丁鱥疑似致病真菌的分離鑒定與生物學(xué)特性

丁鱥疑似致病真菌的分離鑒定與生物學(xué)特性

摘要：從患病丁鱥（Timca tinca L.）體表上分離出6株疑似致病真菌，選擇3株真菌分別編號為菌株1、菌株2、菌株3，并根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，菌株1為墨綠青霉（Penicillium atramentosum Thom）、菌株2為產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum Thom）、菌株3為卷枝毛霉（Mucor circinelloides Van Tiegh）；進(jìn)一步對其進(jìn)行生物學(xué)特性的初步研究，確定了其最適生長溫度為25～30 ℃，最適pH為中性偏酸性。

關(guān)鍵詞：丁鱥（Timca tinca L.）；真菌；分離鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號：S965.199；Q949.32文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2376-03

Isolation，Identification and Biological Characteristics of

Suspicious Pathomycete from Timca tinca L.

YANG Xiu-rong

（Life Sciences Institute， Zunyi Normal College/Key Laboratory of Regional Characteristic for Conservation

and Utilization of Plant Resource in Chishui River Basin，Zunyi 563002，Guizhou，China）

Abstract：Six strains of fungi were isolated from sick Timca tinca L. Three strains screened out from them were named as strain one，strain two and strain three and identified by morphological feature and molecular biology. The results showed that strain one was P. atramentosum Thom. Strain two was P.chrysogenum Thom. Strain three was M.circinelloides Van Tiegh. The optimal temperature was 25～30 ℃ and optimal pH was meutral or partial acidity.

Key words：Timca tinca L.； fungus； isolation and identification； biological characteristics

基金項(xiàng)目：貴州省遵義市科技局項(xiàng)目[遵市科合社字（2009）26號]

丁鱥（Timca tinca L.）隸屬魚綱鯉形目鯉科雅羅魚亞科丁鱥屬，在我國僅產(chǎn)于新疆阿勒泰地區(qū)的額爾齊斯河和烏倫古河水系，是當(dāng)?shù)氐闹饕?jīng)濟(jì)魚類之一[1]。丁鱥的血小板、紅細(xì)胞和白細(xì)胞均遠(yuǎn)高于本地鯉魚（Cyprinus carpio）、鯽魚（Carassius auratus），有利于增強(qiáng)抗病力，且可作為補(bǔ)充鉀、鎂和磷的營養(yǎng)食物，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值在鱖魚（Siniperca chuatsi）之上，而生產(chǎn)成本與鯉魚相當(dāng)[2]。由于丁鱥肉嫩味鮮，經(jīng)濟(jì)效益較高，丁鱥成為烏江網(wǎng)箱養(yǎng)殖的一種重要魚類。隨著現(xiàn)代化工業(yè)的發(fā)展和人口的不斷增加，大量的工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活污水源源不斷地流入烏江，使養(yǎng)殖水體污染越來越嚴(yán)重，已給丁鱥養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。真菌性疾病是困擾丁鱥養(yǎng)殖較嚴(yán)重的病害之一，故對患病丁鱥個(gè)體進(jìn)行真菌的分離與鑒定，可為真菌性疾病的防治提供理論依據(jù)，具有重要的意義。

傳統(tǒng)的真菌分類方法主要根據(jù)真菌菌株的形態(tài)特征、生長特性及生理生化指標(biāo)來進(jìn)行，包括形態(tài)學(xué)分類、生理學(xué)及生態(tài)學(xué)特征分類、血清學(xué)分類和真菌的菌體組成分析分類等[3，4]。真菌的形態(tài)特征復(fù)雜，并且部分生理生化指標(biāo)和形態(tài)特征會隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致鑒定費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且不準(zhǔn)確。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等相關(guān)學(xué)科的迅速發(fā)展，一系列分子生物學(xué)方法逐漸被應(yīng)用到真菌的分類鑒定中，其中rDNA序列分析和RFLP分析是目前真菌分類鑒定中常用的方法[5]。將傳統(tǒng)真菌分類方法與分子鑒定相結(jié)合，可以使真菌分類鑒定更加快速、穩(wěn)定、可靠。

