草魚腸道不動(dòng)桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

胡秀彩+李旭+呂愛軍

摘要：從草魚腸道中分離獲得1株細(xì)菌，編號(hào)為CAX1，進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、理化特征、16S rDNA序列分析及藥敏試驗(yàn)等研究。結(jié)果表明CAX1菌株為革蘭氏陰性短桿菌，進(jìn)一步采用PCR方法擴(kuò)增其16S rDNA，測(cè)序顯示其大小為 1 531 bp，序列比對(duì)表明CAX1分離株與廈門不動(dòng)桿菌新種（Acinetobacter xiamenensis）16S rDNA同源性達(dá)97.1%，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示CAX1菌株與不動(dòng)桿菌親緣關(guān)系最近，自然聚類為1支；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示CAX1菌株對(duì)慶大霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢哌酮等藥物敏感。

關(guān)鍵詞：草魚；腸道細(xì)菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)；系統(tǒng)進(jìn)化樹

中圖分類號(hào)： S943.112.42 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0256-02

不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）菌株在自然界廣泛存在，主要分布在水體和土壤中，易在潮濕環(huán)境中生存，目前確定的不動(dòng)桿菌屬至少有10多個(gè)種[1-3]，包括鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumanii）、魯菲不動(dòng)桿菌（Acinetobacter lwoffi）、溶血不動(dòng)桿菌（Acinetobacter haemolytius）、瓊氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter junii）、約翰遜不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii）、醋酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus），以及新發(fā)現(xiàn)的廈門不動(dòng)桿菌（Acinetobacter xiamenensis）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter guillouiae）等。近年來(lái)，一般認(rèn)為不動(dòng)桿菌多為條件致病菌，其中鮑曼不動(dòng)桿菌引起醫(yī)院內(nèi)感染頻發(fā)，耐藥菌株不斷增多，因此該屬細(xì)菌被廣泛關(guān)注[4]。最近，國(guó)內(nèi)學(xué)者從異育銀鯽、錦鯉等魚類體內(nèi)分離到致病性鮑曼不動(dòng)桿菌、瓊氏不動(dòng)桿菌等[5-6]。但是，目前尚未見魚源廈門不動(dòng)桿菌分離鑒定相關(guān)研究。本研究以草魚為研究對(duì)象，從其腸道中分離獲得1株不動(dòng)桿菌，并進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化以及16S rDNA測(cè)序等分析鑒定為廈門不動(dòng)桿菌，這為草魚不動(dòng)桿菌的分離鑒定以及腸道微生態(tài)研究積累了科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚購(gòu)自徐州市某市場(chǎng)。LB培養(yǎng)基、細(xì)菌生化微量鑒定和藥敏試紙均購(gòu)自杭州微生物制劑有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、pMD18-T、Master Mix均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離、鑒定、理化性質(zhì)及藥敏試驗(yàn) 參照沈曉靜等的方法[7]進(jìn)行細(xì)菌分離純化、革蘭氏染色及生化鑒定，將純化培養(yǎng)后的細(xì)菌分別接種于21種生化管中，28 ℃培養(yǎng) 24～28 h，觀察分離細(xì)菌的生理生化反應(yīng)。無(wú)菌環(huán)境下將藥敏紙片分別置于涂有均勻菌液的LB固體培養(yǎng)基表面，28 ℃培養(yǎng)16～18 h后測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算平均值，確定該菌對(duì)不同藥物的敏感程度。

1.2.2 細(xì)菌總DNA提取、16S rDNA基因PCR擴(kuò)增 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板1 μL，細(xì)菌通用引物（27F：AGAGTTTGATCATGGCTCA，1492R：TACGGTTACCTTGTTACGACTT）各1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃變性40 s，53 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。瓊膠糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測(cè)PCR結(jié)果，PCR產(chǎn)物切膠回收，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 將16S rDNA序列通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，使用 ClustalX 1.81 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA 4.1軟件鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離

從市售草魚腸道內(nèi)分離純化獲得1株細(xì)菌，編號(hào)為CAX1，革蘭氏染色觀察為陰性小桿菌，多為單個(gè)分散分布。CAX1菌株接種于LB培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h后，為光滑、透明、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊的圓形菌落（圖1）。

2.2 理化特征及藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離菌進(jìn)行生化特性檢測(cè)，結(jié)果（表1）表明，CAX1菌株為葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖檢測(cè)試驗(yàn)呈陽(yáng)性，精氨酸雙水解、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖酸鹽、肌醇、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蜜二糖、鼠李糖、硫化氫、山梨醇、木糖醇、木糖檢測(cè)試驗(yàn)呈陰性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示CAX1菌株對(duì)慶大霉素、阿莫西林、頭孢哌酮、復(fù)方新諾明等9種抗生素敏感，對(duì)諾氟沙星、頭孢孟多、頭孢噻吩、先鋒霉素Ⅳ、氯霉素、四環(huán)素等抗生素不敏感。

