引起奶牛關(guān)節(jié)炎的牛支原體病原的分離鑒定

曹登慧

摘要：試驗通過細(xì)菌分離培養(yǎng)及分子生物學(xué)診斷技術(shù)對一起引起奶牛關(guān)節(jié)炎的病原進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，該病原菌落形態(tài)為“油煎蛋樣”，牛支原體16S rRNA和uvrC均擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，且16S rRNA和uvrC基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與牛支原體在同一分枝。說明引起該奶牛關(guān)節(jié)炎的病原菌為牛支原體。

關(guān)鍵詞：牛支原體；關(guān)節(jié)炎；分離鑒定

中圖分類號：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2016）09-0011-02

牛支原體（Mycoplasma bovis）是一種能夠引起牛發(fā)生肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、懷孕母牛流產(chǎn)、不孕、生殖道感染等的疾病[1]，在環(huán)境等應(yīng)激因素的作用下還可引起多種疾病的繼發(fā)感染。1961年Hale等[2]在美國首次從患乳腺炎的牛乳中分離到該病原，1976年首次報道與牛呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)。目前，該牛支原體病原在世界范圍內(nèi)廣泛流行，并對各國的養(yǎng)牛行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響和制約了各國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[3]。1983年，我國黎濟(jì)申首次報道從乳房炎牛乳中分離到牛支原體。自2008年以來，我國部分地區(qū)從外地引進(jìn)的肉牛暴發(fā)了以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺炎疫情，發(fā)病率為50%～100%，病死率高達(dá)10%～50%，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]，此后重慶、內(nèi)蒙、貴州、寧夏等多省報道了肉牛和奶牛發(fā)生了牛支原體病[5，6]，因此牛支原體在牛養(yǎng)殖過程中也成為危害性較大的病原體之一，但國內(nèi)很少有關(guān)于牛支原體感染成年母牛引起關(guān)節(jié)腫大的報道。

2015年12月，寧夏某奶牛場出現(xiàn)成年奶牛關(guān)節(jié)腫大癥狀，患病母牛是從甘肅地區(qū)新采購的泌乳母牛，購買時均未發(fā)現(xiàn)其有關(guān)節(jié)腫大癥狀，于購回后一周出現(xiàn)四肢關(guān)節(jié)腫大現(xiàn)象，雖用抗生素進(jìn)行治療，但未能治愈。該成年母牛除關(guān)節(jié)腫大外未表現(xiàn)出咳嗽、肺部聽診呈濕啰音等癥狀。為確定引起該牛關(guān)節(jié)腫大的病原體，在無菌條件下采取成年奶牛關(guān)節(jié)積液若干份進(jìn)行了病原的分離培養(yǎng)及鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

1.1.1 病料 無菌采集的寧夏某牛場關(guān)節(jié)腫大奶牛的關(guān)節(jié)液。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 主要試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP209-02），瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP302-02），天根生化科技有限公司；D2500-50Omega-瓊脂糖凝膠回收試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。主要儀器：CO2培養(yǎng)箱、PCR擴(kuò)增儀、電泳凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 方法

將關(guān)節(jié)液接種于改良的Thiaucourt's液體培養(yǎng)基中。置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，2 d后觀察培養(yǎng)基的顏色，將變?yōu)辄S色的培養(yǎng)液使用0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾，重復(fù)培養(yǎng)過濾液2 d后接種于牛支原體Thiaucourt's 固體篩選培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)2～4 d，固體培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色并且出現(xiàn)針尖大小密集的菌落，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.3 特異性PCR鑒定

1.3.1 菌體收集 吸取2 mL牛支原體液體培養(yǎng)物于2 mL滅菌離心管中，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，后棄上清，用滅菌濾紙片吸干離心管管壁上的上清液，向滅菌離心管中加入2.2 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）將菌體沉淀懸浮，于4 ℃ 12 000 r/min再次離心30 min后棄上清。同樣用滅菌濾紙吸干多余液體后加入250 μL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2），轉(zhuǎn)到1.5 mL滅菌離心管中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因組DNA的提取 具體方法按試劑盒說明書中的方法進(jìn)行。

1.3.3 PCR引物的合成 根據(jù)GenBank中牛支原體的全基因序列，分別設(shè)計支原體16S rRNA通用引物P1：上游引物5′-GAATTCCGAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，下游引物：5′-AAGCTTGAGGTAATCCATCCCCACGTTC-3′；牛支原體uvrC特異性引物P2：上游引物：5′-GAATTCAATGTGTCTACTAGTCCTGG-3′，下游引物：5′-AAGCTTAGCGTCATAGATTTTTGCATA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.4 PCR反應(yīng) 25 μL PCR反應(yīng)體系：模板2 μL，P1、P2引物各0.5 μL，Mix 10 μL，dd H2O 12 μL，共計25 μL。

