一株肉種雞坦布蘇病毒的分離鑒定及致病特點(diǎn)研究

王友 李培勇 段寶敏

摘 要：2010年坦布蘇病毒傳入我國，對(duì)我國養(yǎng)鴨業(yè)造成損失。隨后發(fā)現(xiàn)，此病毒也能夠感染雞群，對(duì)養(yǎng)雞場(chǎng)生物安全形成威脅。本研究從發(fā)生不明原因產(chǎn)蛋率下降的肉種雞中分離到一株坦布蘇病毒HB20210株，發(fā)病雞群主要剖檢病變?yōu)槁雅菽こ鲅吐雅菀夯壬诚到y(tǒng)病變。將分離株接種到DF-1細(xì)胞和SPF雞胚中，48 h后即可出現(xiàn)明顯病變。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，胸肌注射、頸部皮下注射和灌服的攻毒方式造成的病毒血癥持續(xù)時(shí)間均為5 d。將分離株進(jìn)行肉種雞回歸試驗(yàn)，卵泡會(huì)出現(xiàn)顯著病變。E蛋白氨基酸同源性和進(jìn)化樹分析表明，分離株HB202010與活疫苗FX2010-180P株、滅活疫苗DF2株、HB株屬于同一分支，均為中國分離株II分支，并且與滅活疫苗DF2株和HB株同源性最高，可達(dá)99.0%。HB20210株的分離鑒定為進(jìn)一步探討該病毒對(duì)種雞產(chǎn)蛋性能的影響和完善種雞場(chǎng)防控方法奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：TMUV；肉種雞；分離鑒定

中圖分類號(hào)：S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1673-1085（2024）06-0017-10

坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）恩塔亞（Ntaya virus group）病毒群的一員。該病毒為單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)度為10 990 bp，包含一個(gè)開放閱讀框（ORF），總共編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（核衣殼蛋白、PrM蛋白和囊膜蛋白E）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。其中，E蛋白是TMUV最大的結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)也是該病毒的主要毒力抗原，包含多個(gè)抗原決定簇，在病毒的吸附、復(fù)制和生物合成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。

2010年TMUV傳入中國，該病主要影響鴨的生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致蛋鴨產(chǎn)蛋量顯著下降，表現(xiàn)為卵巢出血、卵泡破裂和卵泡膜出血，嚴(yán)重制約著我國水禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。此外，TMUV感染宿主譜擴(kuò)至雞、鵝、麻雀和小鼠，對(duì)家禽養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全和公共衛(wèi)生安全造成威脅。

本研究從發(fā)生不明原因產(chǎn)蛋率下降的肉種雞場(chǎng)中分離到一株TMUV，接種細(xì)胞、SPF雞胚、肉種雞后出現(xiàn)明顯病變，并對(duì)其編碼E蛋白的基因進(jìn)行了同源性和進(jìn)化樹分析，為種雞場(chǎng)防控TMUV提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 主要材料

1.1.1? 病料來源? 某規(guī)模化肉種雞場(chǎng)34周齡種雞出現(xiàn)不明原因產(chǎn)蛋下降，嚴(yán)重的雞舍產(chǎn)蛋率下降近30%，剖檢主要病變?yōu)槁雅菽こ鲅吐雅菀夯杉哂忻黠@病變雞只的氣管、肺臟、肝臟、脾臟和卵泡膜等組織進(jìn)行病原的檢測(cè)和分離。

1.1.2? SPF雞胚、細(xì)胞系? SPF雞胚、200日齡SPF雞購自濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司；200日齡肉種雞購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；DF-1細(xì)胞系由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司保存。

1.1.3? 主要試劑與儀器? 1PBS、2×Taq Master Mix、One-Step RT-PCR試劑盒和1×TAE電泳緩沖液購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；核酸自動(dòng)提取儀購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PCR儀、凝膠電泳儀和凝膠成像儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.1.4? 引物設(shè)計(jì)及合成? 分別設(shè)計(jì)新城疫病毒（NDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽流感病毒（AIV H9）、雞滑液囊支原體（MS）、雞減蛋綜合征病毒（EDSV）和坦布蘇病毒（TMUV）引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體引物序列、目的基因和片段大小見表1。

PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，60 ℃退火15 s；72 ℃延伸1.5 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

RT-PCR程序?yàn)椋?0 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1.5 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2? 方法

1.2.1? 病料PCR和RT-PCR檢測(cè)? 無菌取氣管、肺臟、肝臟、脾臟和卵泡膜等組織，剪碎后加入5 mL無菌PBS進(jìn)行研磨，-80 ℃反復(fù)凍融3次后，12 000 rpm離心10 min，取上清經(jīng)0.22 m微孔膜過濾。濾液使用全自動(dòng)核酸提取儀提取DNA和RNA，再進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后使用凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。

