三個蘿卜主產(chǎn)區(qū)軟腐病病原菌的分離與鑒定

鄒婧澤+嚴(yán)準(zhǔn)+程毅+陳佳+曾糧斌+李智敏+余永廷+高春生

摘要：為有效防治蘿卜（Raphanus sativus L.）軟腐病，提高蘿卜產(chǎn)量和質(zhì)量，從江蘇徐州、浙江蕭山和湖北利川3個蘿卜主產(chǎn)區(qū)分別采集蘿卜軟腐病病樣并進(jìn)行病原菌的分離鑒定及致病力測定。通過結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化指標(biāo)測定和16S rDNA基因序列分析，確定3株病原菌屬于胡蘿卜果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）的2個亞種，其中2株為Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense，另1株為Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum。致病力測定分析表明，3株病原菌的致病力存在顯著差異，隨溫度的升高均呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢。

關(guān)鍵詞：蘿卜（Raphanus sativus L.）；軟腐?。恢虏×Σ町?/p>

中圖分類號：S436.31；S631.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6130-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.030

Abstract：In order to control soft rot disease of radish，increase its yield and quality，the pathogen of radish soft rot disease was isolated and identified from disease samples collected from three main production areas of radish in Jiangsu Xuzhou， Zhejiang Xiaoshan and Hubei Lichuan，and its pathogenicity was evaluated later. Based on morphological observation，biological and physiological methods，and 16S rDNA sequence analysis，three strains were identified belonging to two subspecies of Pectobacterium Carotovorum，that is Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense and Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum. The pathogenicity test was carried out by inoculating these pathogen isolates，and the results showed that three strains had significant differences in pathogenicity with a common increase ability as the temperature increased.

Key words：Raphanus sativus L.； soft rot disease； pathogenicity difference

蘿卜（Raphanus sativus L.）是十字花科蘿卜屬蔬菜作物，世界各地均有栽培，其中中國年均播種面積在120萬hm2以上，占世界種植面積的40%，是中國第二大蔬菜作物[1]。隨著高山蘿卜等反季節(jié)蘿卜的大面積發(fā)展，蘿卜已經(jīng)從秋冬供應(yīng)的時令菜逐漸發(fā)展為四季持續(xù)供應(yīng)的周年菜，且周年供應(yīng)的蘿卜已經(jīng)成為國家調(diào)控蔬菜價格體系的重要產(chǎn)品[1-3]。

軟腐病又稱腐爛病，是十字花科蔬菜中危害最嚴(yán)重的病害之一。其寄主范圍廣，不僅侵染十字花科蔬菜，還危害茄科、菊科等多種蔬菜。雨季種植蘿卜，軟腐病的病株率和產(chǎn)量損失一般都在8%以上， 發(fā)病重的田塊蘿卜病株率和產(chǎn)量損失達(dá)30%以上，對菜農(nóng)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。近年來，受全球變暖和規(guī)?；N植的影響，極端天氣頻發(fā)，長期連作土壤中軟腐病病原基數(shù)大，加重了蘿卜軟腐病害的發(fā)生。為此，試驗分別從江蘇徐州、浙江蕭山和湖北利川的3個蘿卜主產(chǎn)區(qū)分離并鑒定蘿卜軟腐病病原菌，比較不同地區(qū)的蘿卜軟腐病病原菌致病力差異和親緣關(guān)系，以期為更好地控制蘿卜軟腐病病情奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和培養(yǎng)

2015年4～7月，從江蘇徐州、浙江蕭山和湖北利川的3個蘿卜主產(chǎn)區(qū)分別采集蘿卜軟腐病病樣。選取具典型軟腐病病狀的蘿卜塊根，表面清洗后，用滅菌解剖刀切取小塊蘿卜塊根病健交界處的組織，用75%的乙醇消毒30 s，無菌水清洗3次后，置于3 mL無菌水中，切碎組織，靜置10～15 min，用滅菌牙簽蘸取少量組織液在LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。在28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h后，挑取單菌落經(jīng)過3～5次純化培養(yǎng)。將純化后的細(xì)菌挑取單菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)18～24 h后，加3 mL體積分?jǐn)?shù)60%的甘油，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 病原菌致病力測定

