一例豚鼠銅綠假單胞桿菌和馬鏈球菌獸疫亞種混合感染的診斷

余思義　項玉　金陶等

摘要：對一只突發(fā)死亡的寵物豚鼠進行病理學檢查、細菌分離培養(yǎng)及鑒定。結果表明，該豚鼠為銅綠假單胞桿菌和馬鏈球菌獸疫亞種的混合感染。豚鼠易攜帶人畜共患病病菌，人們在飼養(yǎng)應該重視人畜共患病，及時控制人畜共患病的傳播，防止其成為人類疾病傳染源。

關鍵詞：豚鼠；馬鏈球菌獸疫亞種；銅綠假單胞桿菌；混合感染

中圖分類號：S865.1+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4783-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.032

Abstract：In China， pets have become a growing industry with huge consumer groups. And， it is well known， humans are fond of getting long with pets. However， pets are most likely to become the source of animal-borne disease with a potential threat to human health. This study focus on one Guinea pig， as a pet， died suddenly within a few days. The pathological examnation， bacteria isolation and identification， and animal experiment were used to research it. Results indicated that this Guinea Pig was co-infected with streptococcus equi subsp. zooepidemicus and pseudomonas aeruginosa. To the best of our knowledge， humans should attend the zoonoses when feed Guinea Pig due to it is easily carrying zoonoses pathogen， and timely prevent the dissemination of pathogen which has a potential hazard to humans.

Key words： guinea pigs； Streptococcus equi subsp. zooepidemicus； Pseudomonas aeruginosa； co-infection

馬鏈球菌獸疫亞種，過去稱為獸疫鏈球菌，普遍存在于動物的黏膜，尤其是馬屬動物的皮膚、上呼吸道黏膜、扁桃體及生殖道等處，可致各種家畜的炎癥和敗血癥[1]。銅綠假單胞桿菌又稱銅綠假單胞菌，廣泛分布于土壤、水、空氣以及動物腸道和皮膚上，具有多種致病因子而且有強侵襲力，能廣泛侵襲機體各個器官組織，引起化膿性肺炎、子宮炎、肉芽腫和腸炎等各種病變和炎癥。能感染眾多哺乳動物、禽類和爬蟲類。其極易產(chǎn)生耐藥性且耐藥機制復雜[2-4]。

近年來，人們對于豚鼠的利用逐漸的多元化。作為試驗動物，用于疾病診斷、生物制品制備及科學研究；由于形象可愛，也成為寵物之一；又因其肉質美味，成為餐桌上的美食。豚鼠與人們的生活聯(lián)系日益密切，頻繁的出現(xiàn)在人類的生活中[5]。鼠類更易攜帶病原菌，其與人類接觸，容易導致人畜共患病的發(fā)生[6，7]，因此人們需要深入研究豚鼠容易攜帶的病菌以及病原的流行病學，有效預防及控制人畜共患病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料

TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基（均購于BD公司），無支原體胎牛血清（購于浙江天杭生物科技有限公司）；生化鑒定管（購于杭州微生物試劑有限公司）；蛋白酶K購自博能生物科技有限公司；核酸分子量標準物（購自寶生物工程大連有限公司），dNTP、 Mixes、TaqDNA Polymerase（購自Fermentas公司）；GoldView TM（購自莊盟公司）。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠發(fā)病狀況及病理學檢查 該病例為人工飼養(yǎng)的寵物豚鼠，品種名為荷蘭豬，飼養(yǎng)過程中發(fā)病死亡，詢問了解發(fā)病情況，對死亡豚鼠進行病理剖檢，觀察病理變化，并取眼瞼、心臟、肝臟、肺、大腦、小腦、胃、爪、腎、腸管、胰等組織器官備用。

1.2.2 病原菌的分離與培養(yǎng) 取眼瞼、心臟、肝臟、肺、腦組織，采用無菌操作方法，用接種環(huán)劃線接種在TSA血清平板和麥康凱平板上，置于37 ℃溫箱中，24～48 h后，觀察細菌生長情況。

挑取典型菌落傳代接種于TSA血清平板上，觀察細菌生長情況，并取典型的單個菌落做細菌涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察純培養(yǎng)菌的形態(tài)特征。

1.2.3 病原菌的生化試驗 將純化后的細菌按常規(guī)方法接種于側金盞花醇、賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對照、苯丙氨酸、半固體瓊脂、尿素、硫化氫、乳糖、馬尿酸鈉、木糖、棉子糖、葡萄糖、枸櫞酸鹽、葡磷胨水（M.R、V.P）、山梨醇、葡萄糖酸鹽生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察結果。

1.2.4 病原菌的16S rRNA序列測定及分析 設計并合成引物，上游引物R：5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，下游引物F：5'-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3'。

