貴州薏苡黑穗病的發(fā)病情況及其病原菌的分離鑒定

劉榮++申剛

摘要 為有效防治薏苡黑穗病，提高薏苡的質量和產量，通過抽樣調查薏苡黑穗病的發(fā)病情況，并采用組織分離法分離得到薏苡黑穗病病原菌，結合形態(tài)學描述、ITS序列比對分析該菌。結果表明：薏苡不同品種（系）之間的感病情況存在差異，同一品種在不同區(qū)域的耐病性也不盡相同。此外，結合形態(tài)特征和分子生物學方法鑒定得到該病原菌為薏苡黑粉菌。

關鍵詞 薏苡黑穗??；發(fā)病情況；病原菌；分離鑒定；貴州地區(qū)

中圖分類號 S412 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）22-0102-02

Abstract For controlling job′s-tears smut，improving the quality and yield of Coix lacryma-jobi L.，surveyed morbidity of job′s-tears smut，obtained job′s-tears smut by tissue separation，and analyzed the bacteria in combiation with morphological description，ITS sequence alignment.The results showed that occurrence situation of job′s-tears was different among different varieties （or lines） of Coix lacryma-jobi L.，the same varieties in different regions also had different diseased resistance.In addition，we identified the pathogen of job′s-tears was Ustilago coicis Brefeld combined with morphological characteristics with molecular biology methods.

Key words job′s-tears smut；morbidity；pathogenic bacteria；identification；Guizhou Area

薏苡（Coix lacryma-jobi L.），又名藥玉米，屬于禾本科（Poaceae）薏苡屬（Coix）。薏苡作為一種藥食兼用作物，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值，被譽為“世界禾本科植物之王”[1]。雖然國發(fā)[2012]2號文件已將薏苡列為貴州特色發(fā)展的主要作物之一，但是貴州地區(qū)常年雨量充沛，時空分布不均，3個多雨區(qū)之一位于省之西南部，降雨日數(shù)較多，相對濕度較大。而水分是影響薏苡黑粉菌厚垣孢子萌發(fā)的主要因素之一[2]。薏苡在種植過程中易感染薏苡黑穗病，嚴重制約著薏苡的產量和品質。薏苡黑穗病是由薏苡黑粉菌（Ustilago coicis Brefeld）引起，病原屬于擔子菌亞門；該病易感染，分布廣，在大多數(shù)國家均有報道[3-4]。據(jù)1957年、1958年進行的田間調查，發(fā)現(xiàn)薏苡黑穗病危害十分嚴重，大田的平均病株率達80%～100%，病癭率達50%以上[5]。隨著薏苡感病雜交種的推廣，連作薏苡的增加，薏苡黑穗病害不斷蔓延、加重，以致薏苡產量喪失嚴重。因此，筆者就貴州地區(qū)薏苡同一品種不同生育期以及不同品種間黑穗病進行調查分析，并將薏苡黑穗病病原菌進行分類鑒定，旨在摸清薏苡種植區(qū)病情發(fā)生情況，為該地區(qū)的薏苡黑穗病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 薏苡黑穗病發(fā)生情況調查

供試材料為Y83、Y160、Y164，共3個品種（系）；各品種（系）的基本信息如表1所示。

調查時間為2014年5—10月及2015年5—10月；調查地點位于貴州省興義市、興仁縣、貞豐縣、晴隆縣，以主栽區(qū)興仁縣為主。選擇歷年薏苡黑穗病發(fā)病較重的種植區(qū)進行調查。采用對角線5點取樣，每點10株，每個品種4個重復，調查薏苡黑穗病發(fā)病率和嚴重度。

1.2 薏苡黑穗病病原菌的分離鑒定

病原菌的分離采用組織分離法及單孢分離法。病原菌的形態(tài)鑒定參考《中國真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”描述進行。病原菌的分子鑒定運用通用引物ITSl（5′-TCCGTA-GGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′）一對引物進行病原菌的ITS（internal transcribed spacer）序列的擴增，連接轉化后對陽性轉化子進行克隆測序；利用軟件DNAStar的MegAlign程序和NCBI上的Blastn程序進行序列比對分析。 儀器與試劑：BX51型顯微鏡（OL-YMPUS）、XD-1型二氧化碳臨界點干燥器（Eiko公司）、IB-3型離子鍍金儀（Eiko公司）、JSM-6390LV掃描電鏡（JEOL公司）；葡萄糖、瓊脂粉、3%戊二醛、乙醇、乙酸異戊脂等。

