煙粉虱病原真菌的分離鑒定及生物活性初步研究

王鐵軍+鐘萬芳+朱麗梅

摘要：對田間分離的死亡煙粉虱蟲體進(jìn)行保濕培養(yǎng)，分離得到1株具有殺蟲活性的菌株，通過對該菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征的觀察及對其ITS核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析，鑒定該菌株為玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）。采用浸漬法測定該菌株對煙粉虱2齡若蟲的生物活性，結(jié)果表明，在孢子濃度為1.0×107 CFU/mL時(shí)，孢子加菌絲懸浮液處理的蟲體死亡率最高，其72 h和120 h的平均死亡率分別為39%和62%，其次為單用孢子懸液處理，死亡率分別為35%和52%，但兩者無顯著差異，單用菌絲處理的死亡率最低，分別為20%和38%，與前2種處理方式結(jié)果有顯著性差異，說明菌株QH1可能主要是通過孢子侵染煙粉虱蟲體而表現(xiàn)出殺蟲活性。

關(guān)鍵詞：煙粉虱；病原真菌；分離鑒定；生物活性

中圖分類號： S433.39 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0148-03

煙粉虱（Bemisia tabaci Gennadius）廣泛分布于除南極洲以外的90多個(gè)國家，是一種雜食性害蟲，其寄主植物超過600種，包括棉花、多種蔬菜以及多種觀賞植物和花卉[1-2]。煙粉虱危害方式多樣，不僅可以直接吸取植物汁液、分泌蜜露，還可以傳播多種植物病毒，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的危害[3]。因此，如何對煙粉虱進(jìn)行有效的治理和控制引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視，并積極研究有效防控?zé)煼凼牟呗院头椒?。?shí)踐證明一些農(nóng)業(yè)和物理防治措施對預(yù)防和控制田間煙粉虱是很有效的，按照可持續(xù)控制的理念，生物防治在煙粉虱的綜合防治中扮演著非常重要的角色。目前，國內(nèi)外學(xué)者在煙粉虱天敵的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面已經(jīng)做了大量工作，并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮著重要作用，其中病原真菌的尋找和應(yīng)用是生物防治的主要研究內(nèi)容之一。已報(bào)道的煙粉虱病原真菌種類繁多，且多為絲孢菌綱，主要包括輪枝菌（Verticillium）、擬青霉菌（Paecilomyces）和座殼孢屬（Aschersonia）的一些種類[4]。這些天敵中的很多都能取食或寄生大量煙粉虱，在控制煙粉虱時(shí)起著重要作用。

玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）是一類較為常見的昆蟲病原真菌，曾稱為玫煙色擬青霉（Paecilomyces fumosoroseus），屬子囊菌亞門核菌綱，肉座菌目，蟲草菌科棒束孢屬，能寄生蜱螨目、等翅目、纓翅目、半翅目、鱗翅目、雙翅目和鞘翅目等目的多種害蟲[5]。玫煙色棒束孢也是常見的土壤微生物，具有較廣泛的地理分布和較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)能力，因此，開發(fā)和利用該類昆蟲病原真菌已成為生物防治中控制害蟲危害的一個(gè)重要手段和發(fā)展趨勢。目前，國外已篩選出對粉虱、蚜蟲等刺吸式口器害蟲高致病力的菌株，并將其應(yīng)用于大田和溫室的害蟲防治[6]。本研究從金陵科技學(xué)院園藝站采集感染真菌死亡的煙粉虱蟲體，經(jīng)分離純化得到了菌株QH1，在觀察了該菌株的形態(tài)特征、菌落生長特征以及菌株顯微特征的前提下，采用分子生物學(xué)手段對該菌株進(jìn)行了鑒定，并初步測定了該菌株對煙粉虱的殺蟲活性。

1 材料與方法

1.1 煙粉虱病原真菌的分離純化

將田間收集的死亡煙粉虱蟲體放入70%乙醇中浸3～5 s 后，用0.5%次氯酸鈉消毒3～5 min，滅菌水中連續(xù)漂洗3次。用無菌操作法將病蟲體移至培養(yǎng)基平面上，每培養(yǎng)皿內(nèi)放3個(gè)蟲體，呈三角形，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，放入25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 d后，在培養(yǎng)皿中選擇菌落，挑取少許菌絲及孢子，接種培養(yǎng)，反復(fù)接種純化菌株。