按常規(guī)方法將菌體接種于血清TSA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，用生理鹽水收集菌體，使用細菌基因組DNA提取試劑盒（上海天根生化科技有限公司），按說明書進行基因組DNA提取。

把提取的細菌基因組DNA作為模板，采用25 μL反應體系： Taq PCR Master Mix 12.5 μL、漂洗液pw 9.5 μL、DNA模板1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL。反應條件：95 ℃復性5 min；94 ℃復性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，取未純化的PCR產(chǎn)物送上海英駿生物科技有限公司測序。

1.2.5 分離菌對小鼠的致病性觀察 用滅菌生理鹽水配制分離菌的細菌濃度為2×109 CFU/mL菌懸液備用。

成年小鼠24只，經(jīng)血液檢查無細菌感染后，隨機分為3組，每組8只，試驗1組和2組分別經(jīng)腹腔和肌肉途徑注射2種分離菌菌懸液，每只0.5 mL。對照組經(jīng)相同的途徑接種0.5 mL滅菌生理鹽水。常規(guī)飼養(yǎng)管理。

感染后觀察記錄試驗小鼠的臨床癥狀、死亡時間和死亡數(shù)，對死亡的小鼠立即進行剖檢，取心、肝部位做細菌分離鑒定，觀察死亡小鼠的病理變化。

2 結果與分析

2.1 感染豚鼠的發(fā)病情況

某人工飼養(yǎng)寵物豚鼠在幾天之內出現(xiàn)精神沉郁癥狀，眼部有乳白色膿性分泌物，紅腫（圖1），迅速消瘦而死。

豚鼠死亡后剖檢可見心臟上有白色斑塊（圖2），肺臟呈暗紅色，表面可見紅色斑點，切面濕潤多汁（圖3），其他組織器官未見明顯異常。

對心肌等組織的病理學檢查顯示心肌可見壞死灶，心肌細胞核碎裂、溶解，心肌細胞間有炎性細胞浸潤（圖4），血管周圍間隙增寬，亦有炎性細胞浸潤，其間混有大量藍色細菌凝塊（圖5）；肺臟的肺泡壁增厚，血管擴張，有些肺泡腔內有大量紅細胞（圖6），有的肺泡腔內有巨噬細胞，肺臟血管周圍也可見炎性細胞浸潤（圖7）。眼瞼增厚，眼瞼組織內有大量以單核細胞、中性粒細胞為主的炎性細胞聚集（圖8、圖9）；其他器官組織未見異常變化。

2.2 病原菌的分離鑒定

采用常規(guī)細菌分離培養(yǎng)方法，從肝臟、心臟、眼瞼和腦組織中，分離到2株細菌，其中一株在TSA培養(yǎng)基上呈淺綠色熒光的圓形菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上生長迅速，呈乳白色的黏稠、凸起菌落，該菌經(jīng)染色鏡檢顯示為革蘭氏陰性桿菌。另一株在TSA培養(yǎng)基上為圓形，光滑濕潤，直徑約為0.5～1.0 mm的半透明菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，為革蘭氏陽性球菌。

2.3 病原菌的生化試驗

分離的革蘭氏陽性球菌對葡萄糖、乳糖、山梨醇、尿素、精氨酸、賴氨酸試驗陽性，甘露醇、枸櫞酸鹽、鳥氨酸、苯丙氨酸、丙二氨酸、甲基紅、靛青質、V-P試驗、產(chǎn)H2S、硝酸鹽還原試驗為陰性，可液化明膠。

分離的革蘭氏陰性桿菌對葡萄糖、甘露醇、枸櫞酸鹽、尿素、阿拉伯膠糖、氧化酶試驗陽性，對乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、菊糖、V-P試驗、MR試驗、產(chǎn)H2S試驗為陰性，可液化明膠。

2.4 病原菌的16SRNA的PCR鑒定結果

將提取的菌體DNA做PCR擴增，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后得到一段750 bp的核苷酸片段。測序結果用Blast分析與GenBank上的已知序列進行同源性比較，根據(jù)不同屬細菌16 S rRNA基因同源性為70%～90%，而同一種內不同株間基因同源性大于99%，確定分離的革蘭氏陰性桿菌為銅綠假單胞桿菌，革蘭氏陽性球菌為馬鏈球菌獸疫亞種。

2.5 分離菌對小鼠的致病性試驗結果

銅綠假單胞桿菌組小鼠在注射后第二天，腹腔注射和肌肉注射組均全部死亡，死亡小鼠心臟、肝臟、肺和腎臟均表現(xiàn)有淤血變化，未見其他異常變化。自心臟和肝臟分離到銅綠假單胞桿菌。

馬鏈球菌獸疫亞種組小鼠在注射后第三天，腹腔注射和肌肉注射組均全部死亡，死亡小鼠心臟、肝臟、肺和腎臟均表現(xiàn)有淤血變化，未見其他異常變化。從心臟和肝臟分離到馬鏈球菌獸疫亞種。

