牛筋草原生質體分離條件的研究

中圖分類號：Q943.1 文獻標志碼：A 文章編號：1003-935X（2025）02-0031-08

Isolation Conditions of Protoplasts in Eleusine indica

CUI Xinyu ^1，2 ， JIANG Hao ^1，2 ， TIAN Xingshan ¹ ， ZHANG Chun1 （1.Plant Protection Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of New Techniques for Plant Protection in Guangdong，Guangzhou 51O640，China; 2.School of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou 51O631，China）

Abstract：The isolation and cultivation of high-viability plant protoplastsserveas the foundation for studying plant physiology，biochemistry，andmolecularbiologyatthecellularlevel.However，duetothepresenceofacellwall surrounding plant protoplasts，thereare numerouschallnges in their isolationandculture.Inthisstudy，usingleaves andsheaths of the globall invasive weed Eleusine indicaas materials，single-factor experiments were conducted to optimize the conditions for protoplast preparation from E .indica，including material quantity，enzyme solution composition，enzymatic hydrolysis time，and centrifugation speed.High-activity protoplastsof E .indica were successfully obtained.Specifically，2 gof leaves from E .indicaplants at 5-6 leaf-stage were enzymatically hydrolyzed for 3 hours in a 10mL enzyme solution containing 1.0% cellulase， 0.5% macerozyme，and 0.5% pectinase.The protoplasts were then collected by centrifugation at 2 500r/min .The maximum protoplast yield reached 2.075× （204號 （204 10⁷ protoplasts/ g ， with over 90% viability.Furthermore，the yield of protoplasts prepared from leaves was higher than that from sheaths. This study established an optimized method for preparing protoplasts from E .indica leaves，laying the groundwork for studying the herbicide resistance mechanisms of E .indica at the single-cell level and providing a reference for the preparation of protoplasts from other grass weeds.

Key words： Eleusine indica ; protoplast; enzymatic hydrolysis ;single - cell sequencing

近年來，單細胞測序技術（scRNA-Seq）在生物醫(yī)學領域得到廣泛應用，但植物單細胞測序進展緩慢，難點之一是植物原生質體的分離與穩(wěn)定培養(yǎng)。scRNA-Seq已在少數(shù)植物物種中得到證實，包括模式植物（如擬南芥）、農(nóng)作物（如水稻）和生物能源作物（如楊樹）等[1]。Wang等利用scRNA-Seq技術闡明了茶葉中兒茶素酯代謝的復雜發(fā)育調節(jié)機制，挖掘出茶葉獨特味道的來源[2]；Liu等利用scRNA-Seq技術揭示了花生葉片分化發(fā)育軌跡[3]。目前國內外研究者從分子水平和組織水平開展了雜草抗藥性機制研究，如Pan等利用轉錄組測序技術（RNA-Seq）發(fā)現(xiàn)了光頭稗（Echinochloacolona）對草甘麟的非靶標抗性新機制[4]。筆者所在研究團隊利用基因組學技術，揭示了牛筋草中草甘麟靶基因復增驅動牛筋草抗草甘麟的新機制[5]。但傳統(tǒng)的分子和組學技術不足以揭示植物復雜性背后的特定細胞類型的分子機制;通過scRNA-Seq等新型生物技術，從單細胞水平研究雜草抗藥性機制的研究尚未見報道，主要制約因素之一是高質量植物原生質體的制備較難。除草劑的長期大量使用導致雜草抗性種群發(fā)生與發(fā)展，給農(nóng)田雜草防控帶來極大挑戰(zhàn)。雜草抗性機制研究是科學防控農(nóng)田雜草的前提。目前國際上雜草抗性機制研究主要集中在分子和組織水平。因雜草原生質體分離和培養(yǎng)技術不夠成熟，除草劑脅迫下雜草細胞層面上的活動鮮有研究。

植物原生質體是指除去細胞壁，由質膜包裹著的裸露細胞。酶解法是原生質體制備的常用方法，水稻、玉米和煙草等作物已有較成熟的原生質體分離體系，覆蓋到發(fā)育的不同階段[6。但由于不同植物的細胞壁組分不完全相同，因此不同植物原生質體提取和培養(yǎng)條件也不相同，甚至同一植物的酶解條件并不適用于所有品種。Jenes等以44種基因型水稻為材料，僅有20種基因型水稻品種成功分離到原生質體[7]。植物葉子、根、愈傷組織等均可用于制備原生質體，原生質體含有完整的遺傳物質，是研究植物生長調節(jié)、代謝以及響應外界脅迫生理過程的有力材料，還可用于遺傳轉化、基因瞬時表達、亞細胞定位等試驗的研究。利用模式植物擬南芥葉肉原生質體已開展了多種激素信號通路以及非生物和生物脅迫應激信號通路等分子研究[8]。趙小強利用早熟禾原生質體開展了體細胞雜交研究[。唐然等優(yōu)化了華南象草和菊花花瓣等原生質體的分離條件，并利用原生質體建立了瞬時轉化體系，用于基因工程和分子育種等研究[10-11] 。