本研究以患病丁鱥為材料，采用rRNA序列分析與傳統(tǒng)真菌分類法相結(jié)合進(jìn)行鑒定，對分離所得菌株采取先擴(kuò)增其18S rRNA基因測定其序列，通過同源性比對確定該菌株所在的屬，再根據(jù)其形態(tài)特征和顯微結(jié)構(gòu)鑒定到種，并初步研究了不同溫度和pH條件下丁鱥的生長狀況，為其疾病預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

患病丁鱥取自烏江偏巖河某網(wǎng)箱養(yǎng)殖場。

1.2菌株的分離和培養(yǎng)

選取體表有真菌侵害癥狀的患病丁鱥，用無菌水清洗后，剖取丁鱥體表損傷部位、肝臟、消化道等組織，用接種環(huán)接種到PDA培養(yǎng)基上。25 ℃培養(yǎng)，待其長出菌落后挑取菌落轉(zhuǎn)接種至另一PDA培養(yǎng)基上，直至生長單菌落。

1.3菌株的分子鑒定

1.3.1 真菌DNA的提取 將篩選出的真菌分別接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3 d，從培養(yǎng)基上挑取新鮮菌絲放置于研磨鍋中，加入700 μL 2%的 CTAB溶液，用滅菌石英砂研磨菌絲體，然后轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中。在恒溫水浴鍋上于65 ℃下作用30 min（每10 min振蕩一次），然后加等體積氯仿和異戊醇混合液（24∶1）輕輕充分搖勻，然后4 ℃、12 000r/min離心10 min。取上清液至新EP管中，加等體積異丙醇在常溫下靜置30 min，而后4 ℃、12 000 r/min離心10 min。將上清液移至新EP管中，加2倍體積75%的乙醇沉淀DNA，而后4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清液后室溫晾干，以50 μL TE緩沖液溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.3.2菌株18S rRNA基因的PCR鑒定PCR擴(kuò)增鑒定以通用引物為NS1與NS6[6]，引物序列為：NS1（5′-ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACCAC-3′），NS6（5′-ACCGGAATTCGGCAGGAGCGTAATCAACGC

-3′）。PCR 擴(kuò)增體系為：10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dNTPs 4.0 μL，10 × PCR Buffer 5.0 μL，模板DNA 2.0 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退化50 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對。

1.4菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～12 d，觀察菌落形態(tài)與顏色，并在顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子梗著生情況、孢子的形態(tài)、大小與顏色等。

1.5菌株的生物學(xué)特性初步研究

1.5.1不同溫度下菌株的生長狀況將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

1.5.2不同pH下菌株的生長狀況將真菌接種在不同pH（4、5、6、7、8、9、10、11）的PDA培養(yǎng)基上， 25 ℃培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

2結(jié)果與分析

2.1致病真菌的分離結(jié)果

從患病丁鱥上共分離出6株疑似致病真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3。

2.218S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3個(gè)菌株18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，3個(gè)菌株均擴(kuò)增出約1 500 bp的DNA片段，將3個(gè)菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，PCR擴(kuò)增結(jié)果見表1。

2.3菌株的形態(tài)觀察

2.3.1菌株1的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，萌發(fā)時(shí)菌絲呈白色，5 d后菌落絨狀，中間呈灰綠色或暗綠色，邊緣白色，背面淡黃色（圖2a）。在CA培養(yǎng)基上，菌絲體白色；菌落絨狀，黃褐色，背面呈淡褐色（圖2b）。孢梗莖光滑，無膨大，帚狀枝三輪生；副枝叉開，光滑；分生孢子光滑，橢圓形，綠色（圖2c、圖2d）。

綜合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，菌株1初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）墨綠青霉（Penicillium atramentosum Thom）[7]。

2.3.2菌株2的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，菌絲白色，菌落藍(lán)綠色，絨狀，邊緣絲狀（圖3a），背面淡黃色，有大量淡黃色滲出液。帚狀枝三輪生，彼此之間呈現(xiàn)不同程度地叉開，分生孢子呈球形或近球形，壁平滑（圖3b）。在CA培養(yǎng)基上，菌落質(zhì)地絮狀或絨狀，淡黃色至淺褐色，邊緣白色，分生孢子面灰綠色，中間較老部分呈橘褐色，背面呈不同程度的黃色或橙色。

