鈉離子對(duì)洋蔥細(xì)胞程序性死亡的誘導(dǎo)

趙錦慧+周琳

摘要：對(duì)洋蔥進(jìn)行活化培養(yǎng)，探討鈉離子不同誘導(dǎo)濃度與時(shí)間對(duì)洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞程序性死亡的影響。結(jié)果表明：隨著鈉離子誘導(dǎo)濃度的升高及誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形狀和結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生不同程度的變化，細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，細(xì)胞中丙二醛含量上升，且細(xì)胞凋亡率及丙二醛含量在不同處理間均差異顯著。說(shuō)明鈉離子在一定誘導(dǎo)濃度與時(shí)間下，對(duì)洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡率、丙二醛含量均有不同程度的影響。

關(guān)鍵詞：鈉離子；洋蔥；細(xì)胞程序性死亡；細(xì)胞凋亡率；丙二醛

中圖分類(lèi)號(hào)： Q942 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0189-02

20世紀(jì)90年代初國(guó)際上才把細(xì)胞程序性死亡（PCD）概念引入到植物學(xué)，隨后有關(guān)研究遍布植物發(fā)育生物學(xué)、植物生理學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域[1-5]。PCD和細(xì)胞凋亡意義相同，均屬于細(xì)胞生理性死亡，它貫穿高等植物生長(zhǎng)發(fā)育的一生，具有重要的生命意義。

中國(guó)每年的農(nóng)作物和瓜果蔬菜都會(huì)受到各種逆境因子不同程度的影響，因此對(duì)植物的抗逆性機(jī)制及調(diào)控進(jìn)行研究，既有理論意義又有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。鹽脅迫是植物經(jīng)常遇到的逆境之一，Katsuhara研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫誘導(dǎo)的大麥根部細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出典型的凋亡特征[6]，揭示了根部細(xì)胞凋亡可能是植物抗鹽脅迫的一種生理機(jī)制。本試驗(yàn)選用洋蔥鱗莖內(nèi)表皮作為材料，對(duì)鈉離子不同誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時(shí)間下洋蔥細(xì)胞程序性死亡現(xiàn)象進(jìn)行研究，主要觀察凋亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生的變化，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率及測(cè)定細(xì)胞中丙二醛含量。旨在探索鈉離子不同處理濃度及處理時(shí)間誘導(dǎo)洋蔥細(xì)胞程序性死亡的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

市售隔年洋蔥。

1.2 試劑

0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L氯化鈉溶液、PBS緩沖液、改良苯酚品紅染液、10%三氯乙酸、0.6%硫代巴比妥酸等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 洋蔥的預(yù)處理 取隔年洋蔥，室溫下于清水中培養(yǎng) 2～3 d，每天換水，直到露出幼嫩的白根，表明洋蔥已被活化。

1.3.2 細(xì)胞程序性死亡觀察 取活化后的洋蔥鱗莖，切取約1 cm2的內(nèi)表皮若干，分成3組進(jìn)行處理。第1組是正對(duì)照，在PBS緩沖液中處理1 h；第2組是鈉離子誘導(dǎo)組，分別用0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl誘導(dǎo)1、4 h；第3組是負(fù)對(duì)照，在沸水中處理5 min。各組處理結(jié)束后，將洋蔥鱗莖內(nèi)表皮用改良苯酚品紅染液染色10～15 min，染色完成后制成玻片標(biāo)本，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。選擇染色效果好、背景干凈、細(xì)胞分散良好的視野進(jìn)行拍照，并對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野中觀察的細(xì)胞總數(shù)×100%。每個(gè)處理觀察3個(gè)玻片標(biāo)本，細(xì)胞凋亡率用3個(gè)視野統(tǒng)計(jì)的平均值表示。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 參照劉萍等的方法[7]，用硫代巴比妥酸法測(cè)定細(xì)胞中丙二醛（MDA）含量，測(cè)定時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，最終含量用平均值表示。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2003對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，在95%水平上進(jìn)行One-Way ANOVA分析處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

圖1顯示，正對(duì)照組細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞之間的界限分明，細(xì)胞膜完整無(wú)損，細(xì)胞質(zhì)透明，背景干凈，細(xì)胞核呈球形。負(fù)對(duì)照組細(xì)胞輪廓及細(xì)胞之間的界限消失，細(xì)胞膜、細(xì)胞壁完全裂解，部分細(xì)胞核也發(fā)生裂解并且其形狀和位置均發(fā)生一定變化，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)碎末狀物質(zhì)，背景不干凈，細(xì)胞不能保持結(jié)構(gòu)的完整。

2.2 不同濃度鈉離子誘導(dǎo)1 h后細(xì)胞程序性死亡觀察

圖2顯示，不同濃度Na+誘導(dǎo)1 h后，隨著Na+濃度的增加，細(xì)胞輪廓及細(xì)胞之間的界限逐漸模糊，質(zhì)壁分離程度加深，形狀及位置發(fā)生變化的細(xì)胞核增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的碎末狀或塊狀物質(zhì)越來(lái)越多，細(xì)胞背景不干凈。