2 結果與分析

2.1 不同品種（系）薏苡黑穗病發(fā)生情況

薏苡黑穗病主要感染薏苡的莖、葉、穗。由表2可知，薏苡在種植過程中感染黑穗病的情況較嚴重，且不同品種（系）之間的感病情況存在差異。從調查的3個品種（系）來看，Y83的病株率較其他2個品種高，Y160的發(fā)病率大于Y164的發(fā)病率。以調查地點為依據(jù)，不同地區(qū)的感病性也不盡相同，3個品種抗黑穗病能力在興仁縣均較弱，Y83和Y160在興義市的發(fā)病率相對要低些，而Y164在晴隆縣的耐病性較高。從而可以推斷，Y164的抗病能力強于Y160和Y83，而Y83的抗病能力最弱。

2.2 薏苡黑穗病病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定。通過分離得到薏苡黑穗病病原菌后，將其接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)過程中進行菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察。圖1為病原菌培養(yǎng)15 d后的菌落形態(tài)，可以看出：菌落直徑約為5.82 cm，菌落中央皺褶凸起、邊緣整齊，表面呈白色、反面淡黃色。顯微形態(tài)觀察：成熟的黑粉孢子近球形或卵圓形，7.45～11.00 μm×7.5～10.5 μm，有刺。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：刺間有小疣。以上形態(tài)觀察描述與《中國真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”的薏苡黑粉菌的形態(tài)特征一致，初步斷定該病原菌為薏苡黑粉菌。

2.2.2 分子鑒定。根據(jù)形態(tài)鑒定的結果，選取3個典型菌株，并采用CTAB法提取其基因組DNA。以基因組DNA為模板，ITSl和 ITS4為引物進行PCR擴增，獲得約600 bp的片段（圖2），克隆測序后分析顯示：3株菌株的擴增序列一致，將其ITS序列在NCBI（national center for biotechnology information）上進行Blastn（核苷酸序列比對）同源性分析發(fā)現(xiàn)：該序列與Ustilago coicis（JX219371.1）的ITS 1 5.8S 核糖體RNA基因相似性最高，達99%（圖3）。進一步證實薏苡病原菌為薏苡黑粉菌。

3 結論與討論

通過對Y83、Y160、Y164 3個品種在不同區(qū)域耐黑穗病能力進行調查，結果顯示Y83抗黑穗病能力最弱，Y160次之；同時調查同一品種在不同區(qū)域的耐病性，不同地區(qū)的感病性也不盡相同，不同品種（系）在興仁縣的發(fā)病率都相對較高。由此可以推斷：薏苡不同品種在同一地區(qū)感染黑穗病的發(fā)生情況存在差異；因貴州地區(qū)特殊的氣候條件，薏苡同一品種在不同區(qū)域耐黑穗病能力不同。而且黔西南屬于貴州省三大多雨區(qū)之一，降雨日數(shù)較多，相對濕度較大，這種溫濕度適宜孢子萌發(fā)生長。因此，在選擇薏苡種植品種時，不僅要重視薏苡的品質、產量，還要考慮品種的抗病能力。

對分離得到的黑穗病病原菌進行形態(tài)和分子的綜合鑒定，觀察得到3個菌株的形態(tài)特征和測序結果一致。1940年，Mundkur[6]對植物黑穗病調查研究過程中發(fā)現(xiàn)薏苡黑粉菌，并命名為C.lacryma-jobi Mundkur。而Chowdhury[7]提出的觀點與Mundkur存在分歧，他在研究過程中把此菌與Ustilago coicis同義進行報道。后來，Zhang等[8]對該菌的超顯微形態(tài)結構和分子系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析后得出：該菌與Ustilago trichophora親緣關系最近，達84%。但筆者將研究結果同《中國真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”比較以及對序列比對分析，初步斷定該病原菌為薏苡黑粉菌。

4 參考文獻

[1] 楊繼祥.藥用植物栽培學[M].北京：農業(yè)出版社，1993：284-292.

[2] 王秀全，傅建國.薏苡黑粉病的防治[J].中藥材，1985（3）：3.

[3] SMALL W.Matter of phytopathological interest during 1926[J].Rev Appl Myco，1927（6）：273-274.

[4] TITATARN S，CHIENGKUL A，UNCHALISANGKAS D，et al.Occurren-ce of Ustilago coicis on Coix lachryma-jobi in Thailand[J].Plant Dis，1983，67（4）：434-435.

[5] 李彥勇，鄭茂源.薏苡黑穗病[J].植物保護，1964（6）：13.

[6] MUNDKUR B B.A second contribution towards a knowledge of Indian Ustilaginales：Fragments xxvi-l.[J].Trans Br Mycol Soc，1940，24（3/4）：312-336.

[7] CHOWDHURY S.Some studies on the smut Ustilago coicis Bref.of Job′s tears millet[J].J.Indian Bot，Soc，1946（25）：123-130.

[8] ZHANG J Z，GUAN P G，TAO G，et al.Ultrastructure and phylogeny of Ustilago coicis[J].Journal of Zhejiang University SCIENCE B，2013，14（4）：336-345.