1.2.1 菌懸液的配制 將菌株活化，挑取單菌落接入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，用無菌0.9% NaCl生理鹽水洗滌3次后，配制成2×108 CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 病原菌回接 分別選取長勢一致且健康的蘿卜葉片和蘿卜塊根，表面清洗后，用75%乙醇表面消毒，晾干。蘿卜葉片置于裝有2層無菌濾紙的15 cm無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，并加5 mL無菌水保濕。在距葉柄切口1～2 cm處，用一次性無菌注射器注射5 μL菌液，每個菌株重復(fù)4次，用封口膜封住培養(yǎng)皿口，置于28 ℃培養(yǎng)。蘿卜塊根置于用75%乙醇消毒的無菌托盤內(nèi)，用滅菌解剖刀在其中心劃5 mm×5 mm的十字傷口，深度為5 mm，向其中部注射5 μL菌液，每個菌株重復(fù)4次，用保鮮膜將托盤封住，置于28 ℃培養(yǎng)。相同條件下，以注射無菌0.9% NaCl生理鹽水侵染的植物組織為對照。接種后每12 h觀察一次發(fā)病情況。蘿卜發(fā)病后，再次分離病原菌并純化，與接種的病原菌比較。

1.2.3 病原菌致病力差異測定 參照胡娜娜等[5]的方法測定病原菌致病力。選用健康大白菜葉柄基部進(jìn)行致病力測定。設(shè)置22、25、28 ℃ 3個溫度，每個溫度每個菌株重復(fù)10次，以0.9%的無菌生理鹽水侵染的植物組織為對照。在接種12、24 h時分別測量病斑長度和寬度，取平均值作為平均病斑大小。

1.3 病原菌形態(tài)及生理生化指標(biāo)測定

將純化的菌株接種于NA培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)18～24 h，觀察菌株生長狀況和形態(tài)特征。革蘭氏染色反應(yīng)參照米琴等[6]的方法，鞭毛染色參照郭堅華等[7]的方法，于顯微鏡下觀察。過氧化酶試驗、氧化酶試驗、明膠液化、硝酸鹽還原、亞硝酸鹽還原、葡萄糖發(fā)酵、檸檬酸鹽利用、纖維素分解、果膠水解、馬鈴薯腐敗、硫化氫試驗、37 ℃生長、苯丙氨基酸脫氨酶以及病原菌對蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇和阿拉伯醇的利用試驗均參考文獻(xiàn)[8]。

1.4 病原菌16S rDNA鑒定

1.4.1 基因組DNA的提取 將保存于-80 ℃的菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線，在28 ℃下培養(yǎng)18～24 h，挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。細(xì)菌基因組提取采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的通用柱式基因組提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。

1.4.2 16S rDNA基因片段擴(kuò)增 試驗用引物為16sF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和16sR：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用50 μL反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL，用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4.3 16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，采用MEGA6.06軟件中Maximum Likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的回接測定

蘿卜葉片和蘿卜塊根在病原菌接種12 h后均開始出現(xiàn)病癥。葉柄接種處出現(xiàn)濕潤狀淡褐色病斑后，沿葉脈向上擴(kuò)展，葉柄逐漸變軟腐爛；蘿卜塊根接種處病斑呈水浸狀，并以接種處為中心向四周擴(kuò)展，病部組織逐步軟化腐??；葉柄基部和塊根病部組織均滲出黃褐色黏液，并散發(fā)出臭味（圖1）。其癥狀與田間采集的蘿卜軟腐病樣癥狀一致。從發(fā)病的蘿卜上再次分離得到病原菌，與原病原菌相同，符合柯赫氏法則。

2.2 病原菌形態(tài)及生理生化特征

分離得到的3個菌株在LB固體培養(yǎng)基上均形成乳白色圓形或不定型菌落，中部凸起，表面光滑；菌體短桿狀，2～8根周生鞭毛，革蘭氏染色陰性。

通過生理生化測定，3個菌株除檸檬酸鹽利用外均表現(xiàn)一致。過氧化酶陽性，氧化酶陰性，苯丙氨基酸脫氨酶陰性，硝酸鹽還原陽性，亞硝酸鹽還原陰性，果膠水解陽性，葡萄糖代謝為發(fā)酵型，能使明膠液化，可分解纖維素，能引起馬鈴薯腐敗，能從半胱氨酸中產(chǎn)H2S，能在37 ℃下生長，并且均能利用蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇和阿拉伯醇（表1）。這些生物學(xué)特征符合文獻(xiàn)[9]中對胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Pectobacterium carotovorum）的描述。