牛筋草［Eleusineindica（L.）Gaertn.]是一年生禾本科穆屬植物，是一種全球性的農(nóng)田惡性雜草，在我國廣泛分布，尤其在華南地區(qū)發(fā)生危害嚴重[12]。本研究以牛筋草為材料，擬探明牛筋草原生質體制備的最佳酶解條件，包括材料用量、酶液組分、酶解時間和離心速率等，比較優(yōu)化后的酶解條件對牛筋草葉鞘和葉組織原生質體的提取效果，從而建立一種高效的牛筋草原生質體制備體系。旨在建立一種全球性惡性雜草牛筋草原生質體的制備方法，以期為從單細胞水平研究牛筋草相關科學問題提供技術支撐，也為其他禾本科雜草原生質體的制備提供參考。

1材料與方法

1.1 供試材料

供試牛筋草由廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所雜草研究室提供

1.2試劑配制與原生質體分離

1.2.1 酶解液的制備 主要試劑：纖維素酶RS、離析酶R-10、果膠酶Y-23均購自日本YakultHonsha公司;2-（ N- 嗎啡啉）乙磺酸（MES）、甘露醇、牛血清蛋白（BSA） ，NaCl，KCl，CaCl₂ 、巰基乙醇等生化試劑均購自于Solarbio公司。試驗所用W5溶液的配制：154mmol/LNaCl、125 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L MES（ pH 值5.7），用KOH將 pH 值調至5.8；在高壓滅菌鍋 0.1MPa.121.3^qC 條件下滅菌10～30min 。酶解液配制： 0.6mol/L 甘露醇、10 mmol/L MES、0. 1% BSA、1 mmol/L CaCl₂ 、5 mmol/L β- 巰基乙醇。

酶液配制：稱量 _1.092g 甘露醇和 0.0195g MES加入水中；用容量瓶定容至 10mL ，將該溶液轉移至 10mL 燒杯中；清洗 pH 計，用1mol/LKOH調節(jié) pH 值至5.7；繼續(xù)加人 _0.1g 纖維素酶RS，0.05g 離析酶R-10和 0.05g 果膠酶Y-23（以上步驟全部在磁力攪拌器上進行，待溶液澄清后用保鮮膜封口）；在 55^qC 水浴鍋中水浴 10min ；室溫（ 25°C ）放置使酶液溫度降至室溫；繼續(xù)加入0.01gBSA，10μL 1mol/LCaCl₂ 母液， 7μL 巰基乙醇。攪拌 10min 以上，避光保存，若多次使用可分管保存至 -20^°C 冰箱。凍存的酶液重新解凍后，在磁力攪拌器上充分攪拌，直至白色沉淀完全溶解，待用。

1.2.2原生質體的分離參照油莎豆原生質體的分離方法[13]，利用酶解法分離牛筋草原生質體，主要步驟如下：（1）從5～6葉期的牛筋草植株上剪下葉片 1～2g 。吸取 2mL 預冷的 0.6mmol/L 甘露醇溶液浸泡，用刀片將葉片切成 1mm 的細段，盡量一刀切碎不要反復切割，避免細胞受到損傷。將其轉移至預冷的 0.6mmol/L 甘露醇溶液中，避光放置 10～20min 。（2）吸棄甘露醇，加入10mL 酶解液，用封口膜密封，在 28°C70r/min 搖床中避光酶解 ³h 。（3）用300目的細胞過濾器過濾酶解液。（4）將濾液貼壁移至圓底離心管，室溫下 1500r/min 離心 10min 。（5）小心取出離心管，輕輕吸棄上清液。加入 3mL W5溶液到離心管中，上下緩慢顛倒混勻， 1500r/min 離心 10min 。（6重復“步驟（5）\"1次，至上清液變明亮。將原生質體溶于 1mL W5溶液中，置于冰上避光保存。

