一例肉雞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒與圓圈病毒混合感染的實驗室診斷

胡峰 武蕾蕾 吳靜 李玉峰

摘 要：黑龍江地區(qū)某養(yǎng)殖場，28日齡商品肉雞出現(xiàn)精神萎靡，采食量下降，生長緩慢的癥狀，發(fā)病雞在眼、鼻、喙部位出現(xiàn)潰瘍結(jié)痂。病雞剖檢病理變化主要是腺胃出血、乳頭腫脹，腎臟腫大、脾臟出血壞死、法氏囊萎縮、腸炎等，病原學(xué)核酸檢測結(jié)果表明該雞場存在禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒和圓圈病毒3型的混合感染。本病例的實驗室診斷為家禽疫病防控提供了部分理論基礎(chǔ)和有效參考。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒；圓圈病毒；混合感染；實驗室診斷

中圖分類號：S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1673-1085（2024）06-0012-05

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（Reticuloendotheliosis，RE）是由網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus， REV）引起的以免疫抑制、矮小綜合征和腫瘤形成為特征的一群病理綜合征[1]。REV感染宿主范圍廣，可以感染雞、鴨、鵝、野生鳥類[2]。RE是迄今已確定的禽類重要的免疫抑制性疾病，可垂直傳播，呈世界性分布[3]。目前，在我國養(yǎng)禽業(yè)面臨的一個重要問題就是禽類反轉(zhuǎn)錄病毒（禽白血病病毒和REV）感染造成的雞群免疫抑制，進(jìn)而易于繼發(fā)其他疾病[4]。同時由于REV可污染疫苗造成免疫失敗，在雞群中的危害正日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展造成巨大的挑戰(zhàn)[5]。

圓圈病毒（Gyrovirus，GyVs）是環(huán)狀單鏈DNA 病毒，屬于細(xì)環(huán)病毒科，圓圈病毒屬[6]。據(jù)報道，在人的皮膚、腹瀉患者的糞便以及發(fā)病雞中均可檢測到GyVs[6，7]。目前，已有研究報道圓圈病毒3型（GyV-3）與雞傳染性腺胃炎存有一定的關(guān)系[8]，且在雞群中的感染呈上升趨勢。另外，GyV-3既可以感染雞，也可以感染哺乳動物小鼠，存在一定的公共衛(wèi)生風(fēng)險[9]。

本研究針對送檢的疑似病例，結(jié)合發(fā)病雞臨床癥狀，利用分子生物學(xué)檢測技術(shù)，確定該病例為REV和GyV-3雙重感染，具體報告如下。

1? 材料與方法

1.1? 樣品背景

黑龍江地區(qū)某養(yǎng)雞場，28日齡商品肉雞出現(xiàn)精神萎靡，采食量下降，生長緩慢的癥狀，發(fā)病雞在眼、鼻、喙部位出現(xiàn)潰瘍結(jié)痂。剖檢可見腺胃出血、腺胃乳頭腫脹、腎腫、脾出血壞死、法氏囊萎縮、腸炎等病變。

1.2? 樣品處理

發(fā)病雞心臟、肺臟、肝臟、腺胃、脾臟等臟器與滅菌生理鹽水按1：5的比例混合，勻漿打碎制成混懸液，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心10 min，取上清，利用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取病毒核酸。

1.3? PCR檢測

針對家禽常見的免疫抑制病、呼吸道疾病以及已報道的雞腺胃炎等相關(guān)疾病設(shè)計并合成引物，利用PCR或RT-PCR分子生物學(xué)檢測方法進(jìn)行病原檢測。PCR反應(yīng)體系和RT-PCR反應(yīng)體系參照2 ×Taq PCR StarMix和2 × ES One-Step Reaction Mix試劑盒說明書進(jìn)行配制。PCR反應(yīng)條件是94 ℃預(yù)變性120 s，94 ℃變性30 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，擴增35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。RT-PCR反應(yīng)條件是45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，擴增35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察，并根據(jù)擴增目的基因片段大小判定結(jié)果。

1.4? 雞胚試驗

將1.2中制備的組織病料混懸液，10 000 r/min離心10 min，取上清，青鏈霉素（各1萬IU/mL）作用2 h后，過濾除菌，經(jīng)絨毛膜途徑接種10日齡SPF雞胚，每天觀察雞胚生長狀況。

2? 結(jié)果

2.1? 病理解剖與病變觀察

病雞精神萎靡，采食量下降，生長緩慢，在眼、鼻、喙部位出現(xiàn)潰瘍、出血、結(jié)痂，剖檢主要眼觀病理變化為腺胃出血、腺胃乳頭腫脹、腎腫、脾出血壞死、法氏囊萎縮、腸炎等，見圖1。

2.2? 實驗室PCR檢測結(jié)果

以1.2中提取的病毒DNA/RNA為模板，利用實驗室設(shè)計的特異性引物，按照1.3中PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行病原核酸檢測，分別擴增出大小380 bp（REV）和330 bp（GyV-3）的特異條帶，與預(yù)期的目的條帶一致，而針對其它常見病毒的引物均未擴增出特異條帶，同時結(jié)合雞群臨床癥狀、剖檢病變，該病例為REV和GyV-3混合感染，其它病原為陰性，電泳結(jié)果見圖2。

