五株雞傳染性支氣管炎病毒流行株的分離鑒定

宋新宇+馬爽+李陸梅+趙鵬+竇小龍+王紅+范跟成

摘要：2012年1月-2014年8月，從全國(guó)多地出現(xiàn)傳染性支氣管炎發(fā)病養(yǎng)雞場(chǎng)（戶）中采集?。ㄋ溃╇u氣管、腎臟和腺胃進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。根據(jù)各地分離株與YB160株S1基因分子進(jìn)化樹分析，篩選出5個(gè)代表性的毒株，在SPF雞胚中傳至第5代，分別進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定、無菌檢驗(yàn)及對(duì)SPF雞的致病力研究。結(jié)果，所篩選出的5個(gè)流行株在SPF雞胚傳至第5代時(shí)，毒價(jià)均大于或等于106.1EID50/0.1 mL，菌檢陰性，人工感染試驗(yàn)接種1日齡SPF雞，可引起試驗(yàn)雞出現(xiàn)典型傳染性支氣管炎癥狀。

關(guān)鍵詞：雞傳染性支氣管炎；分離鑒定；流行株；QX型

中圖分類號(hào)：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）23-6187-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.046

Abstract：From January， 2012 to April，2014，we did epidemiological investigation by collecting tracheas，kidneys and glandular stomachs of diseased chickens from emerged the infectious bronchitis disease chicken farms（households）. According to the analysis of local isolates and YB160 strains S1 gene molecular evolutionary tree，we sifted five representative strains. We spread the five strains to the fifth generation with SPF chicken embryo，then we did drug price determination，sterile inspection and the pathogenicity study of SPF chicken of each strain. In the results，we found that when the five strains spread to the fifth generation，drug prices were all higher than 106.1EID50/0.1 mL，sterile inspections were all negative，and artificial infections used 1 day-old SPF chicken could cause typical symptoms of infectious bronchitis.

Key words：Avian infectious bronchitis virus； isolation and identification； epidemic strain； QX type

雞傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由冠狀病毒科（Coronavirdae）冠狀病毒屬（Coro-nav irus）的傳染性支氣管炎病毒（Infectious bron-chit is virus，IBV）引起的一種急性高度接觸性傳染性疫病[1，2]。自20世紀(jì)30年代在美國(guó)暴發(fā)以來，現(xiàn)已成為世界各地流行的重要禽病[2]。IBV是單股RNA病毒，該病毒基因可因點(diǎn)突變和重組而發(fā)生變異，故傳染性支氣管炎病毒血清型較多[2]。由于IBV的主要中和抗原表位和保護(hù)性表位主要由纖突蛋白（S 蛋白）的S1蛋白決定[2，3]，各血清型毒株之間的差異主要是S1基因變異造成的[4]，所以，針對(duì)S1基因的研究在IBV的流行病學(xué)研究中具有重要代表意義。

由于IBV疫苗的大量使用所帶來的的免疫選擇壓力，大量的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，近年來國(guó)內(nèi)流行的IBV毒株處于持續(xù)不斷的進(jìn)化當(dāng)中。QX型毒株是近十多年才開始流行的新的基因型，其原型株QXIBV最早由農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢驗(yàn)所于1996年分離自青島某發(fā)生腺胃炎的雞群（動(dòng)物回歸試驗(yàn)未復(fù)制出腺胃炎病變）[5]，但直到2004年該型病毒才被證實(shí)在國(guó)內(nèi)廣泛流行，臨床表現(xiàn)主要為腎病變和不同程度的腺胃病變；而包括俄羅斯、荷蘭、比利時(shí)、德國(guó)、法國(guó)等在內(nèi)的多個(gè)歐洲國(guó)家也在同一時(shí)期發(fā)現(xiàn)存在該型毒株的流行。根據(jù)韓宗璽等[6]對(duì)1995～2009年共計(jì)15年間國(guó)內(nèi)可檢索到S1基因全長(zhǎng)序列的所有IBV分離株進(jìn)行的遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示國(guó)內(nèi)至少同時(shí)流行10個(gè)以上基因型的IBV毒株，但QX型（也稱LX4型）為最主要的優(yōu)勢(shì)基因型（54.1%）。根據(jù)最近的研究報(bào)道，在2009年以后國(guó)內(nèi)分離株中，QX型毒株所占的比重至少在65%以上[7-10]。根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道，現(xiàn)有疫苗對(duì)QX型毒株交叉免疫保護(hù)性較低[11]，因此研制相應(yīng)血清型的新型疫苗的需求日益迫切。