1.2.3原生質體的觀察與計數(shù)采用血球計數(shù)板對牛筋草原生質體產(chǎn)量進行檢測。吸取少量純化后的原生質體懸浮液于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下觀察計數(shù)，統(tǒng)計原生質體的產(chǎn)量，重復3次。計數(shù)時一定要保持顯微鏡載物臺水平，不能傾斜，逐次計算中央大方格內25個中方格里的原生質體。計數(shù)規(guī)則為記上不計下，計左不計右。然后再根據(jù)下式求出 1mL 懸浮液中原生質體的數(shù)量：1mL 懸浮液中的原生質體數(shù)量 μ=1σ 個大方格0 （0.1mm³ ）懸浮液中的原生質體數(shù) ×10⁴ 。之后再根據(jù)每個處理組提取液的體積計算總原生質體數(shù)量，然后根據(jù)材料用量計算得出 1g 材料（如葉片）所能提取的原生質體數(shù)量。

1.2.4原生質體活力的測定采用熒光素二乙酸酯（fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA）對原生質體的活力進行染色鑒定。FDA用丙酮配制成 5mg/mL 溶液，然后取 500μL 原生質體懸浮液，加入 5μL 5mg/mL FDA，輕輕混勻后染色 10min 。取 10μL 在熒光顯微鏡下檢測其活力，用血細胞計數(shù)板觀察計數(shù)。同一視野范圍內熒光條件下統(tǒng)計綠色熒光的原生質體數(shù)量（有活力）以及白光條件下統(tǒng)計原生質體總數(shù)量，隨機選擇10個視野。每個樣品3次技術重復。原生質體活力計算公式如下：原生質體活力 Σ=Σ 綠色熒光的原生質體數(shù)量/原生質體總數(shù) ×100% 。

1.3 試驗設計

1.3.1最佳酶液組分和濃度的確定本試驗在甘露醇預處理后，分別加入不同組分的酶液（表1）進行酶解，以確定最佳酶液組分和質量分數(shù)，其他試驗條件均同“1.2.2”節(jié)。

1.3.2最佳組織部位的確定分別選取牛筋草植株的葉鞘和葉片，進行原生質體制備的最佳組織部位篩選。除試驗材料選取的組織部位不同外，其他試驗條件均同“1.2.2”節(jié)。

1.3.3材料用量的確定在最佳組織部位的基礎上，分別取 _{0.5，1.0，2.0g} 牛筋草嫩葉，進行原生質體制備最佳材料用量的確定，其他試驗條件均同“1.2.2\"節(jié)。

1.3.4最適離心速率的確定在最佳組織部位和最佳材料用量的基礎上，分別以500、1500、2500r/min 的離心速率對濾液進行離心，其他試驗條件均同\"1.2.2”節(jié)。

1.3.5最適酶解時間的確定在甘露醇預處理后，分別設置酶解時間為 ^{1，2，3h} ，其他試驗條件均同“1.2.2”節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用IBMSPSS25軟件對上述試驗數(shù)據(jù)進行多重比較分析，采用最小顯著性差異法（ LSD） 進行差異顯著性判定（ α=0.05 ）。

2 結果與分析

2.1酶液組分和濃度對牛筋草原生質體產(chǎn)量的影響

纖維素酶和離析酶是酶解法分離植物原生質體常用的關鍵酶，果膠酶次之，三者的不同用量組合會影響牛筋草原生質體產(chǎn)量和活力[14]。為了篩選高質量制備牛筋草原生質體的酶組合用量，設置了7種不同用量水平的纖維素酶、離析酶和果膠酶組合進行篩選。由表2可知，單獨使用纖維素酶、離析酶和果膠酶時，纖維素酶提取牛筋草原生質體的產(chǎn)量最高，離析酶和果膠酶無顯著差異，但均顯著低于纖維素酶（ Plt;0.05） ?？梢娎w維素酶在牛筋草原生質體制備中起主要作用。隨著纖維素酶的用量從 1.0% 增加到 2.0% （組合4和組合5），牛筋草原生質體的產(chǎn)量顯著增加（ Plt; 0.05）。離析酶用量對牛筋草原生質體的制備也產(chǎn)生較大影響，隨著離析酶用量從 0.5% 增加到1.0% （組合4和組合6），牛筋草原生質體產(chǎn)量也顯著增加（ Plt;0.05） 。整體而言，當酶液組合用量為 1.0% 纖維素酶 +0.5% 離析酶 +0.5% 果膠酶（組合7）時，牛筋草原生質體的產(chǎn)量最高，達到1.675×10⁷ 個 ，是7個組合中制備牛筋草原生質體的最優(yōu)組合。