綜合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，菌株2初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum Thom）[7]。

2.3.3菌株3的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～12 d，菌絲萌發(fā)時(shí)白色，后變?yōu)榛液稚▓D4a）。菌絲生長迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長，單軸分枝；孢子囊大，球形，含孢子甚多，頂生；孢囊孢子卵圓形，壁薄，平滑（圖4b）。

綜合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，菌株3初步鑒定為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）毛霉屬（Mucor Micheli Ex Fries）卷枝毛霉（M. circinelloides Van Tiegh）[8]。

2.4菌株的生物學(xué)特性

2.4.1不同溫度對3個(gè)菌株生長速率的影響3個(gè)菌株在不同溫度下的生長情況見表2。由表2可以看出，在不同溫度條件下，不同真菌的生長速率是不同的。3個(gè)菌株在5 ℃時(shí)均基本不萌發(fā)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，真菌生長速率加快，25～30 ℃是這3個(gè)菌株生長的較適溫度。

2.4.2不同pH對3個(gè)菌株生長速率的影響3個(gè)菌株在不同pH的培養(yǎng)基上生長情況見表3。由表3可以看出，在不同pH的培養(yǎng)基上，不同真菌的生長速率是不同的。3個(gè)菌株在pH 4～11均能生長，菌株1在pH為7時(shí)生長最快，菌株2和菌株3在pH為6時(shí)生長最快，pH的降低和升高均會使這3種真菌的生長速度下降?？傮w來說，這3個(gè)菌株生長的較適pH是中性偏酸性。

3小結(jié)與討論

從患病丁鱥中共分離出6株疑似致病真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3，進(jìn)一步確定菌株1為墨綠青霉，菌株2為產(chǎn)黃青霉，菌株3為卷枝毛霉。3株菌株的較適生長溫度為25～30 ℃，較適pH為中性偏酸性。由于真菌的種類多、形態(tài)特征復(fù)雜，并且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，可能造成鑒定結(jié)果有一定偏差[9]，增加了鑒定難度，本研究中將傳統(tǒng)真菌分類方法與分子鑒定相結(jié)合，使真菌分類鑒定更加快速、穩(wěn)定、可靠。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳淑萍，康萌.水產(chǎn)養(yǎng)殖新品種——丁鱥[J].黑龍江水產(chǎn)， 2002（6）：1-2.

[2] 譚清朗.高檔經(jīng)濟(jì)魚歐洲丁鱥極其養(yǎng)殖技術(shù)[J].農(nóng)村百事通，2006（1）：45.

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[5] 蔣盛巖，張志光.真菌的分子生物學(xué)鑒定方法研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報(bào)，2002，37（10）：4-6.

[6] 周小玲，沈微，饒志明，等.一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J].微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（4）：89-92.

[7] 孔華忠.中國真菌志（第35卷）[M].北京：科學(xué)出版社，2003. 139-144.

[8] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.70-71.

[9] 林劍偉，林劍偉，闕友雄，等.核糖體DNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列標(biāo)記在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊，2007，18（2）：292-294.

1.3.2菌株18S rRNA基因的PCR鑒定PCR擴(kuò)增鑒定以通用引物為NS1與NS6[6]，引物序列為：NS1（5′-ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACCAC-3′），NS6（5′-ACCGGAATTCGGCAGGAGCGTAATCAACGC

-3′）。PCR 擴(kuò)增體系為：10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dNTPs 4.0 μL，10 × PCR Buffer 5.0 μL，模板DNA 2.0 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退化50 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對。

1.4菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～12 d，觀察菌落形態(tài)與顏色，并在顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子梗著生情況、孢子的形態(tài)、大小與顏色等。

1.5菌株的生物學(xué)特性初步研究

1.5.1不同溫度下菌株的生長狀況將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

1.5.2不同pH下菌株的生長狀況將真菌接種在不同pH（4、5、6、7、8、9、10、11）的PDA培養(yǎng)基上， 25 ℃培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

2結(jié)果與分析

2.1致病真菌的分離結(jié)果

從患病丁鱥上共分離出6株疑似致病真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3。

2.218S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3個(gè)菌株18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，3個(gè)菌株均擴(kuò)增出約1 500 bp的DNA片段，將3個(gè)菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，PCR擴(kuò)增結(jié)果見表1。

