生物在長(zhǎng)期博弈過(guò)程中不斷協(xié)同進(jìn)化，通過(guò)提高植物免疫相關(guān)基因的表達(dá)抑制病毒對(duì)其宿主基因的調(diào)控，成為防治植物病毒病的有效措施之一。此前，基于RNA干擾（RNAi）原理，miRNAs和siRNAs通過(guò)降解靶標(biāo)基因的mRNAs并在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)，一直以來(lái)備受關(guān)注[26]。然而，越來(lái)越多的研究表明，tsRNAs同樣具備調(diào)控基因表達(dá)的潛力[27-29]。本研究表明，PVY侵染后，本氏煙葉片和莖中的tsRNAs顯著差異表達(dá)。其中tDR-1：18-His-GTG-1-M3在本氏煙葉片中下調(diào)最為顯著。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，tDR-1：18-His-GTG-1-M3可以調(diào)控環(huán)指蛋白170基因（RNF170，Ringfingerprotein170）和yabD基因。RNF170作為一種與TLR3結(jié)合的E3連接酶，通過(guò)促進(jìn)TLR3降解來(lái)選擇性地抑制TLR3觸發(fā)的先天性免疫反應(yīng)[30-31]，是研究植物抗病性的潛在重要靶標(biāo)之一。

植物免疫負(fù)調(diào)控因子主要通過(guò)負(fù)向調(diào)控機(jī)制抑制免疫反應(yīng)，已有研究證實(shí)，敲除免疫負(fù)調(diào)控因子可以有效提高宿主抗病性，如BdWRKY19負(fù)調(diào)控活性氧（ROS）的產(chǎn)生，OsRFPH2-6負(fù)調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性，利用CRISPR/Cas9基因技術(shù)編輯以上基因可以顯著提高植株抗病性[32-33]。但是，CRISPR/Cas9基因技術(shù)操作流程相對(duì)復(fù)雜且周期較長(zhǎng)。后續(xù)，本研究將創(chuàng)制納米載體包裹遞送tsRNAs至植株體內(nèi)，調(diào)控植物免疫負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)水平，提高植物抗病性。同時(shí)，目前的研究認(rèn)為tiRNAs主要作為一種生物標(biāo)志物發(fā)揮作用。例如，tiRNAs應(yīng)用于檢測(cè)米諾環(huán)素大鼠神經(jīng)元PC12細(xì)胞缺血再灌注損傷的治療效果[19]。本研究后續(xù)還將進(jìn)一步篩選PVY侵染后差異表達(dá)顯著的tiRNAs標(biāo)志物，并用于評(píng)估tsRNAs納米遞送的干預(yù)效果。

4結(jié)論

本研究系統(tǒng)揭示了PVY侵染本氏煙后tsRNAs的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及分子機(jī)制。整合sRNA-seq與RNA-seq多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PVY侵染7d后，本氏煙葉片和莖中分別檢測(cè)到39種tiRNAs、119種tRFs顯著差異表達(dá)。sRNA-seq特征顯示24nttsRNAs為優(yōu)勢(shì)tsRNAs類型。其中， 5^′. -tRFs占差異tsRNAs總量的 43.26% 。關(guān)鍵差異表達(dá)分子tDR-1：18-His-GTG-1-M3在葉片中顯著下調(diào)，并通過(guò)靶向調(diào)控yabD和RNF170基因表達(dá)參與宿主轉(zhuǎn)錄調(diào)控。進(jìn)一步通路分析表明，PVY侵染可激活植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝及碳水化合物代謝等核心通路，闡明了植物響應(yīng)病毒入侵的多維度系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制。

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