2.3? 雞胚致病性分析

制備的病料混懸液無菌處理后，吸取0.2 mL，經(jīng)絨毛膜途徑接種10日齡SPF雞胚。結(jié)果顯示接種72 h后，開始出現(xiàn)死亡，死亡雞胚發(fā)育不良，通體有出血點，肝臟出血壞死，心肌有出血點、腎臟腫大，結(jié)果見圖3。

3? 討論

近年來隨著家禽養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖密度的增加，雞傳染性腺胃炎在雞群中不斷發(fā)生，特別是對肉雞產(chǎn)業(yè)影響較大，臨床癥狀主要表現(xiàn)為雞生長不良、消瘦、腸炎、腺胃腫大、腺胃乳頭水腫等[10]。該病上個世紀(jì)90年代首次在中國出現(xiàn)，隨后得到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[11]。該病不同病例的臨床癥狀、病理變化表現(xiàn)存在一定差異，且致病病因不明確，加之沒有有效的治療藥物，發(fā)病后給養(yǎng)雞場造成較大損失。目前，針對雞傳染性腺胃炎的致病原因較復(fù)雜，主要包括傳染性因素和非傳染性因素兩方面。傳染性因素主要是從發(fā)生腺胃炎的病例中分離到的病毒，如REV、ALV、MDV、CAV、GyV-3、IBV、C-REOV、IBDV、FAV、FPV等，非傳染性因素主要包括飼料營養(yǎng)不平衡、飼料霉變、生物胺等化合物[12]，但目前仍無法證明上述任何一種致病因素能對腺胃炎的發(fā)生起決定性作用。本研究根據(jù)發(fā)病雞臨床癥狀及病理剖檢特征進(jìn)行常見病原檢測，檢測結(jié)果顯示為REV和GyV-3的混合感染。已有研究報道，在發(fā)生腺胃炎的雞群中存在CAV和GyV-3的混合感染，雙重感染率為18.18%，另外研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病雞群中還存在CAV、ALV 和GyV-3的三重感染（感染率為7.07%）以及CAV、ALV、雞細(xì)小病毒和GyV-3的四重感染（感染率為1.34%）[13]，但目前還沒有關(guān)于REV和GyV-3混合感染的報道。目前，針對GyV-3已建立了熒光定量PCR和普通PCR檢測方法，但隨著GyV-3與其它病原混合感染的不斷發(fā)生，急需建立高通量的多病原混合感染的檢測方法，以更好地開展流行病學(xué)調(diào)查，進(jìn)一步了解GyV-3與其它病原之間的協(xié)同作用對雞群的影響。

本研究首次報道了雞場發(fā)生腺胃炎的病例中存在REV和GyV-3的混合感染。REV和GyV-3感染雞后都會產(chǎn)生免疫抑制，造成其它疾病疫苗的免疫失敗，降低雞群的抵抗力，進(jìn)而導(dǎo)致雞群多種病毒病和細(xì)菌病的發(fā)生。另外，發(fā)病雞在眼、鼻、喙部位出現(xiàn)潰瘍、出血、結(jié)痂，雖然癥狀與雞痘病毒感染類似，但本研究中并沒有檢測到雞痘病毒。因此，該雞場發(fā)病雞的臨床表現(xiàn)是否是REV和GyV-3協(xié)同作用的結(jié)果仍需進(jìn)一步深入的研究。針對雞傳染性腺胃炎，目前沒有特別有效的藥物用于治療。一方面， REV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，在復(fù)制過程中其基因組需要整合到宿主基因組中，因此由其制備的弱毒疫苗存在一定的生物安全風(fēng)險。另一方面，REV在體外培養(yǎng)較困難，病毒增殖慢，培養(yǎng)周期長，滴度低，所以滅活疫苗的研制存在較大困難。同樣，目前GyV-3也缺乏合適的體外增殖宿主，疫苗研發(fā)也存在較大困難。針對REV和GyV-3，目前沒有商品化的疫苗用于免疫預(yù)防。因此，該病應(yīng)以預(yù)防為主，養(yǎng)殖場應(yīng)加強日常管理，定期消毒，發(fā)現(xiàn)疑似病例立即隔離淘汰，保證雞群日糧品質(zhì)和營養(yǎng)均衡，提高雞群免疫力，避免傳染性因素和非傳染性因素等致病誘因的發(fā)生。另外，袁世玉[14]研究表明GyV-3可以跨物種感染哺乳動物小鼠，在小鼠之間水平傳播，并造成胃腸炎和貧血。因此，對GyV-3的研究和防控還具有潛在的公共衛(wèi)生意義。

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Laboratory Diagnosis of Mixed infection of Reticuloendotheliosis Virus and Gyrovirus in Broilers

HU Feng1， WU Leilei2， WU Jing1， LI Yufeng1*

（1.Poultry Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China; 2. Shandong Xintai Animal Husbandry and Veterinary Development Service Center， Xintai 271200， China）

Abstract： The 28-day-old commercial broilers showed signs of malaise， loss of appetite and slow growth in a farm in Heilongjiang province. The infected chickens showed ulceration in the eyes， nose and beak. The mainly pathological changes of the infected chickens were hemorrhage and swelling of the glandular stomach， swelling of the kidneys， hemorrhage and necrosis of the spleen， atrophy of the bursa of fabricius， enteritis， etc. The results of etiological diagnosis showed that there was a mixed infection of avian reticuloendotheliosis virus and gyrovirus 3 in the chicken farm. The laboratory diagnosis of this case provides part of the theoretical basis and effective reference for the prevention and control of poultry disease.

Keywords： reticuloendotheliosis virus; gyrovirus; mixed infection; laboratory diagnosis