2.3 不同濃度鈉離子誘導(dǎo)4 h后細(xì)胞程序性死亡觀察

圖3顯示，不同濃度Na+誘導(dǎo)4 h后，細(xì)胞形態(tài)特征發(fā)生了更明顯的變化，部分細(xì)胞的細(xì)胞膜已經(jīng)破裂，細(xì)胞核輪廓模糊，著色變淺，細(xì)胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象更明顯，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)塊狀或碎末狀物質(zhì)更多，細(xì)胞背景極不干凈。

2.4 不同濃度鈉離子誘導(dǎo)下洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞凋亡情況

圖4顯示，隨著Na+誘導(dǎo)濃度的增加及誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)，并且各處理間差異顯著。這說(shuō)明不同濃度的Na+誘導(dǎo)不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生了不同程度的影響。

2.5 不同處理下洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞中丙二醛（MDA）含量的變化

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的代謝產(chǎn)物，其生物活性強(qiáng)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，它的含量可以間接反映氧自由基對(duì)植物細(xì)胞的損傷程度。圖5顯示，Na+誘導(dǎo)組丙二醛含量均高于正對(duì)照組，并且A3～A9與A1間均表現(xiàn)出顯著差異。同樣誘導(dǎo)濃度下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，MDA含量快速增加；同樣誘導(dǎo)時(shí)間下，隨著誘導(dǎo)濃度的增加，誘導(dǎo)時(shí)間短時(shí)MDA含量增加幅度小，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)時(shí)MDA含量增加幅度大。這說(shuō)明一定濃度的Na+作用一定時(shí)間，會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成明顯傷害，并且Na+誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)丙二醛的產(chǎn)生影響更大。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，正對(duì)照組細(xì)胞輪廓清晰，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整；負(fù)對(duì)照組細(xì)胞輪廓消失，形態(tài)和結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化，細(xì)胞不能保持完整；Na+誘導(dǎo)組細(xì)胞輪廓發(fā)生變化，細(xì)胞質(zhì)壁出現(xiàn)不同程度的分離，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化，Na+誘導(dǎo)濃度和時(shí)間與細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中丙二醛含量成正比。

NaCl之所以能夠誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，其可能機(jī)制是：（1）細(xì)胞程序性死亡需要大量的ATP，而線(xiàn)粒體是能不斷產(chǎn)生ATP的一種重要的細(xì)胞器，位于線(xiàn)粒體外膜上的受體可以被NaCl刺激，導(dǎo)致膜通透性孔不斷保持開(kāi)放狀態(tài)，最終使得線(xiàn)粒體的膜通透性增強(qiáng)，使細(xì)胞色素C、一些凋亡誘導(dǎo)因子等被釋放，從而加快細(xì)胞程序性死亡。（2）Na+濃度升高時(shí)，膜質(zhì)過(guò)氧化物會(huì)在細(xì)胞內(nèi)形成，這會(huì)破壞細(xì)胞膜上鈣離子與鈉離子的相對(duì)平衡狀態(tài)，造成細(xì)胞膜上的Ca2+被Na+替換掉，從而改變Ca2+的流向，使得Ca2+由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外流動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的透性增強(qiáng)，使細(xì)胞內(nèi)的某些凋亡誘導(dǎo)因子等物質(zhì)被釋放，進(jìn)而加快細(xì)胞程序性死亡。（3）Na+濃度越高，細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離的程度越高， 達(dá)到一定程度后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)液泡裂解，然后液泡中的酸性水解酶等就會(huì)被釋放出來(lái)，它的釋放可以使細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、高爾基體、核糖體、細(xì)胞膜、線(xiàn)粒體等被分解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變后誘發(fā)了細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生[7-9]。

目前對(duì)PCD有關(guān)的基因、PCD 的調(diào)節(jié)途徑、各信號(hào)分子的調(diào)節(jié)機(jī)理以及信號(hào)分子之間的關(guān)系等均獲得了一些了解。但是對(duì)洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞發(fā)生PCD時(shí)，相關(guān)酶和蛋白質(zhì)之間是怎樣聯(lián)系并發(fā)揮作用的還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Greenberg J T，Guo A，Klessig D F，et al. Programmed cell death in plants：a pathogen-triggered response activated coordinately with multiple defense functions[J]. Cell，1994，77：551-563.

[2]Mccabe P F，Levine A，Mejjer P J，et al. A programmed cell death pathway activated in carrot cell cultured at low cell density[J]. Plant J，1997，12：267-280.

[3]Pennell R I，Lamb C. Programmed cell death in plants[J]. Plant Cell，1997，9：1157-1168.

[4]Yen C H，Yang C H. Evidence for programmed cell death during leaf senescence in plants[J]. Plant Cell Physiol，1998，39：922-927.

[5]Xu Y，Hanson M R. Programmed cell death during pollination-induced petal senescence in petunia[J]. Plant Physiol，2000，122：1323-1333.

[6]Katsuhara M. Apoptosis-like cell death in barley roots under salt stress[J]. Plant Cell Physiol，1997，38：1091-1093.

[7]劉 萍，李明軍. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2007：150-152.

[8]肖 軍，高 杰. 高等植物細(xì)胞凋亡的誘因及生物學(xué)意義[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（1）：125-128.

[9]李云霞，程曉霞，代小梅，等. 植物在逆境脅迫中的細(xì)胞程序性死亡[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2009（4）：7-11.