1.2.2? 雞胚分離病毒? 將1.2.1中檢測(cè)為TMUV陽性的上清液經(jīng)尿囊腔接種9日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL。接種后放入37 ℃孵化箱，每日照胚，若雞胚死亡，觀察胚體變化，收獲胚體和尿囊液。繼續(xù)傳代，連傳3代；若雞胚存活，則在第6天采集胚體和尿囊液繼續(xù)傳代，連傳3代。對(duì)胚體和尿囊液進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測(cè)NDV、IBV和TMUV等。

1.2. 3? 細(xì)胞分離病毒? 使用DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%時(shí)接種1.2.1中檢測(cè)為TMUV陽性的上清液。接種后每日觀察，待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上，收取細(xì)胞和上清液，連傳3代；若未出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變則每3天傳代1次，連傳3代。對(duì)F3代細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測(cè)NDV、IBV和TMUV等。

1.2.4? 坦布蘇病毒E蛋白基因克隆及測(cè)序分析? 用細(xì)胞分離的純凈病毒液提取RNA后進(jìn)行RT-PCR，回收目的條帶，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。涂布抗性平板后，37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，采用Megalign序列比對(duì)程序，使用MEGA7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，參考毒株信息見表2。

1.2.5? 不同途徑感染TMUV病毒血癥的持續(xù)時(shí)間? 將30只200日齡的SPF雞隨機(jī)分為3組，每組10只，分別通過胸肌注射、頸部皮下注射和灌服的方式進(jìn)行攻毒。攻毒后一周內(nèi)，每天采集血液，分離出血清后接種DF-1細(xì)胞，進(jìn)行TMUV的分離鑒定，具體方法參照1.2.3。

1.2.6? 動(dòng)物回歸試驗(yàn)? 選用200日齡的肉種雞進(jìn)行回歸試驗(yàn)，4只肉種雞通過胸肌注射方式進(jìn)行攻毒，每只雞注射0.5 mL病毒液，2只肉種雞胸肌注射等體積生理鹽水作為陰性對(duì)照組。攻毒后2 d采集血清進(jìn)行TMUV的分離鑒定，攻毒后8 d進(jìn)行剖檢，記錄病變。

2? 結(jié)果

2.1? 發(fā)病雞群臨床癥狀及剖檢病變

主要臨床癥狀為產(chǎn)蛋率突然下降，病雞精神萎頓，食欲不振，拉稀，有綠便和白色糞便。主要剖檢病變?yōu)樾募〕溲⑿墓谥境鲅▓D1A），腹部脂肪出血（圖1B），卵泡膜出血（圖1C）和卵泡液化（圖1D）。

2.2? 病料PCR和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，病料中僅檢出TMUV為陽性，NDV、IBV和AIV等病原均為陰性。

2.3? TMUV分離鑒定

SPF雞胚接種病毒液后，死亡時(shí)間為48～120 h，死亡雞胚可見絨毛尿囊膜水腫，胚體水腫、出血和肝臟腫脹等病變，見圖2B。尿囊液和胚體經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，僅檢出TMUV陽性，NDV、IBV和AIV等病原均為陰性。

DF-1細(xì)胞接種病毒液后48 h開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞堆聚，圓縮，直至脫落，見圖2D。F3代細(xì)胞上清液經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，僅檢出TMUV陽性，NDV、IBV和AIV等病原均為陰性。分離株命名為HB202010株。

2.4? 坦布蘇病毒E蛋白基因同源性及進(jìn)化樹分析

氨基酸同源性分析表明，分離株HB202010與參考株的同源性在94.4%～99.0%，與活疫苗株WF100同源性最低，與滅活疫苗株DF2和HB同源性最高，見圖3。進(jìn)化樹分析表明，分離株HB202010與活疫苗株FX2010-180P和滅活疫苗株DF2、HB屬于同一分支，均屬于中國分離株II，但與活疫苗WF100株不屬于同一分支，見圖4。

2.5? 不同途徑感染TMUV病毒血癥的持續(xù)時(shí)間

血清中TMUV分離鑒定結(jié)果表明，三種攻毒方式的病毒血癥持續(xù)時(shí)間均為5 d，并且在2～3 d分離率最高。胸肌注射的方式在攻毒后3 d分離率均保持在100%，結(jié)果見圖5。