2.2酶解體系對葉片和葉鞘組織的提取效果

不同組織的細胞類型、細胞結構和細胞數(shù)目可能存在差異，這也是影響原生質體制備效果的關鍵因素[14]。為了能夠高效制備牛筋草原生質體，比較了優(yōu)化后的酶解體系對 5～6 葉齡期牛筋草葉鞘和葉片組織的原生質體提取效果。在相同的酶解條件和相同重量組織材料下，葉片的原生質體產(chǎn)量較高，達到 2.8×10⁶ 個 /g ，葉鞘的原生質體產(chǎn)量略低，約 2.5×10⁶ 個 ??/g ，牛筋草的葉片分離出的原生質體的活力略大于葉鞘，但兩者無顯著差異，均在 90% 左右（表3和圖1）。從原生質體的細胞形態(tài)來看，葉片和葉鞘組織之間的差異比較明顯：葉鞘的原生質體明顯小于葉片的原生質體，且葉鞘的原生質體中葉綠體較少，顏色較淺，大多數(shù)細胞是透明的，而葉片中的原生質體較大且顏色深，葉綠體含量較多（圖2）。因此，用牛筋草葉片與葉鞘組織制備原生質體的效果表現(xiàn)為幼嫩葉片 gt; 幼嫩葉鞘，即幼嫩葉片是制備牛筋草高質量原生質體的理想材料。

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05 ），下表同。

A、B分別為熒光染色后牛筋草葉片、葉鞘原生質體在10倍物鏡下的視野

2.3材料用量對牛筋草原生質體產(chǎn)量的影響材料用量是影響原生質體制備效率的重要因素之一，濃度、體積一定的酶液所能酶解消化的植物材料是有限的。從表4可知，隨著牛筋草葉片材料用量的增加，原生質體的產(chǎn)量也顯著增加（ Plt;0.05. ）。當葉片材料用量為 2.0g 時，牛筋草原生質體的產(chǎn)量最高，達 2.075×10⁷ 個 /g 。可見10mL 由 1.0% 纖維素酶 +0.5% 離析酶 +0.5% 果膠酶組合的酶液的酶解能力以 2.0g 牛筋草葉片為宜。

2.4離心速率對牛筋草原生質體產(chǎn)量的影響

植物材料經(jīng)酶解后需通過低速離心進行分離純化。其中離心速率的選擇對原生質體的分離效果至關重要。由表5可知，當離心速率從500r/min 提升到 1500r/min 時，原生質體數(shù)量顯著增加（ Plt;0.05. ）。當離心速率從 1500r/min 提升到 2500r/min 時，原生質體數(shù)量無顯著差異。因此 1500～2500r/min 是牛筋草原生質體純化時的最佳離心速率范圍。

2.5酶解時間對牛筋草原生質體產(chǎn)量的影響

適宜的酶解時間是原生質體產(chǎn)量和活力的重要保障[13]。由表6可知，牛筋草原生質體產(chǎn)量隨著酶解時間的延長呈現(xiàn)顯著增加的趨勢。酶解時間從^1h 增加到 ^3h ，原生質體產(chǎn)量從較低水平（ 2.5× 10⁵ 個 /g ）逐漸達到較高水平 （5.0×10⁶ 個 /g ；因此，在本組試驗中牛筋草原生質體制備的最優(yōu)酶解時間為 ³h ，原生質體產(chǎn)量達 5.0×10⁶ 個/g。

3討論與結論

植物原生質體可以通過機械分離法或酶解分離法分離出來，機械分離主要是將細胞放在高滲糖溶液中使材料質壁分離，然后通過磨碎植物組織從傷口釋放出完整的原生質體[14]。該方法操作困難、適用范圍小、所得到的原生質體活性低[14-15]。相比之下，酶解法分離原生質體操作簡單、效率高，適用范圍廣，是目前常用的植物原生質體制備方法[9]