2.3菌株的形態(tài)觀察

2.3.1菌株1的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，萌發(fā)時(shí)菌絲呈白色，5 d后菌落絨狀，中間呈灰綠色或暗綠色，邊緣白色，背面淡黃色（圖2a）。在CA培養(yǎng)基上，菌絲體白色；菌落絨狀，黃褐色，背面呈淡褐色（圖2b）。孢梗莖光滑，無膨大，帚狀枝三輪生；副枝叉開，光滑；分生孢子光滑，橢圓形，綠色（圖2c、圖2d）。

綜合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，菌株1初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）墨綠青霉（Penicillium atramentosum Thom）[7]。

2.3.2菌株2的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，菌絲白色，菌落藍(lán)綠色，絨狀，邊緣絲狀（圖3a），背面淡黃色，有大量淡黃色滲出液。帚狀枝三輪生，彼此之間呈現(xiàn)不同程度地叉開，分生孢子呈球形或近球形，壁平滑（圖3b）。在CA培養(yǎng)基上，菌落質(zhì)地絮狀或絨狀，淡黃色至淺褐色，邊緣白色，分生孢子面灰綠色，中間較老部分呈橘褐色，背面呈不同程度的黃色或橙色。

綜合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，菌株2初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum Thom）[7]。

2.3.3菌株3的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～12 d，菌絲萌發(fā)時(shí)白色，后變?yōu)榛液稚▓D4a）。菌絲生長迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長，單軸分枝；孢子囊大，球形，含孢子甚多，頂生；孢囊孢子卵圓形，壁薄，平滑（圖4b）。

綜合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，菌株3初步鑒定為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）毛霉屬（Mucor Micheli Ex Fries）卷枝毛霉（M. circinelloides Van Tiegh）[8]。

2.4菌株的生物學(xué)特性

2.4.1不同溫度對3個(gè)菌株生長速率的影響3個(gè)菌株在不同溫度下的生長情況見表2。由表2可以看出，在不同溫度條件下，不同真菌的生長速率是不同的。3個(gè)菌株在5 ℃時(shí)均基本不萌發(fā)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，真菌生長速率加快，25～30 ℃是這3個(gè)菌株生長的較適溫度。

2.4.2不同pH對3個(gè)菌株生長速率的影響3個(gè)菌株在不同pH的培養(yǎng)基上生長情況見表3。由表3可以看出，在不同pH的培養(yǎng)基上，不同真菌的生長速率是不同的。3個(gè)菌株在pH 4～11均能生長，菌株1在pH為7時(shí)生長最快，菌株2和菌株3在pH為6時(shí)生長最快，pH的降低和升高均會使這3種真菌的生長速度下降?？傮w來說，這3個(gè)菌株生長的較適pH是中性偏酸性。

3小結(jié)與討論

從患病丁鱥中共分離出6株疑似致病真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3，進(jìn)一步確定菌株1為墨綠青霉，菌株2為產(chǎn)黃青霉，菌株3為卷枝毛霉。3株菌株的較適生長溫度為25～30 ℃，較適pH為中性偏酸性。由于真菌的種類多、形態(tài)特征復(fù)雜，并且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，可能造成鑒定結(jié)果有一定偏差[9]，增加了鑒定難度，本研究中將傳統(tǒng)真菌分類方法與分子鑒定相結(jié)合，使真菌分類鑒定更加快速、穩(wěn)定、可靠。

參考文獻(xiàn)：

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[7] 孔華忠.中國真菌志（第35卷）[M].北京：科學(xué)出版社，2003. 139-144.

[8] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.70-71.

[9] 林劍偉，林劍偉，闕友雄，等.核糖體DNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列標(biāo)記在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊，2007，18（2）：292-294.