2.3 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將3個菌株的16S rDNA基因測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示菌株LC1和XZ1與已發(fā)表的Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis（Pcb）序列相似性均達(dá)99%。菌株XZ1與已發(fā)表的Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum（Pcc）序列相似性達(dá)99%。以Proteus hauseri strain S3-4為外組，用MEGA6.06軟件中Maximum Likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果表明，LC1、XZ1分別與P. carotovorum subsp. brasiliense strain KP187495.1、P. carotovorum subsp. brasiliense strain KU997680.1聚為一類。XS1與P. carotovorum subsp. carotovorum strain JF926733.1聚為一類。

2.4 病原菌的致病力差異測定

參照胡娜娜等[5]的方法測定病原菌致病力差異，發(fā)現(xiàn)在22、25、28 ℃下，3個菌株致病力存在明顯差異（圖3）。在相同溫度下，病原菌致病力由低到高分別為LC1、XZ1和XS1。同一菌株，隨溫度的升高，發(fā)病程度也逐漸加重（表2）。亞種與亞種之間病原菌致病力存在差異，屬于P. carotovorum subsp. carotovorum strain的XS1致病力高于屬于P. carotovorum subsp. brasiliense strain的LC1和XZ1。亞種內(nèi)病原菌致病力也存在著差異，在同等條件下，LC1的致病力小于XZ1。

3 小結(jié)與討論

本研究從湖北利川、江蘇徐州和浙江蕭山3個蘿卜主產(chǎn)區(qū)的蘿卜軟腐病病樣上分別得到菌株LC1、XZ1和XS1，通過對其進(jìn)行生物學(xué)特性分析和16S rDNA序列分析， 鑒定得到LC1和XZ1為P. carotovorum subsp. brasiliense strain，XS1為P. carotovorum subsp. carotovorum strain。

病原菌主要從植物自然裂口和傷口侵入植株，溫度高、濕度大有利于軟腐病的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜果膠軟腐桿菌的兩個亞種P. carotovorum subsp. brasiliense 和P. carotovorum subsp. carotovorum在溫度的變化下，致病力變化趨勢較為一致，均在一定溫度范圍內(nèi)隨溫度的升高而升高。近年來，受全球氣候變暖和極端天氣的影響，溫度升高和連續(xù)降雨機(jī)率增加，加之規(guī)模化種植的連作效應(yīng)，土壤病原菌基數(shù)大，導(dǎo)致生產(chǎn)上的軟腐病病情逐年加重，需要引起足夠重視。

在自然生態(tài)體系下，寄主植物、病原菌和環(huán)境條件三者相互影響。病原菌自身的遺傳變異在長期的自然選擇和人為選擇下，形成不同的病原菌群體。本研究中，不同蘿卜種植區(qū)分離得到的蘿卜軟腐病病原菌存在差異，即使同屬于一個亞種，致病力也存在著明顯差異。

根據(jù)以往的文獻(xiàn)記錄，油菜和十字花科蔬菜軟腐病病原菌為P. carotovorum subsp. carotovorum strain[10]。自2004年Duarte等從馬鈴薯黑脛病組織分離到P. carotovorum的新亞種P. carotovorum subsp. brasiliense后，陸續(xù)有報道該亞種能侵染芹菜、黃瓜、紅辣椒、大白菜和甜菜等作物[11-14]。亞種之間致病力也存在不同，本研究中屬于P. carotovorum subsp. carotovorum 的XS1致病力高于屬于P. carotovorum subsp. brasiliense的LC1和XZ1。但是否P. carotovorum subsp. carotovorum亞種的致病力高于P. carotovorum subsp. brasiliense亞種，由于菌株樣本少而無法得出該結(jié)論，有待進(jìn)一步的調(diào)查研究。

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