1.2 煙粉虱病原真菌形態(tài)特征的觀察

1.2.1 瓊脂水法 用蒸餾水和2%的瓊脂粉混合溶解后滅菌備用，試驗(yàn)前取少量融化的培養(yǎng)基滴加到載玻片中央，培養(yǎng)基應(yīng)滴得盡可能圓且薄，待冷卻后，吸取已配制好的稀釋到一定濃度的孢子液到培養(yǎng)基上，放入已滅菌的裝有濾紙片的培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，并置于28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，10 h后用顯微鏡觀察，隔天觀察1次，并記錄孢子的萌發(fā)、菌絲體生長和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形成的過程。

1.2.2 菌落形態(tài)觀察 將純化的菌株接種于PDA上，于 25 ℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，記錄在培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后菌落直徑大小、顏色變化，并在奧林巴斯顯微鏡下鏡檢分生孢子的形狀，測量分生孢子大小以及產(chǎn)孢細(xì)胞大小、著生方式和形態(tài)特征等情況。

1.3 菌株QH1的分子鑒定

挑選菌株進(jìn)行培養(yǎng)和DNA提取，用真菌DNA提取試劑盒提取基因組的DNA。引物為真菌核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），擴(kuò)增ITS1-5.8S-ITS2 rDNA全序列及部分18S rDNA和28S rDNA序列。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括：10×PCR 緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，1% Triton-X） 2.5 μL，正反向引物各 1 μL，PCR反應(yīng)液2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL，加去離子水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性 1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收片段并連接到克隆載體pEASY T3上，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。

1.4 菌株QH1對煙粉虱殺蟲活性的測定

1.4.1 孢子懸浮液的制備 取已培養(yǎng)好的斜面菌種1支，加入5 mL無菌水，輕輕將瓊脂表面的孢子刮下，將該孢子懸浮液置于已滅菌的50 mL三角瓶內(nèi)，瓶中預(yù)先放置數(shù)粒無菌玻璃球，充分振搖后用滅菌的脫脂棉過濾，并用無菌水沖洗濾渣2～3次，最終使濾液體積達(dá)到10 mL，即得孢子懸浮液，試驗(yàn)前將孢子懸液濃度調(diào)整為1.0×107 CFU/mL。

1.4.2 煙粉虱殺蟲活性的測定方法 本試驗(yàn)采用浸漬法，將帶有2齡煙粉虱若蟲的黃瓜葉片浸入懸液中，對照浸入無菌水中，10 s后取出，自然晾干。每處理為1～2片葉，每葉50～100頭若蟲，3次重復(fù)。置于透明的保鮮盒內(nèi)。再置于（25±0.5） ℃的光照培養(yǎng)箱中（光—暗周期14 h—10 h）。每日鏡檢并記錄被分離真菌感染死亡的蟲數(shù)，計(jì)算侵染率，連續(xù)觀察7 d。

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 根據(jù)所觀察試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)計(jì)算接種后煙粉虱的死亡率，并以Abbott公式進(jìn)行校正：

校正死亡率=處理組死亡率-對照組死亡率1-對照組死亡率×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙粉虱病原真菌的分離

通過保濕培養(yǎng)后幼蟲身體被絲絨體充滿和覆蓋著，經(jīng)分離純化獲得了菌株QH1。

2.2 分離菌株的形態(tài)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，菌落生長快，25 ℃下14 d時(shí)菌落直徑可達(dá)64.5 mm，長絨毛狀，形成孢子后呈肉紅色、粉狀、背面無色或黃色，一些菌株易形成分枝的粉紅色孢梗束，（3～4）μm×（1～2）μm。培養(yǎng)10 d的菌落直徑達(dá)到22 mm，菌落呈絨毛狀，顏色乳白色（圖1），孢子形態(tài)分散或呈鏈狀分布（圖2）。分生孢子梗為瓶狀結(jié)構(gòu)，單生或聚集成孢梗束，壁光滑且透明，大部分為著生4個(gè)瓶梗組成輪生體的輪狀分枝（圖3）。瓶?；壳驙?，或擬橢圓形膨大，上部細(xì)長。分生孢子柱梭形、光滑、透明至微淡紅色，在瓶梗上形成孢子鏈，產(chǎn)孢細(xì)胞著生在柄細(xì)胞或者直接著生于菌絲上，呈燒瓶形，產(chǎn)孢細(xì)胞平均長為6.9 μm、寬為2.5 μm，孢子平均長為3.8 μm、寬為 2.1 μm，菌絲平均寬度為2.6 μm，根據(jù)上述形態(tài)學(xué)特征，分離菌株QH1初步鑒定為擬青霉屬。