16S rRNA引物PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)。72 ℃延伸8 min。

UvrC引物PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)。72 ℃延伸8 min。

將經(jīng)過擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳試驗進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病牛臨床癥狀

患病奶牛主要表現(xiàn)為四肢關(guān)節(jié)腫大（圖1），未表現(xiàn)出咳嗽、肺部聽診濕啰音、體溫升高等癥狀。該牛用頭孢、青霉素、鏈霉素、卡那霉素等抗生素治療效果不明顯，并且該牛關(guān)節(jié)液渾濁。

2.2 病原的分離

將關(guān)節(jié)液接種于Thiaucourt's液體培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后用0.22 μm過濾器進(jìn)行過濾，繼續(xù)培養(yǎng)過濾液2 d后，培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色且澄清透明，無沉淀。取10 μL液體培養(yǎng)液接種于固體培養(yǎng)基于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)2 d，長出針尖大小菌落，顯微鏡下呈現(xiàn)牛支原體典型的“油煎蛋”樣菌落（圖2、圖3）。

2.3 PCR鑒定

由圖4和圖5可知，經(jīng)16S rRNA引物和uvrC引物PCR擴(kuò)增關(guān)節(jié)液培養(yǎng)物和牛支原體陽性對照，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引起牛只關(guān)節(jié)腫大的病原菌的16S rRNA擴(kuò)增序列長度約1.5 kb左右，uvrC擴(kuò)增序列長度約1.6 kb，與陽性對照一致。根據(jù)PCR結(jié)果可初步鑒定該病原微生物為牛支原體。

2.4 遺傳進(jìn)化分析

經(jīng)測序并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹分析可知，16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，GJY與已報道的牛支原體120/81菌株遺傳距離最近，自檢支持率達(dá)75%（圖6）；uvrC序列同源性比較結(jié)果顯示，GJY與GenBank中的牛支原體Egy-11-DK-14、HB0801-P150株同源性最高。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，GJY與已報道的牛支原體Egy-11-DK-14、HB0801-P150遺傳距離最近，與Egy-11-DK-14自檢支持率達(dá)86%（圖7）。根據(jù)遺傳進(jìn)化樹結(jié)果最終可以確定引起此次奶牛關(guān)節(jié)炎的病原菌為牛支原體。

3 討論

牛支原體是柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬的一員，無細(xì)胞壁，具有典型的“油煎蛋”樣菌落形態(tài)。當(dāng)氣候條件、飼養(yǎng)環(huán)境及飼料配方發(fā)生改變時，牛體抵抗力下降，就有可能引發(fā)牛支原體病的發(fā)生。隨著我國養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，牛群的調(diào)運(yùn)必然是促進(jìn)規(guī)模化養(yǎng)殖的關(guān)鍵，然而不同地區(qū)之間的牛群調(diào)運(yùn)必然會使病原菌快速傳播擴(kuò)散，牛支原體傳播擴(kuò)散的風(fēng)險也將提高，因此應(yīng)引起各級獸醫(yī)部門的重視，提高對牛支原體肺炎的認(rèn)識，加強(qiáng)對該病的防控措施[7，8]。分析本次引起牛支原體肺炎關(guān)節(jié)腫大的主要原因是該牛場在引進(jìn)牛只時牛群管理不到位及平時牛群飼養(yǎng)管理中存在著欠缺，在引進(jìn)牛只時未進(jìn)行牛支原體普查，致使帶菌牛被購進(jìn)，購進(jìn)的牛又由于長途運(yùn)輸產(chǎn)生了應(yīng)激，進(jìn)而免疫力降低。由于目前對于牛支原體病原沒有很好的治療藥物，所以建議牛場進(jìn)行牛支原體普查，制定科學(xué)合理的防治方案，降低牛支原體給規(guī)模化養(yǎng)殖帶來的風(fēng)險，做好牛場管控，防止牛支原體在各牧場間傳染。

目前牛支原體的分離培養(yǎng)與分子生物學(xué)鑒定可作為該病原體的確診依據(jù)，特別是使用牛支原體uvrC特異性引物進(jìn)行鑒定，可有效區(qū)分無乳支原體等病原的混淆。本試驗通過病料采集、實驗室分離鑒定，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，遺傳進(jìn)化分析，最終確診引起該奶牛場成年母牛關(guān)節(jié)腫大的病原為牛支原體，為牛支原體引起的肺炎和關(guān)節(jié)腫大等疾病的實驗室診斷及病原的分析奠定了一定基礎(chǔ)。

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