為滿足市場(chǎng)需求，青島易邦生物工程有限公司與普萊柯生物工程股份有限公司聯(lián)合研制了雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota株+YB160株），為驗(yàn)證QX型IBV YB160株對(duì)當(dāng)前流行株的交叉保護(hù)性，2012-2014年在各地區(qū)畜牧獸醫(yī)站、動(dòng)物檢疫站和養(yǎng)殖場(chǎng)配合下進(jìn)行IBV流行病學(xué)調(diào)查，根據(jù)各地分離株、經(jīng)典疫苗株與YB160株S1基因分子進(jìn)化樹分析，從當(dāng)前主要流行型中，篩選出臨床發(fā)病較典型的5個(gè)有代表性的毒株CK/CH/SD/QD/2013/1株（簡(jiǎn)稱“QD13株”）、CK/CH/SD/2013/2株（簡(jiǎn)稱“SD2株”）、CK/CH/GD/2014/1株（簡(jiǎn)稱“GD株”）、CK/CH/HLJ/2013/1株（簡(jiǎn)稱“HLJ株”）及CK/CH/SX/2014/2（簡(jiǎn)稱“SX株”）進(jìn)行了分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料

病雞氣管、腎臟和腺胃組織，采自全國(guó)多地養(yǎng)雞場(chǎng)（戶）。

1.2 引物

參照GenBank收錄的IBV S1基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)，由上海英駿公司合成。上游引物IBV-87： 5′-TAT TGA TTA GAG ATG TTG GG-3′；下游引物S1 Oligo3′：5′-CAT AAC TAA CAT AAG GGC AA-3′。

1.3 主要試劑

病毒RNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶及RNA酶抑制劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 病毒的分離 無菌采集發(fā)病雞氣管、腎臟和腺胃，用無菌生理鹽水勻漿制成20%懸液，每毫升加入2 000 U青、鏈霉素，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心15 min，取上清除菌后經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，置37 ℃孵育觀察，孵化144 h，收集雞胚液。

1.4.2 分離病毒免疫原基因（S1）的RT-PCR擴(kuò)增 取各組病料收獲的感染雞胚液進(jìn)行S1基因的RT-PCR擴(kuò)增，序列測(cè)定。并用MEGA5.05軟件進(jìn)行序列比較和分析。

1.4.3 雞胚傳代及毒價(jià)測(cè)定 根據(jù)分離病毒免疫原基因序列比較和分析結(jié)果，選取5株代表毒株，分別尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚接種0.1 mL，37 ℃孵育，培養(yǎng)36 h。棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，無菌收集雞胚液。按此方法連續(xù)傳代至第5代，并測(cè)定第5代的病毒含量。

1.4.4 無菌檢驗(yàn) 取5株代表毒株連續(xù)傳代至第5代，分別按2010年版《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.4.5 分離病毒第5代對(duì)SPF雞的致病力 ①人工感染試驗(yàn)。用5株代表毒株第5代毒分別滴鼻接種1日齡SPF雞10只，104.0EID50/只，置負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)觀察14 d。②病理學(xué)觀察。將人工感染試驗(yàn)病、死雞剖檢，觀察病變。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

將無菌采集的病雞氣管、腎臟和腺胃制備20%的懸液，接種10日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔接種0.2 mL，37 ℃孵化144 h，收集尿囊液并進(jìn)行HA測(cè)定，同時(shí)觀察雞胚的變化。連續(xù)盲傳3～5代，各代尿囊液HA效價(jià)呈陰性，接種后部分雞胚出現(xiàn)早期死亡，死亡雞胚全身出血明顯，未死雞胚發(fā)育受阻，呈明顯的侏儒胚、蜷縮胚變化。