2.3 16S rDNA基因測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以CAX1細(xì)菌基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增CAX1菌株的16S rDNA序列，電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)約在 1 500 bp 處有明顯目的條帶；進(jìn)一步對(duì)16S rDNA測(cè)序表明目的片段大小為1 531 bp。將16S rDNA通過(guò)Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果表明CAX1菌株與廈門不動(dòng)桿菌新種序列同源性為97.1%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示CAX1菌株與不動(dòng)桿菌的親緣關(guān)系最近，自然聚類為1支（圖2）。

3 討論

不動(dòng)桿菌屬是一類非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，在水體和土壤中分布廣泛。研究表明不動(dòng)桿菌是一種條件致病菌，一般認(rèn)為毒力較低，在機(jī)體抵抗力下降或免疫功能受損時(shí)易出現(xiàn)機(jī)會(huì)感染[6-8]。鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染的重要病原菌之一。劉子驥等認(rèn)為洛菲不動(dòng)桿菌與呼吸道感染有關(guān)[3]。明德松等研究報(bào)道魯氏不動(dòng)桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物普遍耐藥，對(duì)氨基糖苷類、氟喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類等敏感[2]。黃林等研究發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌能引起肉質(zhì)腐敗，主要利用氨基酸，致腐能力較低[9]。在魚類中，目前對(duì)不動(dòng)桿菌研究報(bào)道主要有鮑曼不動(dòng)桿菌、瓊氏不動(dòng)桿菌和洛菲不動(dòng)桿菌[10-11]。陳翠珍等從錦鯉體內(nèi)分離出瓊氏不動(dòng)桿菌[5]。毛芝娟等分離獲得瓊氏不動(dòng)桿菌，引起患病史氏鱘癥狀為體表褪色、肛門紅腫、腹腔腫大伴有大量血性腹水[10]。陸文浩等從異育銀鯽分離鑒定出鮑曼不動(dòng)桿菌，患病癥狀為腹腔積水、咽腔組織充血和鰓組織發(fā)炎等[6]。張涵等研究表明三角帆蚌、銀鯽、青魚、鳙等腸道優(yōu)勢(shì)菌群均有不動(dòng)桿菌屬，推測(cè)不動(dòng)桿菌為淡水魚類腸道優(yōu)勢(shì)菌[11]。目前尚無(wú)研究表明廈門不動(dòng)桿菌對(duì)魚類具有致病性[12]。本研究從草魚腸道分離獲得CAX1菌株，采用細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、理化特征、16S rDNA序列以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析等方法，最終鑒定為廈門不動(dòng)桿菌，在魚類腸道中尚屬首次報(bào)道，有待于進(jìn)一步深入研究。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，CAX1菌株對(duì)慶大霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢哌酮、復(fù)方新諾明等抗生素敏感，以上研究為魚類不動(dòng)桿菌的分離鑒定以及腸道微生態(tài)研究提供科學(xué)參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]胡 源，何麗華，張建中. 鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株分子生物學(xué)鑒定分析[J]. 疾病監(jiān)測(cè)，2010，25（3）：202-204.

[2]明德松，潘艷萍，朱 炎. 魯氏不動(dòng)桿菌的臨床分布及耐藥性分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24（10）：2351-2353.

[3]劉子驥，王 焱，岳啟安，等. 新型洛菲不動(dòng)桿菌的分離與鑒定[J]. 中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2011，6（7）：494-496.

[4]韓 蕾，張旭燕，韓少山，等. 臨床致病性不動(dòng)桿菌的分子生物學(xué)鑒定[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，33（5）：611-616.

[5]陳翠珍，張曉君，房 海，等. 錦鯉中瓊氏不動(dòng)桿菌的分離與鑒定[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志，2009，2（1）：86-90.

[6]陸文浩，陳 輝，王習(xí)達(dá)，等. 異育銀鯽致病性鮑曼不動(dòng)桿菌的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2009，39（4）：303-309.

[7]沈曉靜，胡秀彩，蘭 云，等 .錦鯉熒光假單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2014，33（7）：443-446.

[8]李勁松，魏殿軍，祁 偉，等. 鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株的耐藥分析[J]. 天津醫(yī)藥，2003，31（6）：373-375.

[9]黃 林，陳全勝，張燕華，等. 冷卻豬肉優(yōu)勢(shì)腐敗菌分離鑒定及致腐能力測(cè)定[J]. 食品科學(xué)，2013，34（1）：205-209.

[10]毛芝娟，毛甬州，汪建萍. 兩株魚源瓊氏不動(dòng)桿菌的分離、鑒定和耐藥特性分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2013，37（10）：1572-1576.

[11]張 涵，周 濤，王 巖. 綜合養(yǎng)殖池塘中三角帆蚌和魚類腸道細(xì)菌的組成[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2013，37（5）：824-835.

[12]劉 君，宋曉玲，陳志鑫. 益生菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的作用研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（9）：78-81.