1.3.2菌株18S rRNA基因的PCR鑒定PCR擴(kuò)增鑒定以通用引物為NS1與NS6[6]，引物序列為：NS1（5′-ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACCAC-3′），NS6（5′-ACCGGAATTCGGCAGGAGCGTAATCAACGC

-3′）。PCR 擴(kuò)增體系為：10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dNTPs 4.0 μL，10 × PCR Buffer 5.0 μL，模板DNA 2.0 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退化50 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對。

1.4菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～12 d，觀察菌落形態(tài)與顏色，并在顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子梗著生情況、孢子的形態(tài)、大小與顏色等。

1.5菌株的生物學(xué)特性初步研究

1.5.1不同溫度下菌株的生長狀況將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

1.5.2不同pH下菌株的生長狀況將真菌接種在不同pH（4、5、6、7、8、9、10、11）的PDA培養(yǎng)基上， 25 ℃培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

2結(jié)果與分析

2.1致病真菌的分離結(jié)果

從患病丁鱥上共分離出6株疑似致病真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3。

2.218S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3個(gè)菌株18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，3個(gè)菌株均擴(kuò)增出約1 500 bp的DNA片段，將3個(gè)菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，PCR擴(kuò)增結(jié)果見表1。

2.3菌株的形態(tài)觀察

2.3.1菌株1的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，萌發(fā)時(shí)菌絲呈白色，5 d后菌落絨狀，中間呈灰綠色或暗綠色，邊緣白色，背面淡黃色（圖2a）。在CA培養(yǎng)基上，菌絲體白色；菌落絨狀，黃褐色，背面呈淡褐色（圖2b）。孢梗莖光滑，無膨大，帚狀枝三輪生；副枝叉開，光滑；分生孢子光滑，橢圓形，綠色（圖2c、圖2d）。

綜合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，菌株1初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）墨綠青霉（Penicillium atramentosum Thom）[7]。

2.3.2菌株2的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，菌絲白色，菌落藍(lán)綠色，絨狀，邊緣絲狀（圖3a），背面淡黃色，有大量淡黃色滲出液。帚狀枝三輪生，彼此之間呈現(xiàn)不同程度地叉開，分生孢子呈球形或近球形，壁平滑（圖3b）。在CA培養(yǎng)基上，菌落質(zhì)地絮狀或絨狀，淡黃色至淺褐色，邊緣白色，分生孢子面灰綠色，中間較老部分呈橘褐色，背面呈不同程度的黃色或橙色。

綜合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，菌株2初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum Thom）[7]。

2.3.3菌株3的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～12 d，菌絲萌發(fā)時(shí)白色，后變?yōu)榛液稚▓D4a）。菌絲生長迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長，單軸分枝；孢子囊大，球形，含孢子甚多，頂生；孢囊孢子卵圓形，壁薄，平滑（圖4b）。

綜合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，菌株3初步鑒定為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）毛霉屬（Mucor Micheli Ex Fries）卷枝毛霉（M. circinelloides Van Tiegh）[8]。

2.4菌株的生物學(xué)特性

2.4.1不同溫度對3個(gè)菌株生長速率的影響3個(gè)菌株在不同溫度下的生長情況見表2。由表2可以看出，在不同溫度條件下，不同真菌的生長速率是不同的。3個(gè)菌株在5 ℃時(shí)均基本不萌發(fā)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，真菌生長速率加快，25～30 ℃是這3個(gè)菌株生長的較適溫度。

2.4.2不同pH對3個(gè)菌株生長速率的影響3個(gè)菌株在不同pH的培養(yǎng)基上生長情況見表3。由表3可以看出，在不同pH的培養(yǎng)基上，不同真菌的生長速率是不同的。3個(gè)菌株在pH 4～11均能生長，菌株1在pH為7時(shí)生長最快，菌株2和菌株3在pH為6時(shí)生長最快，pH的降低和升高均會使這3種真菌的生長速度下降?？傮w來說，這3個(gè)菌株生長的較適pH是中性偏酸性。

3小結(jié)與討論

從患病丁鱥中共分離出6株疑似致病真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3，進(jìn)一步確定菌株1為墨綠青霉，菌株2為產(chǎn)黃青霉，菌株3為卷枝毛霉。3株菌株的較適生長溫度為25～30 ℃，較適pH為中性偏酸性。由于真菌的種類多、形態(tài)特征復(fù)雜，并且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，可能造成鑒定結(jié)果有一定偏差[9]，增加了鑒定難度，本研究中將傳統(tǒng)真菌分類方法與分子鑒定相結(jié)合，使真菌分類鑒定更加快速、穩(wěn)定、可靠。

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