2.2 分離株S1基因RT-PCR擴(kuò)增及分子進(jìn)化樹分析結(jié)果

分離株S1基因RT-PCR擴(kuò)增均可見到清晰的1.7 kb左右大小的條帶，與引物設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果相符。從進(jìn)化樹看，當(dāng)前IBV主要流行QX型。序列比對(duì)結(jié)果見圖1。

2.3 5株代表毒株的傳代及毒價(jià)測(cè)定

QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株在SPF雞胚中傳至第5代，5株分離毒均可致雞胚典型病變，死亡雞胚全身出血明顯，未死雞胚可見發(fā)育受阻，呈明顯的侏儒胚、蜷縮胚變化。分別取QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株第5代毒種測(cè)定病毒含量，結(jié)果顯示QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株第5代病毒含量分別為106.3、106.1、106.3、106.3和106.1EID50/0.1 mL。

2.4 無菌檢驗(yàn)

按2010年《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果5株分離毒均無菌生長(zhǎng)，無菌檢驗(yàn)合格。

2.5 對(duì)SPF雞的致病力

2.5.1 人工感染試驗(yàn) 用分離病毒QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株第5代各接種10只1日齡SPF雞，104.0EID50/只。接種后3～5日，開始發(fā)病，病雞精神沉郁、閉眼、羽毛蓬亂、采食和飲水急劇減少、拉黃白色或黃色或綠色稀便，伴有呼吸癥狀、呼吸有啰音。發(fā)病中后期消瘦衰竭死亡，在發(fā)病后5～7d處于死亡高峰，發(fā)病后期雞只表現(xiàn)發(fā)育極不整齊，大小不均。5株病毒接種的SPF雞發(fā)病率為80%～100%，死亡率為40%～60%（表1）。

2.5.2 病理觀察 人工感染試驗(yàn)雞的病理變化基本相同。剖檢病雞和死雞，均極度消瘦，泄殖腔周圍有糞便粘污；雞腎臟腫大，有尿酸鹽沉積，可見明顯“花斑腎”；氣管黏膜潮紅或出血；個(gè)別雞腺胃腫大。其他器官在肉眼上未見明顯變化。

3 討論

1）近年來國(guó)內(nèi)流行的IBV毒株處于持續(xù)不斷的進(jìn)化當(dāng)中。根據(jù)2012-2014年期間國(guó)內(nèi)IBV流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，QX型已成為國(guó)內(nèi)IBV主要流行基因型[13]。與Han等[6]、張小榮[12]報(bào)道的相一致。

2）2012-2014年間，我們進(jìn)行IBV流行病學(xué)調(diào)查中共分離到69株IBV流行株。根據(jù)IBV S1基因的發(fā)表序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)可擴(kuò)增IBV全長(zhǎng)S1基因的寡核苷酸引物，兩引物間跨度約1.7 kb。RT-PCR擴(kuò)增分離毒S1基因獲得了與預(yù)期大小相一致的目的條帶，證明分離毒符合雞傳染性支氣管炎病毒的特性。由于分離株太多，全部進(jìn)行系統(tǒng)鑒定用時(shí)太長(zhǎng)，故根據(jù)各地分離株、經(jīng)典疫苗株與YB160株S1基因分子進(jìn)化樹分析，僅從當(dāng)前主要流行型（QX型）中，篩選出5株分布在不同區(qū)域的（山東、廣東、黑龍江及陜西）發(fā)病的臨床較典型IBV，S1基因同源性有一定差異的代表性毒株進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，作為流行株免疫保護(hù)試驗(yàn)攻毒用毒株。

3）將這5株毒在SPF雞胚中傳至第5代后，毒價(jià)均可達(dá)106.1EID50及以上，人工感染試驗(yàn)接種1日齡SPF雞，可引起試驗(yàn)雞80%～100%發(fā)病，死亡率可達(dá)40%～60%。

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