2.6? 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

肉種雞攻毒后2 d，血清中病毒分離率為100%；攻毒后8 d卵泡病變率為100%，主要表現(xiàn)為卵泡膜出血（圖6A）和卵泡液化（圖6B）。

3? 討論

2010年4月，一種新型鴨的傳染病迅速在我國華東和華北地區(qū)傳播，以蛋鴨產(chǎn)蛋量急速下降，卵泡膜和卵泡病變?yōu)橹饕卣鱗2-3]。經(jīng)研究證實(shí)，該疾病是由一種新型黃病毒引起的，并且是國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)對(duì)鴨群致病的黃病毒[4-5]。最終在2011年召開第一屆水禽疫病防控研討會(huì)期間，中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)將該傳染病正式統(tǒng)一命名為“鴨坦布蘇病毒”。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)TMUV具有以下突出特點(diǎn)：第一，傳播方式的變化。不同于傳統(tǒng)的黃病毒大多數(shù)通過蟲媒傳播，TMUV在蚊蟲較少的秋冬季仍呈大范圍流行。因此，該病的傳播不完全依賴于蚊子等蟲媒，其傳播媒介已經(jīng)發(fā)生改變。2018年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所首次闡明我國部分流行病毒株由于第156位氨基酸突變，從而獲得了空氣傳播的能力，證實(shí)了TMUV的傳播可不完全依賴蚊子[6]。第二，致病性的變化。1955年，TMUV首次在馬來西亞吉隆坡的蚊子體內(nèi)分離得到，之后在馬來西亞其他地區(qū)以及泰國等東南亞地區(qū)也有在家禽上分離到此病毒的報(bào)道，但對(duì)禽類無顯著致病性[7]。自2010年傳入我國后，該病毒致病性顯著增強(qiáng)，能夠?qū)е碌傍喡雅菽こ鲅?，卵泡變形、萎縮和液化，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量急劇下降，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。第三，宿主譜的變化。起初TMUV以感染鴨為主，2012年有報(bào)道表明也能夠感染雞和鵝等禽類[8-9]。隨后研究表明，TMUV也能夠感染麻雀，并且推測(cè)麻雀可能是TMUV傳播的重要媒介[10]。2013年，Li等研究表明，TMUV能夠感染哺乳動(dòng)物小鼠，具有公共衛(wèi)生安全隱患[11]。同年，Tang等研究顯示，在TMUV感染的養(yǎng)鴨場(chǎng)中，工人血清中TMUV抗體陽性率為71.9%，而咽拭子的病毒陽性率達(dá)47.7%[12]。本研究從肉種雞場(chǎng)分離到一株TMUV，發(fā)病雞群主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振和產(chǎn)蛋量下降，剖檢病變主要為卵泡膜出血和卵泡液化。經(jīng)檢測(cè)IBV、EDSV和MS等影響產(chǎn)蛋率的病原均為陰性，最終確定為TMUV感染。這提示我們，對(duì)于周圍有養(yǎng)鴨場(chǎng)的種雞場(chǎng)，當(dāng)出現(xiàn)不明原因產(chǎn)蛋下降，且常規(guī)病原無法檢出時(shí)，TMUV也可以列為主要的排查項(xiàng)。肉種雞感染TMUV后通常具有以下特點(diǎn)：初產(chǎn)或產(chǎn)蛋高峰期發(fā)病，具體表現(xiàn)為27～28周產(chǎn)蛋爬坡速度慢，無產(chǎn)蛋高峰，或是產(chǎn)蛋高峰期出現(xiàn)產(chǎn)蛋率大幅度下降，下降時(shí)間20 d左右，下降幅度15%～30%。在同一個(gè)雞場(chǎng)內(nèi)從第一棟發(fā)病雞群到最后發(fā)病雞群歷時(shí)一個(gè)月左右，傳播速度相對(duì)較慢。發(fā)病期間死亡率會(huì)略有上升，日死亡率在0.13%～0.27%，整個(gè)發(fā)病期死亡率約為2%。

通常情況下，雞胚、鴨胚都可以用來分離TMUV。據(jù)報(bào)道，將病毒經(jīng)尿囊腔或絨毛尿囊膜接種雞胚或鴨胚后3～6 d，可觀察到胚體出血水腫，絨毛尿囊膜水腫，肝腎出血腫大、壞死等病變[3]。研究表明，鴨源的TMUV在鴨胚中連續(xù)傳代100次，其致病性會(huì)增強(qiáng)，但在雞胚中傳代100次，致病性會(huì)減弱[13]。本研究使用SPF雞胚分離病毒，雞胚在接種后48～120 h之間全部死亡，并且能夠在胚體和尿囊液中檢出TMUV。死亡雞胚的主要病變?yōu)榻q毛尿囊膜水腫，胚體水腫、出血和肝臟腫脹。除鴨胚和雞胚外，TMUV也可在禽類細(xì)胞DF-1、LMH、CEF、DEF和哺乳類細(xì)胞Vero、HEK293T、HCT116、A549中增殖[14]。本研究使用DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離，在接種48 h后即可出現(xiàn)典型細(xì)胞病變。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，肉種雞感染TMUV后有卵泡出血和液化等典型病變。此外，本研究結(jié)果表明，TMUV感染后病毒血癥持續(xù)時(shí)間為5 d，并且胸肌注射的攻毒方式能夠保持較高的病毒分離率。