酶解液的組分及濃度是影響原生質體分離的關鍵因素[9]。植物細胞的細胞壁主要成分是纖維素、果膠及少量半纖維素，因此，植物原生質體分離研究中一般采用纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、離析酶等進行分離[16]。不同植物或同一植物不同部位細胞的細胞壁成分和比例不完全相同[17]，不同植物最適酶解液的組分及濃度與其細胞壁組分相關。史曉朋的研究表明，由于甘蔗細胞壁含半纖維素較少，當半纖維素酶濃度從 0.3% 提高到 1.0% 時，甘蔗原生質體的產(chǎn)量及活力均下降，過多的半纖維素酶會導致細胞引起損傷[；禾本科植物的細胞壁果膠含量較低，當在酶液中含有較高濃度的果膠酶時會影響早熟禾原生質體的活力，一般禾本科植物采用較低濃度的果膠酶（0.5% ）[18]。郭艷萍研究發(fā)現(xiàn)，離析酶的濃度對原生質體的產(chǎn)量影響很大，適宜的離析酶濃度可以顯著提高原生質體的產(chǎn)量[19]。本試驗比較了7種不同酶配比組合對牛筋草葉片原生質體分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)在酶解時間、離心速率等其他試驗條件一致的情況下，隨著纖維素酶濃度從 1.0% 提高至 2.0% ，牛筋草原生質體的產(chǎn)量顯著增加（ Plt;0.05 ），細胞數(shù)量增加了1倍，這說明牛筋草葉片細胞中細胞壁的纖維素含量較高。離析酶和果膠酶濃度的升高也對牛筋草原生質體的分離效果產(chǎn)生顯著影響，尤其是加入 0.5% 果膠酶后，牛筋草原生質體的產(chǎn)量達到最高，這與早熟禾和野大麥幼穗原生質體分離條件[9.20]相似。

酶解時間是影響原生質體分離的重要因素[9]。植物原生質體分離的適宜酶解時間一般為2～12h ，不同植物或不同組織部位的最適酶解時間有所差異[13]，如杉木葉片為 3h^[21] 、黑枸杞葉片為 5h^[22] 、牡丹葉片為 6h^[23] 、棉花真葉為 9h^[24] 0在本試驗中隨著酶解時間的延長，牛筋草原生質體產(chǎn)量顯著增加（ Plt;0.05 ），其最優(yōu)酶解時間為³h ，原生質體產(chǎn)量達 5.0×10⁶ 個/g。但由于 ³h 為本試驗設置的最長酶解時間，因此若繼續(xù)延長酶解時間至 或更長，牛筋草原生質體的產(chǎn)量可能會更高。

在原生質體分離過程中，離心速率對原生質體的顯微形態(tài)、完整性和純化效果影響較大[16]史曉朋研究發(fā)現(xiàn)，當離心速率從 500r/min 增加到800r/min 后，甘蔗原生質體產(chǎn)量大幅度增加，當由800r/min 增加至 1200r/min 時，甘蔗原生質體產(chǎn)量增加很少[16]。本試驗結果表明，當離心速率從500r/min 提升到 1500r/min 時，牛筋草原生質體數(shù)量顯著增加（ Plt;0. 05 ）。當離心速率從1500r/min 提升到 2500r/min 時，兩者的原生質體數(shù)量無顯著差異。

植物的根、葉鞘、葉片、花粉、子葉等組織部位均能用于原生質體制備[18，25-28]。植物幼嫩組織如幼葉、幼根、幼葉鞘等生長狀態(tài)良好且具有較高的細胞分裂能力，一般能夠制備出高產(chǎn)量、高活力的原生質體[29-30]。有研究表明，葉片含有大量的具有完整細胞結構的細胞，葉片中的細胞易分解，酶解后能長時間保持細胞形態(tài)，易于獲得生理狀況與遺傳學特性較為一致的原生質體[31]，常作為植物原生質體制備的首選組織材料[32]。安靜等研究發(fā)現(xiàn)，采用6～8葉期牛筋草的莖作為試驗材料，酶解 ⁴h 后可得到形態(tài)較好的牛筋草原生質體[33]。本研究以5～6葉期的牛筋草作為試驗材料，酶解 ³h 后分別從牛筋草的葉片和葉鞘中分離出原生質體，發(fā)現(xiàn)用葉片制備的原生質體細胞形態(tài)更好，產(chǎn)量和活力也略高于葉鞘。因此，相比于葉鞘，牛筋草葉片是制備原生質體更為適宜的試驗材料。

綜上所述，本研究以5～6葉期牛筋草葉片為材料，通過多個單因素試驗對牛筋草原生質體制備的組織部位、材料用量、離心速率、酶解條件等進行篩選與優(yōu)化，分離制備出高質量牛筋草原生質體，建立了牛筋草葉片原生質體分離體系。最適條件為： 2.0g 幼嫩的牛筋草葉片，在 10mL 由1.0% 纖維素酶 +0.5% 離析酶 +0.5% 果膠酶組成的酶液中酶解 ^3h ，以 2 500r/min 的離心速率進行純化，牛筋草原生質體的產(chǎn)量可達 2.075×10⁷ 個/ ，活力為 90% 左右。本研究建立了高效制備牛筋草原生質體的技術方法，可為后續(xù)從單細胞水平解析牛筋草等禾本科雜草的生物學特征、脅迫應答、遺傳轉化等科學研究提供技術支撐。

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