3 討論

本研究自死亡豚鼠體內分離到2種細菌，經(jīng)細菌分離純化、生化試驗及細菌的基因測序等系列鑒定，2種細菌為馬鏈球菌獸疫亞種和銅綠假單胞桿菌。從死亡豚鼠的臨床癥狀及病理特征來看，發(fā)病豚鼠有眼瞼的化膿性炎癥、壞死性心肌炎及肺臟的出血，與銅綠假單胞桿菌眼部感染的特征相符[8，9]。從動物試驗結果看，分離菌均可引起試驗小鼠死亡，綜上所述，可以判定該豚鼠為以上兩種菌的混合感染。

據(jù)文獻報道，在外觀健康的豚鼠的鼻腔和眼結膜可隱性攜帶馬鏈球菌獸疫亞種[10，11]。當動物采食粗飼料擦傷口腔黏膜或當鼻咽部的分泌物偶然嗆進氣管時，病菌趁機侵入體內，到達局部淋巴結引起感染。

銅綠假單胞桿菌廣泛分布于土壤、水、空氣以及動物腸道和皮膚上。以往通常以為該菌為致病力較弱的條件致病菌，但目前的研究均證實該菌能產(chǎn)生內毒素、致死毒素、腸毒素、溶血素、殺白細胞素及多種胞外酶等多種致病因子，具有強侵襲力，為完全致病菌[3，4]。

寵物在中國已經(jīng)成為一個日漸壯大的產(chǎn)業(yè)和龐大的群體。寵物與人類朝夕相處，最容易成為動物源性疾病的傳染源，各種病原菌通過寵物生理性的呼吸、唾液、脫落的上皮細胞及被毛、糞便以及病理表現(xiàn)如咳嗽、流鼻涕、嘔吐、腹瀉等直接或者間接的傳染給人類，尤其老人和兒童是最易感染的群體[12]，對人類健康造成潛在威脅。

改善寵物飼養(yǎng)管理條件，確保飼料和飲水清潔衛(wèi)生，保持圈舍的清潔和干燥，嚴格搞好動物糞尿、污物的無害化處理，對寵物進行定期預防接種疫苗等[13]。同時，也建議寵物飼養(yǎng)愛好者盡量避免飼養(yǎng)鼠類寵物，因為鼠類攜帶的人畜共患病病毒極多，而且易對人類健康造成極大的隱患，比如目前在美國甚為流行的猴痘（Monkeypox），鼠類就是其重要攜帶傳染源[14]。

參考文獻：

[1] 賀名葉，李潤成.馬鏈球菌獸疫亞種毒力因子研究進展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2013，28（3）：18-19.

[2] 趙 耘，杜昕波，李偉杰，等.袋鼠源銅綠假單胞菌分離鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報，2010，32（2）：139-140.

[3] 魏蕊蕊，張純萍，鄒 明，等.革蘭陰性菌對多粘菌素的耐藥性及其機制研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2013，34（2）：79-82.

[4] 楊海燕，王 穎，張傳美，等.貂源綠膿桿菌分離株的鑒定、血清學分型及藥敏試驗[J].動物醫(yī)學進展，2014，35（7）：127-131.

[5] 陳清華.豚鼠在生物醫(yī)學研究中的應用[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2009，24（2）：40-41.

[6] 李玉霞，劉宏遠，趙曉國，等.淺談人畜共患病與寵物飼養(yǎng)[J].山東畜牧獸醫(yī)，2006（2）：33-34.

[7] 秦 川.寵物和實驗動物[J].中國比較醫(yī)學雜志，2010，20（Z1）：38-42.

[8] 田克恭，隋麗華，遇秀玲，等.豚鼠獸疫鏈球菌感染[J].中國獸醫(yī)雜志，1996，22（6）：14.

[9] 王淑杰，姜成鋼，武嘉男，等.致病性馬獸疫鏈球菌的分離鑒定、生物學特性及其M-like基因的序列分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，2012，34（11）：878-881.

[10] 張 鈺，韋永芳.豚鼠肺炎鏈球菌感染和發(fā)病觀察[J].中山大學學報論叢，1997（1）：49-52.

[11] 張曉佩，李文楊，董曉寧.豚鼠的健康養(yǎng)殖技術[J].中國禽畜種業(yè)，2010（10）：74-76.

[12] 肖 敏，徐國民，郭小敏，等.寵物源性人畜共患病的防治[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2011（1）：26-28.

[13] 趙德明.新時期人畜共患病的公共衛(wèi)生意義[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報，2005，7（6）：7-9.

[14] JASON W S L，ANDREW S P， JAN M S ，et al.Household knowledge，attitudes and practices related to pet contact and associated zoonoses in Ontario，Canada[J]. BMC Public Health，2012，12：553.