2.3 分離菌株的測序序列比對結(jié)果分析

PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，該菌株ITS序列長度為550 bp。將該序列在Gen Bank中登錄（登錄號為：X2UF23JT014，序列比對號為query-6465）進(jìn)行Blast同源性比較。Blast比對結(jié)果表明，其序列和GenBank庫中登錄的9個(gè)菌株的DNA序列為100%同源。從100個(gè)序列中選取相似性最高的9個(gè)菌株序列進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析，構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4），包括爪哇棒束孢EF990131.1、937334.1、FJ765007.1以及JF718688.1等，發(fā)現(xiàn)與GenBank報(bào)道的1株玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）（登錄號：JF718688.1）的ITS序列表現(xiàn)出極高的同源性，處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，因此結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)一步確定該菌株為玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）。

2.4 分離菌株對煙粉虱的侵染活性

對煙粉虱的侵染活性測定結(jié)果表明，用濃度為1.0×107 CFU/mL的分生孢子懸浮液、分生孢子和菌絲混合液、菌絲混合液侵染煙粉虱2齡若蟲后，煙粉虱累計(jì)死亡率見表1。不同時(shí)間的累計(jì)死亡率數(shù)據(jù)顯示，孢子加菌絲處理的蟲體死亡率較高，其72 h和120 h的平均死亡率分別為39%和62%，菌絲處理蟲體的72 h和120 h死亡率分別為20%和38%，2種處理方式結(jié)果有顯著性差異；單用分生孢子菌懸液處理的蟲體，其72 h和120 h的平均死亡率分別為35%和52%，略差于分生孢子加菌絲懸液處理的蟲體死亡率，但差異不顯著，與單用菌絲處理的蟲體死亡率差異顯著。說明菌株QH1可能主要是通過孢子侵染煙粉虱蟲體而表現(xiàn)出殺蟲活性。

3 結(jié)論與討論

在自然界中，玫煙色棒束孢可在昆蟲尸體和土壤中存活一段時(shí)間，當(dāng)環(huán)境適宜時(shí)產(chǎn)孢，形成新的侵染，并可在自然生境和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中形成流行病，在害蟲防治中具有重要的作用[5]。

本研究分離的菌株QH1根據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步鑒定為擬青霉屬，通過rDNA-ITS序列和同源性檢索，發(fā)現(xiàn)該菌株與玫煙色棒束孢相似性為100%。因此可以推斷該菌株為玫煙色棒束孢。目前國內(nèi)有關(guān)玫煙色棒束孢在農(nóng)業(yè)害蟲防治中的應(yīng)用研究包括孟瑞霞等、田晶等應(yīng)用其防治煙粉虱的報(bào)道[6-7]，孟豪等防治桃蚜的研究[8]以及黃建華等測定的對小菜蛾生物活性的研究[9]等，但與大規(guī)模的田間應(yīng)用還有一定的差距。

本研究菌株QH1初步的生物活性測定結(jié)果表明，該菌株對煙粉虱具有較強(qiáng)的侵染能力，處理1周后，蟲體產(chǎn)生大量白色菌絲死亡。在孢子濃度一致的條件下，分生孢子加菌絲懸浮液和分生孢子懸浮液對煙粉虱的侵染活性與菌絲懸浮液處理的相比差異顯著，而分生孢子加菌絲懸浮液和分生孢子懸浮液處理間差異不顯著，但分生孢子加菌絲懸浮液對煙粉虱的殺蟲活性強(qiáng)于單用分生孢子懸浮液，說明菌株QH1可能主要是通過孢子侵染煙粉虱蟲體而表現(xiàn)出殺蟲活性。本試驗(yàn)只對該菌株的生物活性進(jìn)行了初步研究，關(guān)于其活性、殺蟲譜以及田間試驗(yàn)效果尚需進(jìn)一步探討。

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