E蛋白是TMUV的主要表面結(jié)構(gòu)蛋白，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要抗原。有研究表明，E蛋白不僅介導(dǎo)了病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附，還能夠與宿主細(xì)胞膜融合，參與侵入宿主細(xì)胞的過程[15]。因此，通常將編碼E蛋白的基因作為TMUV進(jìn)化分析的主要參考基因。于觀留對(duì)東南亞和我國大陸78株TMUV代表株的開放閱讀框（ORF）、E基因、NS1基因、NS3基因和NS5基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析，將當(dāng)前TMUV主要分為馬來西亞（1955）、馬來西亞（2012）、泰國（2013）和中國分離株I和中國分離株II五大分支，并且中國分離株II分支為中國流行優(yōu)勢(shì)分支[16]。本研究通過對(duì)編碼E蛋白的基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明分離株HB202010同樣被分到了中國分離株Ⅱ，并且與同一分支內(nèi)的其他參考株的氨基酸同源性在97.6%～99.0%，說明此分離株的變異程度不大。

由于目前缺乏治療TMUV感染的有效藥物，除做好嚴(yán)格的生物安全防控措施外，疫苗免疫是阻斷TMUV傳染的最有效手段。目前我國獲批的疫苗有“鴨坦布蘇病毒滅活疫苗（HB株和DF2株）”和“鴨坦布蘇病毒病活疫苗（WF100株和FX2010-180P株）”。疫苗的應(yīng)用在保護(hù)鴨群免受TMUV感染起到了重要作用。本研究中分離株HB202010與疫苗株HB、DF2和FX2010-180P均屬于同一分支。鑒于近年來TMUV感染雞的報(bào)道逐漸增多，對(duì)于風(fēng)險(xiǎn)較高的種雞場(chǎng)可以在開產(chǎn)前進(jìn)行疫苗免疫，以保證產(chǎn)蛋期抗體滴度能有效抵御TMUV感染。

4? 結(jié)論

本文分離到一株肉種雞源TMUV，接種DF-2細(xì)胞和SPF雞胚后會(huì)出現(xiàn)明顯病變，動(dòng)物回歸試驗(yàn)肉種雞也會(huì)出現(xiàn)卵泡出血和卵泡液化等典型病變。對(duì)編碼E蛋白的基因進(jìn)行進(jìn)化樹和同源性分析，結(jié)果表明，與中國其他分離株相比，此分離株變異程度不大。本研究為進(jìn)一步探討該病毒對(duì)種雞產(chǎn)蛋性能的影響奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Isolation， Identification and Pathogenic Characteristics of a Strain of Tembusu Virus from Chicken Breeds

WANG You*， LI Peiyong*， DUAN Baomin

（Tianjin Ringpu Bio-technology Co.， Ltd.， Tianjin 300000， China）

Abstract： In 2010， Tembusu virus was introduced into China， causing significant losses to the duck farming industry. Subsequently， it was found that Tembusu virus could also infect chickens， posing a threat to the biosafety of chicken farms. In this study， a strain of Tembusu virus， designated as HB202010， was isolated from a chicken breed flock experiencing unexplained egg production drop. Lesions observed in the organs and tissues of infected chicken breeds specifically unveiled reproductive system abnormalities， including follicular membrane bleeding and follicular liquefaction. The isolated strain was inoculated into DF-1 cells and SPF chicken embryos， resulting in noticeable pathological changes within 48 hours. Animal experimental results indicated that virus viremia durations were consistently 5 days following intramuscular injection， subcutaneous injection in the neck， and oral administration of the challenge. Moreover， upon reintroduction of the isolated strain of Tembusu virus into chicken breed， significant lesions in the follicles were observed. Amino acid homology and phylogenetic tree analysis of the E protein indicated that the isolated strain HB202010 belonged to the same branch as the live vaccine strain FX2010-180P， and inactivated vaccine strains DF2 and HB， all falling under the China Isolate II branch. The isolated strain exhibited the highest homology with inactivated vaccine strains DF2 and HB， reaching 99.0%. The isolation and identification of Tembusu virus from chicken breeder lay a solid foundation for further exploring the impact of this virus on the egg production performance of chicken breeder and improving preventive and control measures in chicken breeder farms.

Keywords： Tembusu virus; chicken breeder; isolation and identification